苦蕎二磷酸尿核苷-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體FtUTR的鑒定與分析

石桃雄 汪燕 梁成剛 韋春玉 關(guān)志秀 黃娟 朱麗偉

摘要：植物二磷酸尿核苷-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（UDP-galactose transporter，UTR）參與介導(dǎo)UDP-半乳糖的跨膜運(yùn)輸，對(duì)于高爾基體內(nèi)非纖維素多糖和糖蛋白合成至關(guān)重要。為了給苦蕎糖運(yùn)輸及調(diào)控機(jī)制研究提供科學(xué)參考，本研究基于基因功能注釋與同源基因比對(duì)，鑒定到9個(gè)苦蕎FtUTR基因，其序列長(zhǎng)度在1 920～5 975 bp間，氨基酸殘基在 81～352個(gè)間。FtUTR氨基酸序列的一致性為19.14%，說(shuō)明苦蕎不同F(xiàn)tUTR蛋白間序列保守性較低。但多個(gè)苦蕎FtUTR可分別與同源的擬南芥AtUTR聚在一起，說(shuō)明不同物種間UTR蛋白的進(jìn)化關(guān)系較為緊密。基于莖的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定到5個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中FtPinG0001931200.01在出苗后5 d高表達(dá);FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01在出苗后10 d高表達(dá);FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01在出苗后15 d高表達(dá)，推測(cè)它們可能在幼苗的特定發(fā)育階段發(fā)揮作用。另外，幼苗發(fā)育過(guò)程中苦蕎DEGs的表達(dá)量存在多個(gè)顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果可為下一步深入探索苦蕎FtUTR調(diào)控UDP-半乳糖運(yùn)輸以及生長(zhǎng)發(fā)育提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：苦蕎;二磷酸尿核苷-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體;蛋白序列分析;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S517.01?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）15-0053-05

收稿日期：20201-04-14

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金 （編號(hào)：32060511）;貴州省科技支撐計(jì)劃 （編號(hào)：黔科合ZC[2019]2298）;貴州省高層次創(chuàng)新型人才“千層次人才”項(xiàng)目;貴州省蕎麥種質(zhì)資源保育及創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)基金（編號(hào)：黔教合KY[2017]002）;貴州省研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃 （編號(hào)：黔教合YJSCXJH[2020]100）。

作者簡(jiǎn)介：石桃雄（1980—），女，寧夏石嘴山人，博士，副教授，研究方向?yàn)槭w麥數(shù)量遺傳學(xué)，E-mail：shitaoxiong@126.com;共同第一作者：汪 燕（1985—），女，重慶人，博士，副教授，研究方向?yàn)槭w麥種質(zhì)資源創(chuàng)新與遺傳育種，E-mail：yanwanguf@163.com。

通信作者：梁成剛，博士，副教授，研究方向?yàn)槭w麥遺傳育種。E-mail：jesselcg@163.com。

二磷酸尿核苷-半乳糖（UDP-galactose）是植物高爾基體內(nèi)非纖維素多糖和糖蛋白合成的重要前體物質(zhì)[1-2]。UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（UDP-galactose transporter，UTR）則是介導(dǎo)UDP-半乳糖進(jìn)行跨膜運(yùn)輸?shù)闹匾d體，對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用[3-4]。Khalil等將人類的UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因hUGT1導(dǎo)入煙草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出類似于外源赤霉素噴施的形態(tài)特征[5]。Reyes等研究指出，擬南芥中UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體AtUTr1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，體外試驗(yàn)證實(shí)AtUTr1能夠參與UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖運(yùn)輸[6]。此外，Bakker等鑒定獲得2個(gè)擬南芥UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（UDP-GalT1和UDP-GalT2），互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)它們具有UDP-半乳糖底物特異性[7]。Rollwitz等則在擬南芥中鑒定到一個(gè)新的UDP-半乳糖蛋白AtNST-KT1[8]。Handford等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtUTr7調(diào)控了UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖的運(yùn)輸，進(jìn)而影響側(cè)根的發(fā)育[9]。Seino等基于擬南芥UDP-galactose transporter序列比對(duì)，鑒定到水稻同源基因，并克隆了4個(gè)OsUGT基因，分別編碼350、337、345和358個(gè)氨基酸殘基[10];互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3可參與介導(dǎo)UDP-半乳糖的運(yùn)輸，而OsUTG4則介導(dǎo)了UDP-葡萄糖的運(yùn)輸。蘇瑩等基于同源比對(duì)鑒定到具有UDP-半乳糖和UDP-鼠李糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的水稻OsURGT1，氨基酸殘基數(shù)為331個(gè)，可能參與多種激素調(diào)控途徑和逆境脅迫調(diào)控途徑[11]。

苦蕎是我國(guó)的特色雜糧作物，主要種植于西南高寒地區(qū)[12]?？嗍w生育期短，同時(shí)具有耐貧瘠、耐冷涼、耐干旱等特性，加之其營(yíng)養(yǎng)保健功能突出，深受人們的喜愛[13-14]。不過(guò)，作為一種小宗作物，苦蕎栽培馴化時(shí)間短，基礎(chǔ)研究開展較為滯后，開展與苦蕎糖運(yùn)輸及調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究工作，可為探索苦蕎生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)量形成提供科學(xué)參考。本研究首次對(duì)苦蕎UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族FtUTR基因進(jìn)行篩選、鑒定與生物信息學(xué)分析，明確FtUTR基因信息及編碼蛋白理化特性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析苦蕎FtUTR的表達(dá)模式等，為苦蕎糖類運(yùn)輸?shù)姆肿诱{(diào)控機(jī)制等相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

基于擬南芥TAIR基因庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/about/datasources.jsp）中查詢獲得的AtUTR基因序列和苦蕎轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能注釋，進(jìn)行序列同源比對(duì)，篩選并鑒定苦蕎FtUTR基因。

1.2 苦蕎FtUTR基因及編碼蛋白的序列分析

登陸NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進(jìn)行苦蕎FtUTR基因的最長(zhǎng)開放閱讀框編碼蛋白（MaxORF）及編碼蛋白的氨基酸序列預(yù)測(cè)。登陸Expasy網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行苦蕎FtUTR編碼蛋白的氨基酸殘基數(shù)、蛋白分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性和脂肪族氨基酸指數(shù)的預(yù)測(cè)。登陸蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行苦蕎FtUTR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)功能域預(yù)測(cè)。利用DNAman軟件分析FtUTR氨基酸序列的保守位點(diǎn)。利用MEGA 5.0軟件Cluster W進(jìn)行FtUTR氨基酸序列多重序列比對(duì)分析，使用Neighbor-joining法進(jìn)行蛋白聚類分析，重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000次。

1.3 苦蕎FtUTR基因的表達(dá)與相關(guān)性分析

試驗(yàn)于2018年在貴州省蕎麥工程技術(shù)研究中心基地進(jìn)行，在苦蕎出苗后5、10、15 d對(duì)基部莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和基因表達(dá)分析，并鑒定差異表達(dá)基因（DEGs）。利用MeV軟件制作FtUTR基因的表達(dá)量熱圖，SPSS 19.0進(jìn)行FtUTR基因表達(dá)量的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎FtUTR基因及蛋白序列分析

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基因功能注釋與擬南芥AtUTR序列比對(duì)篩選到9個(gè)同源苦蕎FtUTR基因。如表1所示，苦蕎FtUTR序列在1 920～5 975 bp間，MaxORF的氨基酸殘基在81～352個(gè)間，分子量在8 780.03～39 287.30 u間，等電點(diǎn)在4.88～980間，疏水性在-0.200～0.728間，脂肪族氨基酸指數(shù)在72.35～111.03間。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)6個(gè)FtUTR的MaxORF跨膜結(jié)構(gòu)域在2～8個(gè)間，3個(gè)FtUTR的MaxORF蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。

對(duì)苦蕎FtUTR的MaxORF蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)苦蕎FtUTR的MaxORF蛋白序列一致性僅為19.14%。如圖1所示，9個(gè)蛋白間不存在完全共同保守位點(diǎn)，僅存在19個(gè)相對(duì)保守位點(diǎn)，說(shuō)明FtUTR間氨基酸序列差異較大。

2.2 苦蕎FtUTR蛋白序列分析

利用擬南芥AtUTR蛋白序列與苦蕎FtUTR蛋白序列進(jìn)行聚類分析，由圖2可知，擬南芥UTR1、UTR3與苦蕎FtPinG0001052700.01、FtPinG0001901300.01被聚為一小類;擬南芥UTR2與苦蕎FtPinG0001931400.01、FtPinG0006716700.01被聚為一小類;擬南芥UTR6與苦蕎FtPinG0006904300.01被聚為一小類;擬南芥UTR7與苦蕎FtPinG0003694100.01被聚為一小類;另外，苦蕎FtPinG0007731500.01、FtPinG0002689200.01和FtPinG0001931200.01被聚為一小類。

2.3 苦蕎莖發(fā)育過(guò)程中FtUTR基因的表達(dá)分析

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，檢測(cè)到9個(gè)FtUTR基因在苦蕎出苗后5、10、15 d莖中均有表達(dá)，DEGs鑒定發(fā)現(xiàn)5個(gè)FtUTR基因在不同時(shí)期莖中差異表達(dá)。由圖 3-A 可知，不同時(shí)期莖FtUTR基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)不一致，主要存在表達(dá)量逐漸升高、逐漸降低、先升高后降低以及相對(duì)變化幅度較小的4種變化類型。由圖3-B可知，1個(gè)苦蕎FtUTR差異表達(dá)基因（FtPinG0001931200.01）在出苗后5 d高表達(dá);2個(gè)苦蕎FtUTR差異表達(dá)基因（FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01）在出苗后10 d高表達(dá);2個(gè)苦蕎FtUTR差異表達(dá)基因（FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01）在出苗后15 d高表達(dá)，推測(cè)不同F(xiàn)tUTR基因可能在莖的特定發(fā)育階段發(fā)揮功能。

2.4 苦蕎FtUTR基因的相關(guān)性分析

對(duì)不同時(shí)期苦蕎莖FtUTR基因的表達(dá)量進(jìn)行

相關(guān)性分析，由表2可知，F(xiàn)tPinG0001931200.01與FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;FtPinG0002689200.01與FtPinG0001901300.01呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;FtPinG0001901300.01與FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;FtPinG0001052700.01與FtPinG0001931400.01呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

植物UTR蛋白介導(dǎo)的UDP-半乳糖跨膜運(yùn)輸對(duì)非纖維素多糖和糖蛋白合成具有重要作用[1-3，15]。基于擬南芥UTR序列，在作物中陸續(xù)開展了同源基因的相關(guān)研究。例如Seino等克隆得到了水稻OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3、OsUGT4，分別編碼350、337、345、358個(gè)氨基酸殘基[10]。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基因功能注釋與擬南芥UTR同源基因進(jìn)行比對(duì)，篩選到9個(gè)苦蕎FtUTR基因。其中，F(xiàn)tPinG0001052700.01、FtPinG0003694100.01、FtPinG0001931400.01FtUTR基因分別編碼332、339、352個(gè)氨基酸殘基，其余6個(gè)FtUTR基因的最長(zhǎng)開放閱讀框編碼氨基酸序列較短?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列較長(zhǎng)的FtUTR蛋白含有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，雖然3個(gè)FtUTR基因的MaxORF不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，不過(guò)它們的其他ORF編碼蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)域，因此，推測(cè)9個(gè)苦蕎FtUTR基因均能介導(dǎo)跨膜運(yùn)輸。

Seino等指出植物中存在多個(gè)UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因，但相互間進(jìn)化關(guān)系并不緊密[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎9個(gè)FtUTR蛋白間序列一致性僅為1914%，且不存在完全共同保守位點(diǎn)，僅含19個(gè)相對(duì)保守位點(diǎn)，說(shuō)明苦蕎不同F(xiàn)tUTR蛋白間序列保守性較低。不過(guò)，多個(gè)擬南芥AtUTR與苦蕎FtUTR被聚在一起，例如擬南芥AtUTR2與苦蕎FtPinG0001931400.01、FtPinG0006716700.01被聚為一小類，說(shuō)明不同物種間UTR蛋白的進(jìn)化關(guān)系較為緊密。

本研究發(fā)現(xiàn)苦蕎莖不同發(fā)育時(shí)期9個(gè)FtUTR基因表達(dá)量變化趨勢(shì)不一致，基于轉(zhuǎn)錄組差異基因分析共鑒定到5個(gè)DEGs，其中FtPinG0001931200.01在出苗后5 d高表達(dá);FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01在出苗后10 d高表達(dá);FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01在出苗后15 d高表達(dá)?？嗍w出苗后5 d，幼苗正處于子葉期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由地下種子向地上部分運(yùn)輸，10 d時(shí)幼苗正逐步完成由子葉期向真葉期的過(guò)渡，而 15 d時(shí)植株則完全進(jìn)入真葉期，因此，推測(cè)這些FtUTR可能在幼苗的特定發(fā)育階段發(fā)揮作用。另外，4個(gè)FtUTR基因在莖不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量無(wú)明顯變化，表明它們可能在幼苗發(fā)育過(guò)程中持續(xù)發(fā)揮作用。相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎中FtUTR基因中5個(gè)DEGs間存在多個(gè)顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的關(guān)系，而其余4個(gè)FtUTR基因與其他FtUTR基因間不存在顯著性相關(guān)，說(shuō)明這些DEGs間可能協(xié)調(diào)發(fā)揮功能或相互間存在功能互補(bǔ)現(xiàn)象。本研究為下一步深入探索苦蕎FtUTR調(diào)控UDP-半乳糖運(yùn)輸以及生長(zhǎng)發(fā)育提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zimowski J. Characterization of UDP-galactose：tomatidine galactosyltransferase from tomato （Lycopersicon esculentum） leaves[J]. Acta Biochimica Polonica，1994，41（2）：202-204.

[2] Bergenstrahle A，Tillberg E，Jonsson L. Characterization of UDP-glucose：solanidine glucosyltransferase and UDP-galactose：solanidine galactosyltransferase from potato tuber[J]. Plant Science，1992，84（1）：35-44.

[3]Norambuena L. Transport of UDP-galactose in plants[J]. Journal of Biological Chemistry，2002，277（36）：32923-32929.

[4]Sprong H，Degroote S，Nilsson T，et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose：ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum[J]. Molecular Biology of the Cell，2003，14（8）：3482-3493.

[5]Khalil M F，Kajiura H，F(xiàn)ujiyama K，et al. The impact of the overexpression of human UDP-galactose transporter gene hUGT1 in tobacco plants[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2010，109（2）：159-169.

[6]Reyes F，Marchant L，Norambuena L，et al. AtUTr1，a UDP-glucose/UDP-galactose transporter from Arabidopsis thaliana，is located in the endoplasmic reticulum and up-regulated by the unfolded protein response[J]. The Journal of Biological Chemistry，2006，281（14）：9145-9151.

[7]Bakker H，Routier F，Oelmann S，et al. Molecular cloning of two Arabidopsis UDP-galactose transporters by complementation of a deficient Chinese hamster ovary cell line[J]. Glycobiology，2005，15（2）：193-201.

[8]Rollwitz I，Santaella M，Hille D，et al. Characterization of AtNST-KT1，a novel UDP-galactose transporter from Arabidopsis thaliana[J]. FEBS Letters，2006，580（17）：4246-4251.

[9]Handford M，Rodríguez-Furlán C，Marchant L，et al. Arabidopsis thaliana AtUTr7 encodes a golgi-localized UDP-glucose/UDP-galactose transporter that affects lateral root emergence[J]. Molecular Plant，2012，5（6）：1263-1280.

[10]Seino J，Ishii K，Nakano T，et al. Characterization of rice nucleotide sugar transporters capable of transporting UDP-galactose and UDP-glucose[J]. Journal of Biochemistry，2010，148（1）：35-46.

[11]蘇 瑩，杜 強(qiáng)，郭崇炎，等. 水稻OsURGT1基因的生物信息學(xué)及表達(dá)譜分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2020，35（5）：1-10.

[12]梁詩(shī)涵，李 境，周 達(dá)，等. 中國(guó)苦蕎主產(chǎn)區(qū)苦蕎種質(zhì)形態(tài)性狀的遺傳多樣性分析[J]. 分子植物育種，2020，18（21）：7254-7266.

[13]國(guó)旭丹，王超楠，張 婧，等. 苦蕎抗氧化性與生長(zhǎng)條件的相關(guān)性[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2019，34（3）：19-23，37.

[14]李 俊，盧 揚(yáng)，趙 剛，等. 苦蕎芽苗茶飲料發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味及抗氧化活性的變化[J]. 食品與機(jī)械，2019，35（7）：187-192.

[15]Reyes F，León G，Donoso M，et al. The nucleotide sugar transporters AtUTr1 and AtUTr3 are required for the incorporation of UDP-glucose into the endoplasmic reticulum，are essential for pollen development and are needed for embryo sac progress in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal，2010，61（3）：423-435.