周麗霞 吳翼 楊耀東

摘 要： 為篩選控制椰子果實(shí)中低碳鏈脂肪酸積累的關(guān)鍵FatB基因，本研究以海南本地高種綠椰四個(gè)發(fā)育時(shí)期的果實(shí)為試驗(yàn)材料，參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T2906-1982谷類、油料作物種子粗脂肪測定方法，用索氏提取法提取果肉脂肪酸，應(yīng)用氣質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)測定各發(fā)育時(shí)期脂肪酸含量及組分，同時(shí)應(yīng)用qRT-PCR對椰子脂肪酸合成相關(guān)基因FatB1、FatB2及FatB3進(jìn)行相對定量分析，明確各發(fā)育時(shí)期椰子果實(shí)脂肪酸積累與FatB基因表達(dá)量變化之間的關(guān)系。結(jié)果表明：（1）椰子油含9種脂肪酸成分，在椰子果實(shí)發(fā)育的早期（第6和第7個(gè)月），棕櫚酸、硬脂酸和油酸的含量較高，月桂酸和肉豆蔻酸相對含量較低，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，此時(shí)FatB1基因的相對表達(dá)量較高。（2）而在椰子果實(shí)發(fā)育的后期（第8和第9個(gè)月），棕櫚酸、硬脂酸和油酸的相對含量迅速降低，月桂酸和肉豆蔻酸相對含量迅速升高，F(xiàn)atB2和FatB3基因的相對表達(dá)量較高，F(xiàn)atB1的表達(dá)量略有降低。該研究初步掌握了椰果各發(fā)育時(shí)期FatB基因表達(dá)量與脂肪酸成分間的變化趨勢，該結(jié)果為將來篩選控制椰子果實(shí)中低碳鏈脂肪酸積累的關(guān)鍵FatB基因奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為椰子脂肪酸成分的分子改良提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 椰子， 脂肪酸， FatB基因， 氣質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)， qRT-PCR

中圖分類號： Q943 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?文章編號： 1000-3142（2021）07-1165-08

Abstract： In order to screen the key genes controlling the accumulation of low-carbon chain fatty acid in coconut fruit， Hainan high-grade green coconut fruits at four growth stages were used as experimental materials， according to GB/T 2906-1982 method for the determination of crude fats in cereals and oil crop seeds， the oil in fresh fruit of Hainan high-grade green coconut was extracted by Soxhler extractor， the contents and components of fatty acids were determined by GC-MS， and quantitative analyses of FatB1， FatB2 and FatB3 genes were carried out by qRT-PCR. The relationship between fatty acid accumulation and FatB gene expression in coconut fruit at each development stage were clarified. The results were as follows： （1） Coconut oil contains nine kinds of fatty acid. In the early growth stage of coconut fruit development （the 6th and 7th months）， the contents of palmitic acid， stearic acid and oleic acid were higher， and the relative contents of lauric acid and myristic acid were lower. The relative expression of FatB1 gene was higher through real-time fluorescent quantitative PCR. （2） In the later growth stage of coconut fruit （the 8th and 9th month）， the relative contents of palmitic acid， stearic acid and oleic acid decreased rapidly， the relative contents of lauric acid and myristic acid increased rapidly， the relative expression of FatB2 and FatB3 genes was higher， and the expression of FatB1 was lower. Through this study， we preliminarily explored the change trend of FatB gene expression and fatty acid composition in different growth stages of coconut fruit. The results establish foundation for screening the key FatB gene that controls the accumulation of low-carbon chain fatty acids in coconut fruit， and provide theoretical basis for the molecular improvement of fatty acid composition.

Key words： coconut， fatty acid， FatB genes， GC-MS， qRT-PCR

椰子（Cocos nucifera）為棕櫚科（Arecaceae）椰子屬（Cocos L.）的單子葉植物，原產(chǎn)于東南亞熱帶雨林地區(qū)，目前在全世界90多個(gè)熱帶國家和地區(qū)廣泛種植（Batugal et al.， 2005）。椰子作為熱帶地區(qū)的重要木本經(jīng)濟(jì)油料作物之一，其開發(fā)價(jià)值很高，新鮮椰肉中的含油量可達(dá)33.0%，椰子干中的含油量高達(dá)63.0%（段岢君等，2013b）。

椰子油屬于典型的月桂酸類油脂，其脂肪酸組成中碳鏈分布范圍較廣，囊括了C6～C18的餾分（Marina et al.， 2009;耿薇，2010），其主要成分的是月桂酸和肉豆蔻酸，相對含量高達(dá)75.0%以上（Krishnamoorthy et al.， 2019），其中，高含量的月桂酸是其他大部分油料作物所沒有的，且這些脂肪酸極易被人體吸收，其在人體內(nèi)的消化系數(shù)為99.3%，遠(yuǎn)高于花生油、菜籽油和芝麻油等食用油（Damayanti et al.， 2019）。椰子油還可用來做油脂化工產(chǎn)品、牛奶里的脂肪、制造肥皂的原料、去污劑和個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品等。對椰子油的生理活性研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗氧化活性、調(diào)節(jié)血漿血脂、減肥與美容、維持體內(nèi)代謝平衡和抗微生物、增強(qiáng)免疫力等藥用功能（鄧福明等，2013;禤小鳳等，2013;段岢君等，2013a;李曉煜等，2013;顏巧麗等，2013）。在人體中，月桂酸以月桂酸甘油酯的形式存在，該成分可以破壞脂類包被類型的病毒（如艾滋病、肝炎病毒），具有抗病毒的作用（蔣增良等，2015）。此外，椰子油中的月桂酸等脂肪酸，其皂化值高，可增加產(chǎn)品的泡沫和溶解度，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年都有幾百萬噸的椰子油用于洗滌劑的加工生產(chǎn)（王鈺等，2002）。由此可見，椰子油不僅在食用方面，而且在油脂化工和生物燃料等行業(yè)均發(fā)揮著重要的作用。掌握控制椰子油中低碳鏈脂肪酸合成的關(guān)鍵FatB基因，為其脂肪酸成分的分子改良提供理論基礎(chǔ)。

脂酰-?；d體蛋白硫脂酶（Fat）對植物脂肪酸的飽和度及其碳鏈長度均有重要作用，其中，F(xiàn)atB基因家族傾向于生成飽和碳鏈（趙彥朋，2014）。目前，已在多種植物中克隆到了FatB基因，如李曉斐（2011）克隆得到花生FatB基因序列全長1 617 bp，構(gòu)建了植物表達(dá)載體PBI121-AhfatB，實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化。趙彥朋（2014）通過克隆和構(gòu)建Pbisp-FAD2-FatB載體，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草種子中的棕櫚酸和硬脂酸均有顯著降低，油酸含量顯著性提高。趙彥朋等（2015）通過構(gòu)建抑制煙草種子FatB表達(dá)的載體，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中油酸含量有所提高。劉祾悅等（2019）利用qRT-PCR分析文冠果種仁油脂脂肪酸形成相關(guān)基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)FatA和FatB基因的低表達(dá)和KAR基因的高表達(dá)，為文冠果種仁油脂碳十八以上不飽和脂肪酸的形成積累提供了充足的硬脂酸合成前提。目前，針對椰子油脂肪酸成分分析的報(bào)道較多（耿薇等，2015;桂青等，2016;周麗霞等，2019），而對調(diào)控椰子果實(shí)脂肪酸合成的相關(guān)基因的研究報(bào)道較少。肖勇等（2013）應(yīng)用椰子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挖掘了11個(gè)脂酰-ACP硫脂酶基因，通過熒光定量PCR檢測上述基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)FatB基因家族的高表達(dá)對中低碳鏈脂肪酸的積累呈一定的正相關(guān)關(guān)系。袁怡君（2013）通過克隆椰子胚乳中與中鏈脂肪酸合成相關(guān)的基因FatB，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草種子中肉豆蔻酸（14∶0）、棕櫚酸（16∶0）和硬脂酸（18∶0）的相對含量都有不同程度的增加，其他種類脂肪酸含量無明顯變化。

目前，關(guān)于椰子脂肪酸相關(guān)的研究主要集中在生理生化水平，對相關(guān)合成基因的表達(dá)、功能和合成機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。因此，明確該基因在椰子果肉發(fā)育不同階段的表達(dá)變化情況，可為將來研究椰子脂肪酸合成的分子機(jī)理及脂肪酸成分的分子改良奠定基礎(chǔ)。本文以海南本地高種綠椰為研究材料，應(yīng)用qRT-PCR和GC-MS檢測技術(shù)，分析椰子果實(shí)不同生長時(shí)期FatB1、FatB2及FatB3基因的表達(dá)量變化，結(jié)合椰子果肉在不同時(shí)期各脂肪酸成分的相對含量，明確FatB1、FatB2及FatB3的表達(dá)變化與各脂肪酸含量之間的變化趨勢，以期為將來深入掌握控制椰子果實(shí)中低碳鏈脂肪酸合成的關(guān)鍵FatB基因及脂肪酸成分的分子改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所椰子大觀園內(nèi)本地高種綠椰。將本地高種綠椰在花授粉后起記為第1天，此后的第180天（第6個(gè)月）、第210天（第7個(gè)月）、第240天（第8個(gè)月）和第270天（第9個(gè)月）分別摘取同株的椰果和椰子嫩葉，每次取3份重復(fù)。椰子嫩葉迅速放于液氮冷卻，帶到實(shí)驗(yàn)室放在-80 ℃保存，果肉于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

石油醚（60～90 ℃）、氫氧化鉀、甲醇、苯及和正己烷均購自?？诃偵饺R客科技服務(wù)中心，羅氏SYBR Green PCR Master Mix購自Sigma公司。主要儀器設(shè)備：Agilent 7890A+5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent），上海亞榮RE52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），上海熙揚(yáng)索氏提取器（上海熙揚(yáng)儀器有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國安捷倫Mx3000P型）。

1.2 脂肪酸的提取

參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 2906-1982谷類、油料作物種子粗脂肪測定方法，稱取5 g椰子果肉，用研缽研磨至粉狀后，用濾紙包裹并置于提取器中，向提取瓶內(nèi)加入200 mL石油醚，80 ℃恒溫水浴回流提取約15 h，得無色透明萃取液，應(yīng)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其減壓濃縮得到樣品溶液，用石油醚定容至10 mL。

1.3 脂肪酸甲酯化處理

吸取上述樣品提取液1 mL，加入2 mL 0.4 mol·L-1氫氧化鉀的甲醇溶液（色譜級）和8 mL苯-石油醚（體積比1∶1），充分振蕩后靜置15 min，再加入16 mL蒸餾水，充分振蕩后放置至溶液清晰分層，吸取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其減壓蒸干，得甲酯化脂肪酸，加入0.5 mL正己烷使其溶解并轉(zhuǎn)移至1.5 mL氣相色譜上樣瓶中，作GC-MS分析。

1.4 GC-MS條件

GC條件：色譜柱Agilent DB-23（30 m × 250 μm × 0.25 μm），載氣為氮?dú)?，柱初?80 ℃，以10 ℃·min-1速率加熱至220 ℃，維持3 min，平衡時(shí)間1 min，進(jìn)樣量1 μL，色譜柱流速1 mL·min-1，分流比1∶40。

MS條件：EI離子源，電子能量80 eV，電子倍增器電壓1 kV，質(zhì)量掃描范圍25～450 m·z-1，離子源溫度200 ℃，GC-MS接口溫度230 ℃，質(zhì)譜檢測時(shí)間3 min。

1.5 椰子果肉RNA提取

分別取第6、7、8、9個(gè)月的椰子果肉約1 g，用液氮研磨至粉末狀，加入1 mL提取液，劇烈震蕩并在室溫下靜置5 min后，于4 ℃ 超高速離心機(jī)中10 000 r·min-1離心10 min，取上清，加入600 μL氯仿，混勻后在室溫下靜置7 min，于4 ℃ 超高速離心機(jī)中10 000 r·min-1離心10 min，取上清，加入等體積異丙醇，混勻并在室溫下靜置10 min，于4 ℃ 超高速離心機(jī)中10 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，于4 ℃超高速離心機(jī)中7 500 r·min-1離心5 min，棄上清液，開蓋干燥3 min，加入20 μL RNase-free H2O溶解。

1.6 RNA逆轉(zhuǎn)錄及檢測

逆轉(zhuǎn)錄分為兩個(gè)步驟：步驟1總體系為12 μL，其中nuclease-free Water 6 μL，Oligo（dT）18 Primer 1 μL，mRNA 5 μL，65 ℃ 5 min 后，迅速置于冰水中冷卻;步驟2體系為8 μL，其中，5×Reaction Buffer 4 μL，Ribolock RNase Inhibitor（20 u·μL-1） 1 μL，10 mM dNTP Mix 2 μL，Reverse Transcriptase（200 u·μL-1）1 μL，將步驟2中的8 μL體系加入步驟1的12 μL體系中，42 ℃ 60 min后70 ℃ 5 min。

采用UBC10內(nèi)參基因（Xia et al.， 2013）引物（5′-TCGACGATGACATCAACGAAGT-3′，5′-TCTATGAATCCACCAACTCAGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，檢測體系為10 μL：cDNA 1 μL，UBC10 F/R 引物各0.5 μL，Taq DNA Polymerase 0.2 μL，dNTP Mixture 0.2 μL，10×Taq Buffer（plue Mg2+） 1 μL，ddH2O 6.6 μL。PCR檢測程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min。瓊脂糖凝膠電泳， 1.0%凝膠，1×TAE緩沖液，120 V電壓電泳25 min，置凝膠于凝膠成像分析系統(tǒng)上檢測。逆轉(zhuǎn)錄成功的cDNA 母液用滅菌ddH2O稀釋10倍，分裝備用。

1.7 熒光定量PCR

采用羅氏的SYBR Green PCR Master Mix實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，在Stratagene Mx3000P 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)目的基因進(jìn)行三個(gè)生物學(xué)重復(fù)和三個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系：2×FastStart Universal SYBR Green Master 緩沖液5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Rox 0.2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 2.8 μL，反應(yīng)總體積10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物用Primer Premier 5.0 進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物信息見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.8方法

應(yīng)用SHIMADZU GC/MS solution Release 2.10對GC-MS圖譜進(jìn)行鑒定和定量分析，根據(jù)GC-MS聯(lián)用測定得到的質(zhì)譜信息，應(yīng)用NIST 11數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，通過與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對照，確定每個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier 5.0軟件，應(yīng)用Applied Biosystems 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR，Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 各生長時(shí)期椰子果肉脂肪酸含量分析

采用索氏提取法提取新鮮椰子果肉四個(gè)生長時(shí)期的脂肪酸，如圖1所示，測得第6個(gè)月的椰子果肉脂肪酸相對含量為12.5%，第7個(gè)月的椰子果肉脂肪酸相對含量為23.6%，第8個(gè)月的椰子果肉脂肪酸相對含量為27.0%，第9個(gè)月的椰子果肉脂肪酸相對含量為33.5%。隨著椰子果實(shí)的發(fā)育，果肉中脂肪酸的含量不斷增加。本研究結(jié)果與段岢君等（2013b）調(diào)查的結(jié)果基本相符。

2.2 椰子果肉脂肪酸的組成及相對含量

應(yīng)用GC-MS技術(shù)分別測定四個(gè)生長時(shí)期椰子果肉的脂肪酸成分及相對含量，結(jié)果如圖2-5所示，由脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖可知，各生長時(shí)期椰子果肉中含有的脂肪酸成分完全相同，都含有己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸飽和脂肪酸以及油酸、亞油酸不飽和脂肪酸，保留時(shí)間均在6～28 min之間。各時(shí)期脂肪酸成分的相對含量變化較大，在椰子果實(shí)發(fā)育早期（第6和第7個(gè)月），棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的相對含量在10.0%～30.0%之間，遠(yuǎn)大于己酸、辛酸、癸酸、 月桂酸和肉豆蔻酸的相對含量。在椰子果實(shí)發(fā)育的后期（第8和第9個(gè)月），棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的相對含量逐漸減少，尤其是在第9個(gè)月時(shí)，其相對含量降到了10.0%以下;而月桂酸和肉豆蔻酸的相對含量迅速增加，在第9個(gè)月時(shí)，肉豆蔻酸的相對含量達(dá)到了20.6%，月桂酸的相對含量高達(dá)49.85%。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測FatB基因表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果采用比較閾值法（2-ΔΔCt法）（Livak et al.， 2001）對各功能基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相對定量，對樣本中特定mRNA的檢測是建立在內(nèi)參樣本基礎(chǔ)上的，將定量測定結(jié)果表示為靶mRNA/內(nèi)參樣本mRNA的比值，確定在椰子果肉生長的四個(gè)不同時(shí)期脂肪酸合成相關(guān)功能基因表達(dá)水平。圖6展示了椰子脂肪酸合成途徑中FatB1、FatB2及FatB3功能基因在椰子果實(shí)生長的第6、7、8、9個(gè)月轉(zhuǎn)錄水平的變化。其中，F(xiàn)atB1在椰子果實(shí)發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄水平相對穩(wěn)定，表達(dá)升高和降低幅度均較小（圖6： A）;FatB2和FatB3基因在果實(shí)發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄水平較低，隨著果實(shí)的發(fā)育，表達(dá)水平均逐漸升高，尤其是在第9個(gè)月，其表達(dá)量均達(dá)最大（圖6 ：B，C）。

3 討論與結(jié)論

椰子作為一種重要的油料作物，與一般的草本油料作物不同。椰子油是國際椰子加工的主要產(chǎn)品，其主要成分為月桂酸，作為食用油，較易被人體吸收，除此之外，椰子油在化妝品和洗滌用品等化工行業(yè)也有廣泛的用途（Guarte et al.， 1996;Rindengan et al.， 2005）。椰子作為一種月桂酸含量最高的作物，是研究月桂酸等中低碳鏈脂肪酸合成分子機(jī)理的重要材料（肖勇等，2013）。目前，對椰子油脂肪酸相關(guān)的研究主要集中在其組成成分及含量的測定與分析，對相關(guān)基因表達(dá)，功能和調(diào)控機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本研究結(jié)合qRT-PCR和GC-MS檢測技術(shù)，探索椰子果實(shí)四個(gè)發(fā)育時(shí)期FatB1、FatB2及FatB3基因的表達(dá)量與脂肪酸成分相對含量之間的變化趨勢，為將來深入掌握控制中低碳鏈脂肪酸合成的關(guān)鍵FatB基因及為椰子油中低碳鏈脂肪酸成分的分子改良提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)新鮮椰子果肉主要含有9種脂肪酸成分，這與耿薇（2010）的研究結(jié)果相一致。Yandeau-Nelson et al.（2011）研究發(fā)現(xiàn)FatB1主要是針對C8、C14和C16的脂肪酸合成，F(xiàn)atB2主要針對C14和C16的脂肪酸合成，而FatB3負(fù)責(zé)產(chǎn)生C12和C14的中碳鏈脂肪酸。本研究通過分析FatB1、FatB2及FatB3基因的表達(dá)量及相對應(yīng)各生長時(shí)期脂肪酸成分相對含量之間的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育的第6個(gè)月， FatB1表達(dá)量達(dá)最大，且此時(shí)C16和C18脂肪酸的相對含量最高，C12和C14脂肪酸相對含量較低，在第7、8、9個(gè)月的FatB1表達(dá)量有小幅度下降，但變化相對不大。在果實(shí)發(fā)育第8、9個(gè)月， FatB2和FatB3的表達(dá)量逐漸變大，尤其是在第9個(gè)月，F(xiàn)atB2和FatB3的表達(dá)量均迅速變大，分別為第6個(gè)月表達(dá)量的4.8倍和27.8倍。 此時(shí)，C12和C14的相對含量均達(dá)到最大，其中C12為49.9%，是第6個(gè)月的4.1倍，C14為20.3%，是第6個(gè)月的2.7倍。本研究通過對FatB基因在果肉四個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)進(jìn)行定量驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)FatB1的大量表達(dá)與C16和C18脂肪酸的積累相一致，F(xiàn)atB2和FatB3的大量表達(dá)與C12和C14中低碳鏈脂肪酸的積累相一致。這一結(jié)果與Yandeau-Nelson et al.（2011）的研究結(jié)果存在一定差異。分析其主要原因是脂肪酸的合成是一個(gè)由多種酶和多個(gè)基因相互協(xié)調(diào)、共同作用的復(fù)雜過程，僅依據(jù)脂肪酸的積累和FatB基因的表達(dá)變化趨勢不能說明FatB基因具體負(fù)責(zé)哪種脂肪酸的合成，為進(jìn)一步驗(yàn)證各FatB基因?qū)唧w脂肪酸合成的調(diào)控功能，可利用分子生物學(xué)手段，將關(guān)鍵FatB基因克隆、轉(zhuǎn)化到產(chǎn)油藻中，同時(shí)檢測轉(zhuǎn)化藻中的脂肪酸成分及含量，來驗(yàn)證其基因功能，從而為椰子油品質(zhì)的分子改良提供理論支持。

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（責(zé)任編輯 李 莉）