霍孝平 杜春梅 董錫文 李玉婷 韓笑 王文宣

摘要 [目的]從北方寒地種植的農(nóng)作物根系土壤中分離遺傳性能穩(wěn)定、安全可靠、親和性好、高效解無機(jī)磷的真菌，為微生物磷肥的開發(fā)提供適于該地區(qū)優(yōu)良菌種。[方法]從北方寒地種植的農(nóng)作物水稻、玉米和大豆根系土壤中分離解無機(jī)磷的真菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定及解無機(jī)磷能力的測定。[結(jié)果]通過PVK平板初篩和NBRIP平板復(fù)篩法，從種植大豆和玉米的根系土壤分離得到2株解無機(jī)磷真菌。顯微觀察初步鑒定為青霉屬真菌。溶磷指數(shù)（SI）為2.65～2.80。采用鉬銻抗比色法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行解無機(jī)磷能力測定，在試驗(yàn)條件下青霉菌1和2發(fā)酵上清液中可溶性磷含量分別高達(dá)281.46和238.67 μg/mL。[結(jié)論]該試驗(yàn)得到2株解無機(jī)磷的青霉菌有望應(yīng)用于生物磷肥的開發(fā)、生物防治和鹽堿地的改良。

關(guān)鍵詞 黑土;青霉菌;分離鑒定;解磷能力;寒地

中圖分類號(hào) X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）17-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.001

Abstract [Objective]To isolate fungi with stable genetic properties，safety and reliability，good compatibility，and high efficiency in dissolving inorganic phosphorus from the root soil of crops grown in the northern cold regions，and to provide excellent strains suitable for the development of microbial phosphate fertilizers in this area.[Method]The fungi that dissolve inorganic phosphorus were separated from the root soils of crops of rice，corn and soybean grown in the northern cold regions，and the fungi were identified and the ability to dissolve inorganic phosphorus was determined.[Result]Two strains of inorganic phosphorus solubilizing fungi were isolated from the root soil of planting soybeans and corns by the methods of PVK plate primary screening and NBRIP plate secondary screening.Microscopic observation was preliminarily identified as Penicillium fungus.The phosphate index （SI） was 2.65-2.80.The molybdenum-antimony anti-colorimetric method was used to determine the ability of the fermentation broth to dissolve inorganic phosphorus.Under the test conditions，the soluble phosphorus content in the fermentation supernatant of Penicillium 1 and 2 was 281.46 and 238.67 μg/mL，respectively.[Conclusion]The experiment obtained 2 strains of Penicillium which can dissolve inorganic phosphorus and is expected to be used in the development of biological phosphate fertilizer，biological control and improvement of saline-alkali soil.

Key words Black soil;Penicillium;Isolation and identification;Phosphate-solubilizing;Cold region

磷是植物生長發(fā)育必需的主要營養(yǎng)元素之一，又是植物體內(nèi)有機(jī)化合物的重要組成成分，參與光合作用、生物氧化、營養(yǎng)吸收和細(xì)胞分裂等重要代謝途徑，對(duì)農(nóng)作物的生長和產(chǎn)量具有直接影響[1-4]。土壤中通常含有1.32×10-2%～ 15.50×10-2% 磷和不溶性磷酸鹽，占地球上總磷含量的95%～99%[5]，由于磷的溶解度低、化學(xué)固定和復(fù)合螯合作用造成磷的遷移率低，不能直接供植物或微生物利用[6]。在我國，土壤中約95% 的磷是頑固性磷，傳統(tǒng)上通過添加磷肥來克服。然而，重復(fù)而不當(dāng)?shù)厥┯没瘜W(xué)磷肥其成本是昂貴的，并可通過干擾微生物多樣性和降低作物產(chǎn)量而導(dǎo)致土壤肥力的喪失[7]。微生物積極參與土壤磷的礦化、溶解和轉(zhuǎn)化等生物地球化學(xué)過程[8]。國內(nèi)外大量的研究表明，土壤中存在許多能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用狀態(tài)的解磷菌或溶磷菌（phosphate solubilizing microorganisms，PSM），包括細(xì)菌、放線菌和真菌[9-10]。它們不僅產(chǎn)生有機(jī)酸，還通過分泌吲哚乙酸和鐵氧體來促進(jìn)植物生長[11]。解磷真菌（phosphate solubilizing fungi，PSF）種類和數(shù)量都少于解磷細(xì)菌，但傳代培養(yǎng)后遺傳性狀更穩(wěn)定，解磷能力明顯優(yōu)于解磷細(xì)菌和放線菌;此外，PSF被觀察到比細(xì)菌分泌更多的有機(jī)酸，顯示出更大的溶磷活性[12]。由于溶磷真菌在促進(jìn)肥料中磷的釋放方面具有巨大的潛力，倍受人們的關(guān)注。該研究擬從北方寒地種植的農(nóng)作物水稻、玉米和大豆根系土壤中分離解無機(jī)磷的真菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定及解無機(jī)磷能力的測定，篩選出遺傳性能穩(wěn)定、安全可靠、高效解無機(jī)磷的真菌，為適于該地區(qū)微生物磷肥的開發(fā)提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源。土壤樣品采自黑龍江寒地生長狀態(tài)良好的大豆、玉米和水稻根系土壤，去除植物根系表層土壤，用無菌鏟采集5 ～ 15 cm深的根系土壤，每個(gè)樣點(diǎn)2份土樣，裝于有編號(hào)的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室。將樣品分成兩部分，一部分進(jìn)行風(fēng)干處理，用于土壤pH、電導(dǎo)率的測定，另一部分放在冰箱中作新鮮樣品，用于解磷真菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基。PVK培養(yǎng)基[13]、NBRIP培養(yǎng)基[14]、PDA培養(yǎng)基、磷礦粉培養(yǎng)基（NBRIP培養(yǎng)基中磷源改成磷礦粉）。上述固體培養(yǎng)基加入1.8% 或2.5% （磷礦粉培養(yǎng)基）瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 主要試劑。鉬銻抗貯存溶液，1.5%鉬銻抗顯色劑（現(xiàn)用現(xiàn)配），5 mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.2% 2，4-二硝基酚指示劑。

1.1.4 儀器。GZX-9076M型烘箱，LDZX-75KYS型立式壓力滅菌鍋，GZX-150B型光照培養(yǎng)箱，BS-2F型振蕩培養(yǎng)箱，SW-CJ-2DF型雙人超凈工作臺(tái)，722型分光光度計(jì)，PHS-2C型數(shù)顯酸度計(jì)，DDS-LLA型數(shù)顯電導(dǎo)率儀，生物顯微鏡，移液槍。

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測定。

采用烘干法測定土壤的絕對(duì)含水量，以土壤中所含水分重量占烘干土重的百分?jǐn)?shù)表示。計(jì)算公式：土壤含水量=（原土重-烘干土重）/烘干土重×100%=水重/烘干土重×100%[15];將土樣按土水比為1∶2.5浸提，用PHS-2C型數(shù)顯酸度計(jì)測量土壤pH;將土樣按土水比為1∶5浸提，用DDS-LLA型數(shù)顯電導(dǎo)率儀測定土壤的電導(dǎo)率（EC）[16]。

1.2.2 解無機(jī)磷真菌的篩選與保藏。稱取10 g新鮮土樣，放入90 mL裝有玻璃珠的無菌水中，25 ℃ 振蕩30 min，使土樣充分打散，按10倍稀釋法制成10-1～10-3的土壤稀釋液。吸取0.1 mL稀釋液涂布于PVK初篩培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng)，直至長出真菌菌落。

挑取產(chǎn)生褪色圈或透明圈的菌絲劃線接種到NBRIP復(fù)篩平板上，反復(fù)純化多次，挑取溶磷圈較大的菌落轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng)，直至菌絲體長滿試管并生孢。向已生孢的PDA斜面培養(yǎng)基中加入適量無菌的生理鹽水，振蕩洗脫，離心沉淀，沉淀的孢子加入30% 無菌的甘油，混勻后于-20 ℃ 冰箱保存待用。

1.2.3 菌絲體外觀特征及顯微觀察。取2 μL 孢子懸液（106 個(gè)孢子），滴加到PVK、NBRIP、PDA平板的中央，同時(shí)用鑷子夾取滅菌的蓋玻片，以傾斜45° 插入培養(yǎng)2 d 后的接種平板，每板插入3個(gè)蓋玻片。每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，其中3個(gè)重復(fù)觀察菌絲體生長狀況，3個(gè)重復(fù)插片用于顯微觀察，28 ℃ 培養(yǎng)5 d。觀察菌絲組織外觀特征，包括菌絲密度、長勢、孢子顏色和產(chǎn)色素情況等。用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑和溶磷圈（或褪色圈）直徑，計(jì)算菌絲平均日長速（cm/d）和磷酸鹽溶磷指數(shù)（SI），SI=（菌落直徑+溶磷圈直徑）/菌落直徑。

取出爬有菌絲的蓋玻片，置于10 × 40倍顯微鏡下觀察記錄菌絲和孢子形態(tài)特征，用顯微測微尺測量孢子大小。

1.2.4 真菌解無機(jī)磷能力的測定。

取1 mL 真菌孢子轉(zhuǎn)接于100 mL NBRIP和磷礦粉液體培養(yǎng)基中，28 ℃、140 r/min搖床培養(yǎng)10 d，同時(shí)以不接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，重復(fù)3次。取3 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min，鉬銻抗比色法[17]測定上清液中可溶性磷含量，數(shù)顯酸度計(jì)測量pH。

1.3 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣地信息及理化性質(zhì)

土壤是生態(tài)系統(tǒng)的一部分，其中含有大量的微生物，微生物是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)，寒地黑土的理化性質(zhì)也會(huì)影響土壤微生物的生長。由表1可知，種植大豆和玉米的旱地采樣點(diǎn)含水量分別為12.99%和12.87%，pH分別為5.86 和5.52，有利于解無機(jī)磷真菌的生長，但是取樣地區(qū)土壤出現(xiàn)了不同程度的酸化現(xiàn)象，不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的進(jìn)行;2個(gè)樣地土壤的電導(dǎo)率約為30 μS/cm。

2.2 解無機(jī)磷真菌的分離篩選

加了溴酚藍(lán)的PVK培養(yǎng)基是一種基于視覺觀察的快速評(píng)價(jià)磷酸鹽溶解水平的檢測方法[18-19]，利用該培養(yǎng)基從寒地黑土中篩選解無機(jī)磷真菌，并用NBRIP固體培養(yǎng)基復(fù)篩，得到2 株具有溶磷圈的解無機(jī)磷能力的青霉菌株。青霉菌1來自大豆根系土壤，青霉菌2來自玉米根系土壤（表1）。由圖1和表2可知，青霉菌1和2在PVK平板上均出現(xiàn)黃色的褪色圈，溶磷指數(shù)分別為2.75和2.73;在NBRIP平板上均產(chǎn)生透明的溶磷圈，青霉菌1和2的溶磷指數(shù)分別為2.80 和2.65。試驗(yàn)結(jié)果表明，用PVK和NBRIP培養(yǎng)基均能很好地反映解磷真菌的解磷能力。

2.3 解無機(jī)磷真菌的菌落形態(tài)與顯微結(jié)構(gòu)鑒定 從圖1可以看出，106 個(gè)真菌孢子懸液滴加到培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng) 5 d后，青霉菌1 在PVK和NBRIP平板上菌絲不擴(kuò)散生長，白色，生孢較快，初為橘色，后變成綠色，平均日長速分別為0.62 和0.45 cm/d;在PDA平板上菌絲擴(kuò)散生長，產(chǎn)長勢最快（日長速0.82 cm/d）。青霉菌2 在PVK、NBRIP和PDA平板上菌絲不擴(kuò)散生長，菌絲由白轉(zhuǎn)鴨黃色，生孢較慢，菌絲上有少量綠色孢子，日長速分別為 0.89、0.63和0.46 cm/d。2種菌在磷礦粉平板上長勢最慢，也未出現(xiàn)溶磷現(xiàn)象。由此可見，解無機(jī)磷真菌在不同培養(yǎng)基上的菌落生長狀態(tài)不同，其解無機(jī)磷的能力和長勢存在一定的關(guān)系并隨環(huán)境條件的改變而改變。

圖2表示青霉菌1和2均在400×鏡下的顯微照片。青霉菌1和2營養(yǎng)菌絲分支、有橫隔，氣生菌絲形成分生孢子梗，分生孢子梗經(jīng)過多次分枝，產(chǎn)生幾輪對(duì)稱或不對(duì)稱的帚狀體，青霉菌1帚狀體較長，青霉菌2帚狀體短粗;產(chǎn)生不同程度綠色圓形的分生孢子，大小分別為2.125和2.725 μm。由顯微結(jié)構(gòu)可以初步鑒定青霉菌1和2均屬于青霉屬。

2.4 解無機(jī)磷真菌解磷能力測定

對(duì)復(fù)篩純化的青霉菌1和2進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其解磷能力及pH 變化，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，在NBRIP液體培養(yǎng)基中連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)10 d，青霉菌1和2解磷能力隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈先升后降的趨勢，分別在第6天和第8天時(shí)解磷能力最高，發(fā)酵上清液中可溶性磷含量分別達(dá)281.46和238.67 μg/mL。與初始pH 6.0相比，2種青霉菌發(fā)酵液pH都是下降趨勢，pH均在5以下。在磷礦粉液體培養(yǎng)基中連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)10 d，青霉菌1和2解磷能力微乎其微。在發(fā)酵培養(yǎng)第2天，發(fā)酵液的pH就有顯著的下降，最低達(dá)到2左右。

3 討論

根系有益植物-微生物相互作用是植物健康和土壤肥力的決定因素。青霉菌和曲霉是根系主要的解磷絲狀真菌。為了篩選出適合三江平原寒地土壤理化性質(zhì)及環(huán)境條件，具有種屬專一性、多功能的解磷菌，該研究從種植大豆、玉米和水稻的根系取樣，從中分離得到2株遺傳穩(wěn)定的青霉屬真菌，固體平板溶磷指數(shù)約2.7 左右，與Elias等[20]的研究結(jié)果一致;液體發(fā)酵可溶性磷含量約280 μg/mL，比Zheng等[8]從黑龍江省海倫市農(nóng)田土壤分離的解磷細(xì)菌的最高溶磷能力高2倍。據(jù)報(bào)道，溶磷菌的溶磷能力通常與培養(yǎng)中酸化生長介質(zhì)和釋放低分子量有機(jī)陰離子的能力有關(guān)，有機(jī)酸可以通過羥基和羧基競爭性地螯合與磷結(jié)合的陽離子，并將其轉(zhuǎn)化為可溶性形式[21]。該采樣地pH在5.5 ～ 5.8，發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH從初始6.0降至4.5左右，有利于解磷真菌的生存與發(fā)揮溶磷作用。解磷真菌磷釋放能力不僅取決于微生物的遺傳特征，還受到環(huán)境條件影響，如培養(yǎng)基的碳氮源的種類和比例、微生物群落的互作等。

Kucey[22] 研究表明，與溶磷細(xì)菌相比，溶磷真菌即使在實(shí)驗(yàn)室條件下反復(fù)傳代培養(yǎng)仍具有溶磷活性。此外，這些真菌具有很強(qiáng)的競爭能力，對(duì)重金屬、化學(xué)物質(zhì)、殺菌劑和溫度具有較強(qiáng)的耐受性，在土壤中更容易定植和遷移。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，分離得到的2株青霉菌與高溶磷的細(xì)菌[23]具有很好的協(xié)同作用和一定的纖維素降解能力。

4 結(jié)論

該研究利用PVK和NBRIP瓊脂平板法，從東北寒地黑土分離得到2株解無機(jī)磷的青霉屬真菌。在試驗(yàn)條件下發(fā)酵上清液可溶性磷最高含量分別為281.46和238.67 μg/mL，與初始pH 6.0相比，發(fā)酵液的pH均呈下降趨勢。該研究結(jié)果表明，東北寒地黑土農(nóng)田三大類作物玉米、大豆和水稻的根系土壤能夠使自然發(fā)生的潛在溶磷真菌生存，均能在PVK和NBRIP培養(yǎng)基中激活磷酸三鈣。由此可見，該試驗(yàn)得到的與植物伴生的溶磷真菌可能成為潛在的生物肥料。

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