汪艷平 韋正 蔣利榮 張鵬 陳海林 符益山 覃擁靈

摘要 [目的]運用網絡藥理學反向分子對接的原理，對山豆根抑癌作用機制進行預測。[方法]篩選山豆根化學成分25個，通過PharmMapper數據庫查找相關靶點，NCBI數據庫進行靶點的校正，利用DAVID數據庫篩選藥物的KEGG通路，運用cytoscape建立山豆根的“藥材-化學成分-靶點-作用通路-藥理作用-臨床應用”多層次作用網絡圖。[結果]山豆根的25個化學成分可調控CTBP2、CDKN1B、ABL1等51個靶點，得到相關通路25條，涉及癌癥、炎癥、肝病、心血管病等疾病，其中10條通路與癌癥相關。[結論]通過網絡藥理學的分析方法，預測了山豆根的抗癌作用機制，為深入研究山豆根的藥理作用提供方向。

關鍵詞 山豆根;網絡藥理學;抗癌;作用通路

中圖分類號 R285 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）17-0165-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.044

Abstract [Objective] To predict the antitumor mechanism of Sophora tonkinensis by using the principle of reverse molecular docking in network pharmacology.[Method]25 chemical constituents of Sophora tonkinensis were screened， and the related targets were searched through the pharmapper database， the targets were adjusted by NCBI database， the KEGG pathway of drugs was screened by DAVID database， and the multi-level action network diagram of “medicinal materials-chemical composition-target-action pathway-pharmacological action-clinical application” was established by using Cytoscape.[Result]The 25 chemical components of Sophora tonkinensis could regulate 51 targets such as CTBP2， CDKN1B and ABL1， and 25 related pathways were obtained， involving cancer， inflammation， liver disease， cardiovascular disease and other diseases.Ten of them are related to cancer.[Conclusion]The anti-cancer mechanism of Sophora tonkinensis is predicted by network pharmacology analysis method， which provides direction for further study on pharmacological action of Sophora tonkinensis.

Key words Sophora tonkinensis;Network pharmacology;Anti-cancer;Action pathway

山豆根是豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep）的根，又名苦豆根（《中藥材手冊》）、廣豆根、小黃連、三小葉山豆根、胡豆蓮、柔枝槐等，《經驗方》中記載其為黃結[1]。山豆根主要化學成分有苦參堿、氧化苦參堿、金雀花堿和甲基金雀花堿等生物堿;山豆根色滿二氫黃酮、槲皮素、蘆丁等黃酮類;羽扇豆醇、槐花二醇等三萜類和小分子酚性及其他化學成分，如麥芽酚、大黃素、β-谷甾醇、三葉豆紫檀苷等。2015年版《中華人民共和國藥典》中對山豆根記載是“有豆腥氣，味極苦，性寒，歸肺、胃經”。《本草圖經》中記載山豆根含服可治咽喉腫痛;《本草綱目》曰：“清肺熱，除痰咳”。現代藥理研究表明，山豆根主要有抑癌、抑菌、抗炎、抗病毒、抗心律失常等藥理活性[2-3]。

山豆根的抗腫瘤作用越來越受到人們的關注。據報道山豆根多糖對腫瘤有一定的抑制作用[4]。山豆根生物堿中含量較高的苦參堿和氧化苦參堿在誘導腫瘤細胞分化、促進腫瘤細胞凋亡以及對分化和凋亡基因的調控上表現出一定的作用[5]，苦參堿與H22-TIM2瘤苗聯用對小鼠體內移植瘤的抑制效果比單用更加明顯[6]。山豆根中金雀異黃素、槐屬二氫黃酮G、槲皮素、山豆根酮等12種黃酮對人腫瘤細胞株均有不同程度的抑制作用，二氫黃酮和黃酮醇是抗腫瘤作用的主要黃酮類型[7]。臨床中已有用山豆根治療癌癥的成功案例，國醫(yī)大師李濟仁就有用山豆根、魚腦石、射干、茜草等等10種藥材治療鼻咽癌的經典良方[8]。中醫(yī)認為，肺熱痰火及肝膽熱毒上擾為鼻咽癌發(fā)病主要原因，對痰濁凝聚型和火熱內困型鼻咽癌采用含山豆根的藥方進行治療[9]。中醫(yī)研究院廣安門醫(yī)院用山豆根、草河車、夏枯草自制生藥片，結合外用藥治療宮頸癌效果顯著。

網絡藥理學通過構建藥物分子-靶點生物網絡、分子-分子生物網絡、靶點-靶點生物網絡、疾病-疾病生物網絡、藥物分子-靶點-疾病生物網絡等，分析藥物、靶點、疾病三者在網絡中的聯系，研究思路與中醫(yī)藥研究理念、特性以及方劑原則存在一定的共性[10]。通過網絡挖掘關鍵節(jié)點研究中藥“多成分、多靶點”的特點與中醫(yī)辨證論治的理念相符，已越來越多地應用到中藥作用機制和中藥有效成分的篩選研究[11-12]。筆者以山豆根為研究對象，基于網絡藥理學方法探討山豆根的藥效成分及其潛在作用靶點，并建立“藥材-化學成分-靶點-作用通路-藥理作用-臨床應用”的網絡關系模型，通過網絡分析認識山豆根的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 化合物信息

前期建立了不同產地山豆根藥材指紋圖譜，并采用高效液相色譜-飛行時間質譜聯用技術對山豆根中的化學成分進行定性分析，鑒定出化學成分47個，結合文獻報道，選取25個活性成分，包括苦參堿、氧化苦參堿、N-甲基金雀花堿、金雀花堿、臭豆堿、槐胺、槐定堿、5α-羥基槐果堿、8-甲雷杜辛、槲皮素、芒柄花素、山豆根色滿查耳酮A、山豆根色滿查耳酮B、山豆根色滿查耳酮C、山豆根色滿二氫黃酮A、山豆根色滿二氫黃酮C、山豆根色滿二氫黃酮D、水仙苷、β-谷甾醇、大黃素、大黃素甲醚、番石榴酸乙酯、麥芽酚、槐花二醇、三葉豆紫檀苷[13]。

1.2 搜尋其潛在的藥物靶標

首先，應用ChemBioDraw Ultra 12.0軟件畫出該化學成分的二維結構式，以.mol格式保存，再通過應用ChemBio3D Ultra 12.0軟件將該化學成分的二維結構式轉換為三維立體結構圖，并對其立體結構進行優(yōu)化，另存為.mol2格式的文件。在PharmMapper（包含7 000余個重要靶標結構的信息和藥效團模型，涵蓋了349種生物功能和110種臨床適應癥）中導入.mol2格式的文件，庫中各數值均設成100，選物種為人類，得到一個ID號，將ID號輸入“get result”，進行Results Downloading，生成Excel，篩選出fit值大于4.5或者前20個的Target Name，得每種分子對應的潛在藥物靶標。

1.3 藥物靶標的篩選和校正

使用美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫的Gene 基因搜索功能（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/），將篩選出的分子-靶點匹配度（fit）大于4.5的Target Name輸入到NCBI數據庫中，限定物種為人，將符合要求的所有基因換為official symbol。經上述數據庫檢索和轉化操作，獲取與活性成分相關的基因信息。

1.4 潛在作用通路預測 利用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）中功能注釋工具（Functional Annotion Tool），上傳搜索到的潛在藥物靶點的ID號（Submit the gene list），之后選擇KEGG-Pathway，選取P<0.05的所有通路，即可輸出所有靶點作用的體內通路，化合物、靶點和通路之間用Tab鍵隔開，建立相應的TXT格式文本文檔。

1.5 建立“藥材-化學成分-靶點-作用通路-藥理作用-臨床應用”網絡圖 利用Cytoscape軟件，畫出“藥材-化學成分-靶點-作用通路-藥理作用-臨床應用”的作用網絡圖，各部分用不同的顏色進行區(qū)分。

2 結果與分析

2.1 山豆根藥材-化學成分-靶點分析

通過文獻檢索得到了數十個山豆根化學成分，最終取25個化學成分，其中包括苦參堿、氧化苦參堿、N-甲基金雀花堿等生物堿類成分8個，山豆根色滿査耳酮A、B、C等黃酮類成分10個，以及其他類型化學成分7個。通過PharmMapper數據庫，篩選每種成分對應的潛在藥物靶點（分子-靶點匹配度（fit）≥4.5），落在作用通路上的靶點共有52個，每個化學成分對應的潛在靶點如表1所示。

2.2 山豆根靶點-作用通路分析

通過DAIVD進行功能注釋和KEGG通路分析，得到25條信號通路（P<0.05）如表2所示，分別涉及癌癥、肝病、炎癥等相關的信號傳導通路。與癌癥有關的通路：Prostate cancer（hsa05215）、Pathways in cancer（hsa05200）、Chemical carcinogenesis（hsa05204）、Osteoclast differentiation（hsa04380）、Ras signaling pathway（hsa04014）、Adipocytokine signaling pathway（hsa04920）、ErbB signaling pathway（hsa04012）、Chronic myeloid leukemia（hsa05220）、Neurotrophin signaling pathway（hsa04722）、Cell cycle（hsa04110）;與抗炎作用有關的通路：Osteoclast differentiation（hsa04380）、Toxoplasmosis（hsa05145）、Adipocytokine signaling pathway（hsa04920）、Osteoclast differentiation（hsa04380）;與抗心律、降血脂和保肝有關的通路：PPAR signaling pathway（hsa03320）、Non-alcoholic fatty liver disease （hsa04932）、ErbB signaling pathway（hsa04012）;Non-alcoholic fatty liver disease（hsa04932）、Drug metabolism - cytochrome P450（hsa00982）、Tyrosine metabolism（hsa00350）、Metabolism of xenobiotics by cytochrome（hsa00980）、Purine metabolism（hsa00230）、cAMP signaling pathway（hsa04024）、ABC transporters（hsa02010）、Biosynthesis of antibiotics（hsa01130）、AMPK signaling pathway（hsa04152）、Chagas disease（hsa05142）、Dopaminergic synapse（hsa04728）、Metabolic pathways（hsa01100）、Platelet activation（hsa04611）。

根據 KEGG 網站上的通路信息及相關文獻，對與癌癥相關的4條通路的生物學意義描述如下：

（1）Prostate cancer（hsa05215）。前列腺癌是男性最常診斷的癌癥，也是男性癌癥死亡的第二大原因。前列腺癌細胞的識別涉及生長因子信號通路中的NKX3.1、PTEN、p27和雄激素（AR）靶點，這幾個靶點對前列腺癌細胞表達起關鍵作用。NKX3.1和PTEN不足將導致p27水平的降低和減少細胞凋亡，從而導致前列腺癌的發(fā)生。山豆根中的化學成分槐定堿、山豆根色滿二氫黃酮A、大黃素甲醚等作用于該通路，推測這些成分與抗前列腺癌作用有關。

（2）Chemical carcinogenesis（hsa05204）?；蚨拘灾掳┪锕鬌NA和RNA等生物大分子，通過影響新陳代謝直接或間接影響這些生物大分子的表達，形成DNA加合物。DNA加合物是化學毒物經生物系統(tǒng)代謝并活化后的親電活性產物與DNA分子特異位點結合形成的共價結合物。如果DNA加合物逃避細胞修復機制和持續(xù)下去，他們可能會導致錯編密碼，從而形成永久性的突變。以上機制會誘導炎癥的發(fā)生、免疫反應的抑制和活性氧的形成，改變細胞信號傳導通路，從而導致超突變型和基因組不穩(wěn)定，形成細胞增殖失控等癌變特征。作用于該通路的山豆根中化學成分有山豆根色滿查耳酮B、β-谷甾醇、番石榴酸乙酯，推測這些化學成分可能與抗癌作用有關。

（3）Neurotrophin signaling pathway（hsa04722）。神經營養(yǎng)因子是一個家庭的營養(yǎng)因素，參與神經細胞的分化和生存，通過接觸激酶或自我生成受體酪氨酸激酶受體（p75NTR）。p75NTR屬腫瘤壞死因子受體超家族成員，主要在神經細胞的早期發(fā)育過程中豐富表達，通過不同的信號轉導通路誘導以神經細胞為主的細胞增殖、分化、凋亡等，發(fā)揮多重生物學效應[13]?；卑纷饔眠@條通路，推測槐胺可能具有促進癌細胞分化和調亡的作用。

（4）Ras signaling pathway（hsa04014）。Ras GTPase 蛋白信號通路有調節(jié)細胞的增殖開關、生存、生長、遷移、分化和細胞骨架活力的功能。GTPase通常行使腫瘤抑制基因的功能，促進 Ras活化蛋白水解，抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。在山豆根藥物中槲皮素作用該通路，推測槲皮素對腫瘤的抑制有一定的效果。

山豆根通過通路調節(jié)腫瘤壞死因子、細胞分化、細胞調亡等機理起到抑癌作用。Prostate cancer（hsa05215）通過NKX3.1、PTEN和p27蛋白調控藥理作用;Ras signaling pathway（hsa04014）通過GTPase行使腫瘤抑制基因的功能，促進 Ras活化蛋白水解，抑制腫瘤的發(fā)生;Neurotrophin signaling pathway（hsa04722）通過腫瘤抑制因子和細胞分化促進癌細胞分化和調亡。

2.3 山豆根“藥材-化學成分-靶點-作用通路-藥理作用-臨床應用”網絡模型構建 整合山豆根的化學成分、靶點和通路信息，結合文獻報道的山豆根藥理作用和臨床應用，得到“藥材-化學成分-靶點-作用通路-藥理作用-臨床應用”的作用網絡圖（圖1）。

3 結論與討論

通過對山豆根作用機制網絡圖分析發(fā)現，主要與癌癥、炎癥、肝病、心血管病等藥理作用有關，其中Prostate cancer（hsa05215）、Pathways in cancer（hsa05200）等10條通路與癌癥相關。針對山豆根25種化學成分進行分析，其中有20種成分作用于上述藥理作用相關通路，各自調控不同的基因，包括苦參堿、氧化苦參堿、臭豆堿、槐胺、槐定堿、山豆根色滿二氫黃酮 A、山豆根色滿二氫黃酮 C、8-甲雷杜辛、山豆根色滿查耳酮A、山豆根色滿查耳酮B、山豆根色滿查耳酮C、槲皮素、水仙苷、槐花二醇、麥芽酚、番石榴酸乙酯、大黃素、大黃素甲醚、β-谷甾醇、三葉豆紫檀苷，其中山豆根色滿二氫黃酮A的作用最為廣泛， 涉及了癌癥、炎癥、心血管疾病、肝病及血脂水平的調控;參與對癌癥調控的成分主要有苦參堿、氧化苦參堿、槐胺、槐定堿、臭豆堿、番石榴酸乙酯、山豆根色滿二氫黃酮 A、山豆根色滿二氫黃酮 C、山豆根色滿查耳酮A、山豆根色滿查耳酮B、山豆根色滿查耳酮C、槲皮素、水仙苷、大黃素、大黃素甲醚、β-谷甾醇、麥芽酚、三葉豆紫檀苷。山豆根色滿二氫黃酮A、槐胺、水仙苷3種化學成分對炎癥有調控作用;對心血管病的調控有槐花二醇、山豆根色滿二氫黃酮A、β-谷甾醇、大黃素甲醚、山豆根色滿查耳酮A、槐定堿;涉及肝病的有大黃素甲醚、山豆根色滿二氫黃酮A和槐定堿。

利用網絡藥理學來尋找、優(yōu)化和確認中藥作用靶點，通過建立“藥材-化學成分-靶點-作用通路-藥理作用-臨床應用”網絡模型，構建起完整的網絡圖。在此基礎上進行網絡分析，探討中醫(yī)藥的藥效成分及其潛在的藥理作用和臨床應用，為新藥研發(fā)和藥物作用機制的研究提供了新思路。

參考文獻

[1] 李經緯，余瀛鰲，蔡景峰，等.中醫(yī)大辭典[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：122.

[2] 張濤.山豆根藥理作用與臨床應用研究近況[J].廣西中醫(yī)學院學報，2008，11（3）：110-111，117.

[3] 丁佩蘭，陳道峰.中藥山豆根及其制劑的藥理作用、臨床應用與不良反應[J].中國臨床藥學雜志，2003，12（5）：315-318.

[4] 彭湘君.山豆根多糖的提取工藝及抗腫瘤活性研究[D].贛州：贛南師范學院，2012.

[5] 申曉東，宋關斌，嚴潤彬，等.苦參堿和氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究進展[J].重慶大學學報（自然科學版），2005，28（6）：125-128.

[6] 馬玲娣.中藥苦參堿抗腫瘤作用的實驗研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學，2005.

[7] 何常明.苦參和山豆根黃酮類成分及其生物活性的比較研究[D].上海：復旦大學，2010.

[8] 盧祥之.國醫(yī)大師李濟仁經驗良方賞析[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2012：159-163.

[9] 達瑞，劉永琦.中西醫(yī)結合治療鼻咽癌的研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（10）：141-143.

[10] 湯佩佩，白明，苗明三.中醫(yī)藥研究與網絡藥理學[J].中醫(yī)學報，2012，27（9）：1112-1115.

[11] 張貴彪，陳啟龍，蘇式兵.中藥網絡藥理學研究進展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2013，20（8）：103-106.

[12] 劉珺，黃詠梅，王暉.網絡藥理學的研究進展[J].華西藥學雜志，2014，29（6）：723-725.

[13] 丁佩蘭.山豆根和苦參化學成分的比較研究[D].上海：復旦大學，2004.

[14] 張紅凱，陳杰.RAS-GTPase活化蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究進展[J].中國醫(yī)學科學院學報，2015，37（3）：364-369.