重慶煙區(qū)硅酸鹽細菌的分離鑒定及生理生化特性

楊笑笑　李振輪　王晗　李娜

摘要：采用土壤稀釋平板法從重慶市彭水縣的植煙土壤樣品中分離出8株具有解鉀能力的細菌，通過測定其對含鉀礦石中有效鉀的釋放能力，篩選出兩株具有較強的解鉀能力的硅酸鹽細菌，運用分子生物學(xué)方法對這兩株硅酸鹽細菌的16～23S rDNA序列進行擴增并鑒定。結(jié)果表明，一株細菌屬于膠質(zhì)類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus），另一株細菌屬于短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis），并且研究了這兩株細菌的生理生化特性。

關(guān)鍵詞：硅酸鹽細菌；分離鑒定；生理生化特性；重慶煙區(qū)

中圖分類號：Q939.96 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1013-04

土壤是一個天然鉀庫，每公頃土壤耕層含鉀量約為26.1 t，而90%～98%以上的鉀素存在于鉀長石和云母等富含硅酸鹽的礦物中，其中的鉀素多以緩效態(tài)存在，不能直接被農(nóng)作物利用，能被植物吸收利用的可溶性速效鉀含量約占農(nóng)作物總需求量的5%和土壤總鉀量的0.1%～0.2% [1]。因此，我國土壤既富含鉀又缺鉀，總體呈現(xiàn)出可溶性速效鉀素缺乏的現(xiàn)象。有關(guān)資料顯示，中國的鉀肥產(chǎn)量占世界的0.34%，而消耗量占14.7%，可見我國鉀素資源短缺，多依賴于進口[2]。以多種形式補充土壤中的可溶性速效鉀素，科學(xué)合理施用鉀肥已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要技術(shù)措施之一[3]。發(fā)掘土壤中具有解鉀能力的微生物，將其應(yīng)用于可溶性速效鉀素的釋放，提高土壤中可利用鉀素的含量，是近些年鉀肥研究領(lǐng)域的熱點。相關(guān)報道表明，解鉀細菌多是硅酸鹽細菌，它能夠分解硅酸鹽類礦物并協(xié)同釋放出鉀等元素供植物利用，將土壤礦物中緩效態(tài)鉀素轉(zhuǎn)化為可溶性速效鉀素，兼具固氮、解磷功能[4]，并且該類細菌對營養(yǎng)成分要求不高，廣泛分布于土壤中，是一種良好的功能菌[5]。因此，在化學(xué)鉀肥供應(yīng)不足的大環(huán)境下，以解鉀菌的相關(guān)研究為基礎(chǔ)，研發(fā)出效果好、成本低且環(huán)境友好的微生物肥料，進一步挖掘土壤中的鉀素資源，具有重要的科學(xué)和實際意義。

近年來，對硅酸鹽細菌解鉀的研究，大致集中于4個方面[6] ： 一是解鉀的效果研究；二是解鉀的條件，包括土壤條件和環(huán)境條件的研究；三是解鉀的機理研究；四是實際投入運用研究。硅酸鹽細菌解鉀的效果研究處于首要地位，即篩選出一些解鉀能力較強的菌株，目前國內(nèi)外的研究大都處于這一階段。

我國西南地區(qū)是重要的農(nóng)作物及經(jīng)濟作物產(chǎn)地，其地理位置、生態(tài)環(huán)境和土壤條件具有特殊性，土壤中礦物鉀的含量豐富，但是可供植物直接利用的可溶性鉀含量較低。本試驗主要從重慶彭水縣植煙區(qū)缺鉀土壤中分離一些硅酸鹽細菌，并對其中具有較高解鉀能力的菌株進行分類鑒定，可為利用硅酸鹽細菌增加重慶植煙區(qū)缺鉀土壤中有效鉀的含量提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品采自重慶市彭水縣植煙區(qū)。風(fēng)干，過1 mm篩備用。

鉀長石粉：經(jīng)0.1 mol/L NH4Cl溶液清洗，陰干備用[7]。

白云母粉：過1 mm篩，陰干備用。

1.2 培養(yǎng)基

缺鉀培養(yǎng)基A：蔗糖5.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO3 1.0 g， Na2HPO4 2.0 g，F(xiàn)eCl3 0.005 g，鉀長石粉 1.0 g，去離子水1 L[8]。

缺鉀培養(yǎng)基B：蔗糖5.0 g，Na2HPO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，鉀長石粉或白云母粉1.0 g，F(xiàn)eCl3 溶液數(shù)滴，去離子水 1 L，瓊脂 20 g[9]。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 4.0 g，蛋白胨 10.0 g，去離子水1 L，pH 7.2～7.5。

無氮培養(yǎng)基：蔗糖 10.0 g，K2HPO2 2.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.5 g， CaCO3 0.5 g， 酵母膏 0.5 g，去離子水1 L，瓊脂 15.0 g，pH 7.4[10]。

1.3 方法

1.3.1 解鉀菌篩選與培養(yǎng)

1）土壤樣品稀釋。在無菌操作下稱取10.0 g土壤樣品，加入到含玻璃珠及90 mL無菌水的三角瓶中。置于搖床以200 r/min充分振蕩30 min，即配制成10-1土壤稀釋液。用無菌槍頭吸取5.0 mL上述稀釋液，加入到含45 mL無菌水的三角瓶中，混勻成10-2土壤稀釋液。這樣依次稀釋，得到10-3土壤稀釋液（每個稀釋度須更換無菌槍頭）。

2）推板篩選。選取10-2以及10-3稀釋度的土壤稀釋液，分別吸取200 ？滋L加入到缺鉀培養(yǎng)基A中，進行平板涂抹，涂抹均勻后30 ℃培養(yǎng)3 d左右。挑取邊緣整齊、濕潤、黏稠、無色透明、富有彈性的菌落[10]，劃線純化。

挑取純化后的單菌落加入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃，160 r/min搖瓶擴大培養(yǎng)，分裝添加適量甘油后低溫保存。

1.3.2 解鉀能力的測定 每250 mL三角瓶中加50 mL缺鉀培養(yǎng)基B，添加不同類型的礦物（鉀長石粉、白云母粉），121 ℃，20 min滅菌。加入3 mL菌懸液（OD600nm=1.0），分別設(shè)置20、25、30、35 ℃ 4個溫度梯度， 3次重復(fù)，160 r/min搖床培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后取培養(yǎng)液用60 g/L稀H2O2消煮，過濾定容。采用火焰光度法測定速效鉀的含量[11]。

1.3.3 細菌鑒定 根據(jù)解鉀能力測定結(jié)果，選取解鉀能力較好的細菌進行DNA序列擴增。采用細菌16～23S rDNA通用引物 16～23S（1）（5′- TTGT

ACACACCGCCCGTC-3′）， 16～23S（2）（5′-CCTTTCC

CTCACGGTACTG-3′），配置25 μL PCR反應(yīng)體系：包括1×PCR緩沖液，0.625 U Taq酶，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs， 0.4 μmol/L primer1， 0.4 μmol/L primer2，50～100ng /μL DNA模板稀釋液。PCR擴增程序為95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取10 μL PCR擴增產(chǎn)物，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物割膠回收，經(jīng)TA克隆后送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行測序。

1.3.4 生理生化特性測定 采用革蘭氏染色法，并以無氮培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，進行葡萄糖、明膠等生理生化特性測定和一些生物學(xué)特性測定，具體方法參見《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 解鉀菌篩選結(jié)果

經(jīng)過土壤樣品稀釋涂平板，在分離培養(yǎng)基的平板上可觀察到圓形、表面光滑且透明、凸起、有彈性的菌落，培養(yǎng)3～5 d后菌落直徑約為7～9 mm。由于多數(shù)的解鉀菌在具有解鉀能力的同時具有固氮能力，所以在菌株的選擇上，以能否產(chǎn)莢膜作為一個篩選條件 [4] 。挑取符合上述形態(tài)的菌株在無氮培養(yǎng)基上進行劃線純化，然后通過莢膜染色，選擇有莢膜的菌株，分別命名為K1～K8。

2.2 解鉀菌K1～K8對鉀長石和白云母的解鉀作用

將解鉀細菌k1～k8接種于缺鉀液體培養(yǎng)基B（分別含鉀長石和白云母），分別置于20、25、30、35 ℃搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d，測定其速效鉀的含量，結(jié)果見圖1和圖2。由圖1可知，K2與其他菌株相比，在20、30 ℃條件下解鉀能力最強，速效鉀的含量分別比對照增加了近80%和100%，且K2在20 ℃條件下解鉀能力強于其他溫度。由圖2可知，在20 ℃條件下K6解鉀能力強于其他溫度，且其在20、30、35 ℃條件下的解鉀能力強于其他菌株，速效鉀的含量分別比對照增加了133%、100%、125%。同時，由圖2可知，K2在25 ℃條件下對白云母粉的解鉀能力強于其他溫度，這與圖1中K2對鉀長石粉的解鉀能力隨溫度的變化不同。圖1與圖2相比較可知，細菌K1～K8對白云母粉的解鉀能力均高于對鉀長石粉的解鉀能力。

2.3 解鉀細菌的分子生物學(xué)鑒定及生理生化特性

2.3.1 菌株K2和K6的鑒定結(jié)果 對解鉀能力較強的細菌K2和K6進行分子生物學(xué)鑒定。PCR擴增結(jié)果表明，K2擴增出長約1 000 bp DNA片段，K6擴增出長約900 bp DNA片段（圖3）。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道的菌種進行BLAST比對，結(jié)果顯示K2與短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis NBRC 100599 DHA）（登錄號：AP008955.1）相似度達99%，K6與膠質(zhì)類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus K02）（登錄號：CP003422.1）相似度達99%。可據(jù)此判定K2屬于短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis），K6屬于膠質(zhì)類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）。

2.3.2 生理生化特性 K2生理生化特性符合短芽孢桿菌屬（Brevibacillus Shida）的特性，K6的生理生化特性也符合芽孢桿菌屬（Bacillus Cohn）的特性（表1），即從生理生化的角度對分子生物學(xué)鑒定結(jié)果進行了驗證。

3 討論

近年來，硅酸鹽細菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中潛在的應(yīng)用前景逐漸為人們所了解，并將應(yīng)用到微生物肥料中，表明硅酸鹽細菌具有良好的發(fā)展前景。

蔣先軍等[13]認為，硅酸鹽細菌的增產(chǎn)作用不應(yīng)只從它能分解硅酸鹽礦物釋放出鉀來考慮，還應(yīng)考慮到硅酸鹽細菌作為一種根際微生物在植物微生物系統(tǒng)中的作用及自身產(chǎn)生的各種作用，如影響植物營養(yǎng)的有效吸收和植物病原物的活動，以及代謝產(chǎn)物對植株生長的影響等。同時，王思遠[14]研究表明，硅酸鹽細菌能明顯地促進土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，促進煙株對養(yǎng)分的吸收利用和生長發(fā)育，配合一定量的氮、磷、鉀化肥施用效果更好，能明顯地促進煙株的生長發(fā)育。盛下放等[15]研究表明，硅酸鹽菌劑不僅可以促進棉花生長，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，而且可以降低生產(chǎn)成本，保護生態(tài)環(huán)境。因此，從生態(tài)角度上，開發(fā)以具有解鉀能力的細菌為主要成分的生物鉀肥應(yīng)用前景廣闊。

本試驗通過對8株細菌進行解鉀能力的測定，發(fā)現(xiàn)有兩株細菌的解鉀能力較好。但是， K2細菌25 ℃條件下對鉀長石粉的解鉀作用不及20 ℃和30 ℃，這是本試驗存在的一個重要問題，可能是由于消煮不徹底，導(dǎo)致很大的誤差產(chǎn)生。

同時，本試驗證實了8株細菌對白云母的釋鉀能力均高于鉀長石，這可能與礦物結(jié)構(gòu)有關(guān)，鉀長石是架狀結(jié)構(gòu)的硅酸鹽礦物，而白云母則是層狀結(jié)構(gòu)的硅酸鹽礦物，細菌較易于從云母類礦物中獲得速效鉀。連賓等[16]研究表明，對架狀結(jié)構(gòu)的硅酸鹽礦物而言，硅酸鹽細菌主要通過形成細菌-礦物復(fù)合體并由此產(chǎn)生細菌對礦物表面的溶蝕作用，隨之礦物顆粒晶格逐漸發(fā)生變形或崩解，硅酸鹽細菌對礦物鉀的主動吸收作用，其代謝產(chǎn)物等化學(xué)因子對礦物顆粒有化學(xué)降解作用等幾種途徑來實施對礦物的解鉀作用，而對層狀結(jié)構(gòu)的含鉀礦物而言，硅酸鹽細菌還可以通過擴大其層間的距離來促進其中鉀離子的釋放。這為進一步研究細菌與礦物作用的機理提供了理論依據(jù)。

何琳燕等[17]認為生物鉀肥功能的有效發(fā)揮必須滿足兩個基本條件：一是菌株的高效性，二是菌株本身對土壤環(huán)境的適應(yīng)性。在將生物鉀肥施用在土壤中之前，必須保證該生物鉀肥有良好的解鉀能力。但是，盛下放等[18]研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)類芽孢桿菌中有明顯的解鉀溶磷作用的只占15%～29%。因此，從我國豐富的膠質(zhì)類芽孢桿菌資源中篩選出解鉀能力較強的膠質(zhì)類芽孢桿菌具有重要的理論與實用價值。根據(jù)試驗結(jié)果，本研究中所篩選的短短芽孢桿菌和膠質(zhì)類芽孢桿菌菌株有一定的解鉀能力，具備了制作生物鉀肥的前提條件，為進一步研究生物鉀肥對土壤環(huán)境的適應(yīng)性打下了基礎(chǔ)。

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