涂然 武坤毅 馮正平 王靜 盧芳芳 崔浪軍

摘 要： 為揭示白及與黃花白及內(nèi)生菌群落特征異同的內(nèi)在機制，該文運用末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析技術(shù)對白及和黃花白及葉、莖、塊莖、根等組織中內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA、內(nèi)生真菌ITS區(qū)進行檢測，分析內(nèi)生菌豐度及多樣性指數(shù)，運用主成分分析、聚類分析和相關(guān)性分析對比白及與黃花白及內(nèi)生菌差異。結(jié)果表明：（1）白及和黃花白及各組織內(nèi)生細(xì)菌H指數(shù)為1.77～2.51，內(nèi)生真菌H指數(shù)為1.79～3.18。（2）內(nèi)生細(xì)菌表現(xiàn)為莖、塊莖和根中相似，葉中差異較大;內(nèi)生真菌則表現(xiàn)出明顯的特異性。（3）白及藥用部位多糖含量與內(nèi)生細(xì)菌中的7個T-RFs、內(nèi)生真菌中的2個T-RFs呈相關(guān)性，黃花白及藥用部位多糖含量與內(nèi)生細(xì)菌中的3個T-RFs、內(nèi)生真菌中的6個T-RFs呈相關(guān)性。綜上結(jié)果表明，同一生境下，白及和黃花白及內(nèi)生細(xì)菌除葉組織外，其他組織相似，內(nèi)生真菌則差異顯著，部分內(nèi)生菌和藥用部位多糖含量存在相關(guān)性。

關(guān)鍵詞： 內(nèi)生菌， 白及， 黃花白及， T-RFLP， 白及多糖

中圖分類號： Q948 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2021）07-1173-08

Abstract： In order to reveal similarities and differences in the feature of endophytic community， endophytic flora of Bletilla striata and B. ochracea were compared in the same habitat. Endophytic bacteria 16S rDNA and endophytic fungi ITS from tissues（stem， leaf， tuber and root） of B. striata and B. ochracea were studied by terminal restriction fragment length polymorphism method. Abundance and biodiversity index were analyzed. Differences of endophyte between B. striata and B. ochracea were compared by principal component analysis， cluster analysis and correlation analysis. The resutls were as follows： （1） Shannon-Wiener indexes of endophytic bacteria and endophytic fungi in each tissue sample from B. striata and B. ochracea were between 1.77 to 2.51 and 1.79 to 3.18， respectively. （2） The endophytic bacteria of B. striata and B. ochracea were similar in stem， tuber and root， but quite different in leaf. The significant specificity was shown in endophytic fungi on the opposite. （3） Polysaccharides content in medicinal parts of B. striata was correlated with seven and two T-RFs in endophytic bacteria and endophytic fungi， respectively. Meanwhile， polysaccharides content in medicinal parts of B.ochracea was correlated with three and six T-RFs in endophytic bacteria and endophytic fungi， respectively. In summary， the endophytic bacteria of B. striata and B. ochracea from the same habitat in each part of tissues was similar except the leaf. However， endophytic fungi were significantly different. Some endophyte associated with polysaccharide content of the medicinal part.

Key words： endophytic， Bletilla striata， B. ochracea， T-RFLP， polysaccharide

白及屬（Bletilla）是溫帶地生蘭科（Orchidaceae）多年生草本植物。我國有白及屬植物4種，分別是白及（Bletilla striata）、華北白及（B. sinensis）、小白及（B. formosana）和黃花白及（B. ochracea）（中國植物志編委會，1999）。其中，白及是我國傳統(tǒng)中藥材，藥用已有上千年歷史，廣泛用于治療咳血吐血、外傷出血、皮膚破裂、肺結(jié)核咳血和潰瘍病出血等（國家藥典委員會，2000）。白及以塊莖入藥，含粘膠質(zhì)、菲衍生物、蒽醌衍生物等成分，其中粘膠質(zhì)富含的白及多糖是其主要藥效成分（韓廣軒等，2001）。雖然黃花白及花黃色或淡黃色，與白及的紫色花差別大，但其塊莖（假鱗莖）性狀及大小與白及相似，外皮縱皺，棕黃色或黃色，較難與白及區(qū)分（仇碩等，2017）。加之，二者特征指紋圖譜難以區(qū)分（陳美君等，2017），有時黃花白及的多糖含量高于白及（朱新焰等，2018）。因此，有黃花白及收入藥典作為白及藥材的另一來源的說法，同時市場上已經(jīng)有大量的黃花白及作為白及的替代品在銷售（陳美君等，2017;仇碩等，2017）。因此，二者相似性與差異性的研究對于白及與黃花白及的開發(fā)利用具有重要的指導(dǎo)意義。

內(nèi)生菌是指生長于植物活體組織內(nèi)部，但不引起明顯負(fù)面影響的細(xì)菌或真菌（Wilson，1995）。近年來，植物內(nèi)生菌作為生物活性物質(zhì)篩選的重要來源已成為研究的熱點（Alvin et al.，2014）。內(nèi)生菌與宿主長期共生的過程中，由于基因轉(zhuǎn)移，內(nèi)生菌可能與宿主具有合成次級代謝產(chǎn)物的相似途徑，可以生成與宿主相同的部分活性物質(zhì)，甚至于植物的某些活性物質(zhì)的合成與內(nèi)生菌密切相關(guān)（Wang & Dai，2011）。已有的研究表明，內(nèi)生菌對蘭科植物具有重要的生物學(xué)功能，在種子萌發(fā)、植株生長、增強抗逆性及生防等方面都有促進作用（Tsavkelova et al.，2007;程萍等，2008;俞婕等，2010;Stckel et al.，2014）。白及假鱗莖塊根部分內(nèi)生細(xì)菌的組成及優(yōu)勢菌群主要是鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬、鹽單胞菌屬和土壤桿菌屬（陳澤斌等，2016），而黃花白及的內(nèi)生細(xì)菌的組成與優(yōu)勢菌群還未見相關(guān)報道。植物內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)組成不僅與植物本身的遺傳特性相關(guān)，還與植物生長年限、生境氣候條件、土壤特性等密切相關(guān)（Andreote et al.，2014;Wagner et al.，2016）。因此，在盡可能一致的條件下對比白及與黃花白及內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)對闡明二者的差異與相似特征具有重要的指導(dǎo)意義。

基于此，本研究以陜西省安康市旬陽縣境內(nèi)同一生境下、相同生長年限、相同田間管理模式下的白及（B.striata） 和黃花白及（B.ochracea）為材料，運用末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）對兩種白及的不同組織部位內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)進行對比，分析白及和黃花白及內(nèi)生菌差異狀況，并進一步探討內(nèi)生菌與多糖含量的相關(guān)性，以期為研究兩種白及內(nèi)生菌群落特征的異同提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 采樣和表面消毒

采樣地點位于陜西省安康市旬陽縣境內(nèi)（109°20′46″E、32°58′13″N），海拔1 783 m。2012年7月，采集同一生境下兩年生人工培育白及和黃花白及作為研究材料。 該采樣點地處陜西省秦嶺山區(qū)東段，漢江橫貫其中，位于北亞熱帶溫暖區(qū)域，屬濕潤山地氣候。年均降雨量為851 mm，年平均氣溫為15.4 ℃，地貌以山為主。白及和黃花白及處于開花期，根據(jù)不同花色區(qū)分白及和黃花白及。隨機選取5個采樣點，保留根部土壤并用濕布覆蓋，整株植物保存于低溫下，立即帶回實驗室做表面消毒處理。首先，葉、莖、塊莖、根自來水沖洗3次去除黏附土壤，70%乙醇浸泡1 min;然后，新鮮配置的次氯酸鈉溶液清洗4 min（塊莖和根）、3 min（葉和莖），70%乙醇漂洗3次各30 s;最后，用無菌去離子水沖洗3次，無菌濾紙擦干。隨機選取白及和黃花白及各5株，按葉、莖、塊莖和根不同組織剪成小段，液氮速凍后，-80 ℃保存用于DNA提取。其余白及和黃花白及樣本，自然風(fēng)干后，粉碎過篩，-20 ℃保存用于有效成分測定。

1.2 多糖提取和含量測定

取黃花白及和白及塊莖部位，參考徐花榮（2006）的方法，采用堿水提醇沉法提取多糖。采用苯酚硫酸法（100 μL多糖溶液+120 μL 6%苯酚溶液+650 μL濃硫酸混合），490 nm處測定吸光度值，與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，計算多糖含量。

1.3 宏基因組提取及PCR擴增

取白及與黃花白及各組織（葉和莖0.5 g;塊莖和根1.0 g）進行液氮研磨。用CTAB （cetyltrimethy-lammonium bromide）法提取總DNA。得到的DNA用200 μL TE緩沖液（10 mmol·L-1 Tris-HCl，1 mmol·L-1 EDTA，pH 8.0）溶解。

真菌ITS區(qū)擴增：ITS1F 3′-AATGAAGGAGATTTACTGGTTC-5′ （FAM）， ITS4R 3′-CGTATAGTTATTCGCCTCCT-5′。PCR反應(yīng)體系25 μL，含4 μL （100 ng ）模板DNA，首尾引物各1 μL （20 μmol·L-1），PCR mix（TaKaRa） 12.5 μL，加去離子水補足到25 μL。擴增程序如下：95 ℃ 5 min 1個循環(huán);95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，25個循環(huán);72 ℃ 5 min 1個循環(huán)。塊莖組織比較特殊，采取的擴增程序如下：95 ℃ 5 min 1個循環(huán);95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，32個循環(huán)，72 ℃ 5 min 1個循環(huán)。

細(xì)菌16S rDNA 擴增：63F 3′-CTGAACGTACACAATCCGGA-5′， 1494R 3′- CAGCATTGTTCCATYGGCAT-5′ （HEA）， PCR反應(yīng)體系25 μL，含4 μL （100 ng ）模板DNA，首尾引物各1 μL （20 μmol·L-1），PCR mix（TaKaRa） 12.5 μL，加去離子水補足到25 μL。擴增程序如下：95 ℃ 5 min 1個循環(huán);95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30個循環(huán);72 ℃ 5 min 1個循環(huán)。塊莖組織比較特殊，采取的擴增程序如下：95 ℃ 5 min 1個循環(huán)，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán);72 ℃ 5 min 1個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次，PCR產(chǎn)物混勻，10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色后紫外光下參考DL2000 DNA ladder（TaKaRa）切下目標(biāo)條帶，回收純化。

1.4 酶切

PCR擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Msp I 或Hae Ⅲ （TaKaRa）在37 ℃水育下消解4 h，設(shè)置3個重復(fù)。75 ℃ 10 min滅活處理后，混勻3個平行樣本，1.5 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離，其余步驟同上。參照50 bp的DNA ladder確定酶切片段的堿基長度，小于30 bp的片段不回收。分離純化標(biāo)記的片段，在GeneScan模式下，使用ABI Prism 310毛細(xì)管測序儀（Shanghai GeneCore BioTechnologies Co.，Ltd .）檢測。隨后，用軟件GeneMapper 3.7對熒光圖進行分析，確定終端限制片段（T-RFs）的峰值大小、面積和高度。合格酶切片段的大小為30～500 bp，熒光強度在100個單位以上，峰面積超過總體峰面積的0.5%（在0.5%以下認(rèn)為是背景噪音）。Species richness是用同一個文件中總的T-RFs數(shù)來計算（大小為30～500 bp，不同大小的T-RFs）。

The Shannon-Wiener biodiversity index（H）=-∑pi×lnpi。

式中：pi指群落中第i物種個體峰高與所有峰值高度之和的比例。

The Shannon eveness index（E）=H/Hmax。

式中：Hmax=lnS;S是每個樣本中T-RFs的數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析都是使用軟件SPSS 18.0完成。對于T-RFLP分析，將T-RFs歸一化峰值用于主成分分析（PCA）和聚類分析。MiCA PAT +在線分析工具用于比對每個T-RFs代表的占主導(dǎo)地位的細(xì)菌或真菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶切產(chǎn)生的T-RFs 數(shù)量

用GeneMapper3.7軟件分析Msp I 或Hae Ⅲ酶切產(chǎn)生的熒光圖譜，得到白及與黃花白及共8個組織樣本的T-RFs數(shù)量，各組織樣本中T-RFs的均值介于5～37之間（表1）。就內(nèi)生細(xì)菌而言，白及和黃花白及都是葉組織產(chǎn)生的T-RFs最多，但各組織間差異不大（P>0.05）。就整株而言，黃花白及產(chǎn)生的T-RFs數(shù)量略多于白及。而就內(nèi)生真菌而言，Msp I酶切產(chǎn)生的T-RFs，在白及和黃花白及根組織中顯著高于其他組織（P<0.05），而兩者之間無顯著差異（P>0.05）。Hae Ⅲ酶切產(chǎn)生的T-RFs，白及根組織中顯著高于其他組織（P<0.05），而黃花白及根組織與其他組織之間無顯著差異（P>0.05）。對比Msp I和Hae Ⅲ酶切結(jié)果，白及和黃花白及各組織內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌都是Msp I較Hae Ⅲ多。因此，從多樣性檢測的結(jié)果來看，Msp I較Hae Ⅲ好，所以我們選擇Msp I的T-RFLP數(shù)據(jù)來進行MiCA PAT+在線比對分析。

2.2 生物多樣性指數(shù)分析

為了更加清楚地反映黃花白及和白及各組織內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)，我們基于T-RFLP數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析了各組織內(nèi)生菌的H、E指數(shù) （表2）。白及和黃花白及各組織內(nèi)生細(xì)菌H指數(shù)介于1.77～2.51之間，其中，葉組織的H指數(shù)較其他組織高，但差異不顯著（P>0.05）。各組織的E指數(shù)相差不大。兩種白及內(nèi)生真菌H指數(shù)在1.79～3.18之間，根組織的H指數(shù)較其他組織高，但白及和黃花白及根組織之間無顯著差異。白及和黃花白及各組織之間細(xì)菌分布相對均勻，而真菌則在塊莖組織中的分布相對集中。整體來看，白及和黃花白及各組織內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌多樣性的狀況相一致，都表現(xiàn)為內(nèi)生細(xì)菌多樣性從地下部分向地上部分增加;內(nèi)生真菌從地上部分向地下部分增加。

2.3 白及和黃花白及內(nèi)生菌的主成分分析和聚類分析

基于白及和黃花白及各組織部位內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌的T-RFs峰面積，進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析。內(nèi)生細(xì)菌部分PCA結(jié)果顯示，8個組織聚成三類。第一類由黃花白及莖、塊莖、根和白及莖、塊莖、根組成;第二類由黃花白及葉單獨組成;第三類由白及葉單獨組成（圖1：a）。聚類分析結(jié)果表明，黃花白及塊莖和白及塊莖先聚為一支，然后和黃花白及根聚為一支，白及根和白及莖聚為一支（圖1：b）。這表明黃花白及和白及塊莖、根等組織內(nèi)生細(xì)菌菌群更為相似。黃花白及葉和白及葉沒有聚為一支，表明黃花白及和白及葉內(nèi)生細(xì)菌菌群差異較大，且與其組織也有較大差異。內(nèi)生真菌部分PCA結(jié)果顯示8個組織聚成四類，第一類由白及葉、莖、塊莖組成;第二類由黃花白及葉、莖、塊莖組成;第三類由白及根單獨組成;第四類由黃花白及根單獨組成（圖1：c）。聚類分析表明，黃花白及葉、莖和塊莖聚為一支，白及葉、莖和塊莖聚為一支，接著兩組重新聚為一支。黃花白及根和白及根則沒有聚為一支（圖1：d），與PCA結(jié)果相符合。黃花白及和白及的內(nèi)生真菌表現(xiàn)出明顯的特異性。

2.4 內(nèi)生菌與多糖含量的相關(guān)性分析

對黃花白及和白及藥用部位塊莖多糖含量進行檢測，結(jié)果見表3。每克黃花白及塊莖中所含的純多糖為6.50 mg，每克白及塊莖中所含的純多糖為7.75 mg，兩種白及塊莖的多糖含量有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

黃花白及和白及的內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌與多糖含量的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，黃花白及塊莖內(nèi)生細(xì)菌中有3個T-RFs與多糖含量呈顯著相關(guān);白及葉、莖和塊莖內(nèi)生細(xì)菌中有3個、3個和1個T-RFs與多糖含量呈顯著或極顯著相關(guān)。黃花白及葉和根內(nèi)生真菌中有1個和5個T-RFs與多糖含量呈顯著相關(guān);白及莖和塊莖內(nèi)生真菌中各有1個T-RF與多糖含量呈顯著或極顯著相關(guān)（表 4）。

對表4中的T-RFs進行MiCA PAT+在線比對， 結(jié)果見表5。白及莖中的短波單胞菌屬（Brevundimonas）、塊莖中的窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）、黃花白及塊莖中的鹽單胞菌屬（Halomonas）可能與多糖含量存在相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

野生白及資源的枯竭與日益遞增市場需求之間的突出矛盾迫使黃花白及資源開發(fā)和白及人工保育迫在眉睫。本研究中白及和黃花白及在同一環(huán)境下生長，都處于花期，檢測葉、莖、塊莖和根四種不同組織部位內(nèi)生菌，土壤環(huán)境也基本一致。結(jié)果顯示白及和黃花白及內(nèi)生細(xì)菌除葉中差異較大外，整體較為相似，且多樣性呈現(xiàn)出從地上部分向地下部分降低趨勢。內(nèi)生真菌整體差異較大，尤其是根，多樣性表現(xiàn)出從地下部分向地上部分降低趨勢。首先，葉組織上的氣孔作為空氣中細(xì)菌進入植物內(nèi)的門戶，可能是導(dǎo)致白及和黃花白及內(nèi)生細(xì)菌多樣性呈現(xiàn)從地上部分向地下部分降低趨勢的主要原因;根尖部位分生組織的裂隙可能是導(dǎo)致白及和黃花白及內(nèi)生真菌多樣性呈現(xiàn)從地下部分向地上部分降低的趨勢的主要原因（Mccully，2001;Srensen & Sessitsch，2007）。其次，植物會傾向選擇有利于自身生態(tài)位和進化的微生物共生（Compant et al.，2005;Srensen & Sessitsch，2007）。外源微生物無論從根尖或葉氣孔進入植物內(nèi)部，由于宿主內(nèi)環(huán)境差異（pH、離子濃度等）和分泌抗菌物質(zhì)類別的不同（萜類化合物，苯并惡嗪酮，特別是類黃酮和異黃酮類）（Bais et al.，2006），宿主植物對大多數(shù)的外源微生物加以清除，但適合自身的競爭性內(nèi)生菌保留（Thrall et al.，2007），并迅速在細(xì)胞間隙大量繁殖（Dong et al.，2003;Zakria et al.，2007）。這可能是造成白及和黃花白及葉內(nèi)生細(xì)菌、根內(nèi)生真菌差異較大的原因。現(xiàn)有研究顯示，白及和黃花白及根部的內(nèi)生真菌雖然都屬于擔(dān)子菌門和子囊菌門，但白及根部內(nèi)生真菌主要為梨形孢屬，而黃花白及根部有頂孢霉屬、柱孢屬、鐮刀菌屬、輪枝孢屬、瘤菌根菌屬、Rhexocercosporidium 屬和臘殼菌屬真菌，真菌類群組成存在巨大差異（劉準(zhǔn)等，2013;席剛俊等，2017）。植物-假單胞菌的關(guān)聯(lián)實驗發(fā)現(xiàn)，生長于相同生境下，兩種不同植物亞麻和番茄只選擇了所涉及的假單胞菌屬的特定少量“菌株”作為二者共有內(nèi)生菌，而不是整個假單胞菌群落的菌作為共有菌（Lemanceau et al.，1995）。關(guān)于白及和黃花白及對內(nèi)生菌選擇傾向差異的相關(guān)機制，還需進一步研究。

根據(jù)與多糖含量存在相關(guān)性的T-RFs不同，僅能推測與白及和黃花白及藥用部位多糖含量積累相關(guān)的內(nèi)生菌存在差異。原因在于以下兩個方面。第一，T-RFLP技術(shù)產(chǎn)生的T-RFs所代表的是一種或者一類菌的集合，若對內(nèi)生菌種屬進行進一步的鑒定還需要通過克隆實驗或者高通量宏基因組測序，以獲取內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA、內(nèi)生真菌的ITS序列信息（Siqueira et al.，2017）。第二，由于MiCA PAT+在線分析工具的局限性，細(xì)菌部分僅能比對到T-RFs片段可能對應(yīng)的細(xì)菌種屬信息，真菌部分的數(shù)據(jù)庫不完善，無法比對到T-RFs片段對應(yīng)的真菌種屬信息。因此，從比對到的結(jié)果來看，與白及多糖含量存在相關(guān)性的內(nèi)生細(xì)菌可能是短波單胞菌屬（Brevundimonas）、窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）等，與黃花白及多糖含量存在相關(guān)性的內(nèi)生細(xì)菌可能是鹽單胞菌屬（Halomonas）。

白及和黃花白及雖同為蘭科白及屬植物，但內(nèi)生菌存在差異，尤其是內(nèi)生真菌部分。因此，在對白及和黃花白及保育策略制定、資源合理開發(fā)上區(qū)別對待可能更為合理。

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（責(zé)任編輯 何永艷）