李夢杰，鮑翠玉，李 晶，劉 濤

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室；3.湖州師范學(xué)院；4.湖北科技學(xué)院附屬第二醫(yī)院)

脂毒性損傷已經(jīng)成為一個公共健康問題[1-2]，多項研究表明，如果游離脂肪酸水平較正常值顯著升高，心臟組織的脂質(zhì)沉積會增加[3-4]，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加[5]，這種過量的ROS可能會誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡和相關(guān)的心臟并發(fā)癥。因此，抑制心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的升高將是保護心肌免受脂毒性損傷的可行方法。之前的一項關(guān)于游離脂肪酸誘導(dǎo)心肌損傷的研究表明，游離脂肪酸能夠通過減弱氧化應(yīng)激有效抑制心肌細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，從而防止心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[6]?？紤]到這一點，我們擬使用某些抗氧化劑通過減輕氧化應(yīng)激來抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的增加，避免脂毒性心肌損傷。基于此，本研究中我們使用棕櫚酸(palmitic acid，PA)建立心肌細(xì)胞脂毒性損傷模型，檢測鞣花酸(ellagic acid)對心肌細(xì)胞脂毒性損傷的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

H9C2心肌細(xì)胞購自上海通派生物有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和膠原酶均購自Gibco；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購自Dojindo Molecular Technologies，Inc。ROS測定試劑盒由Applygen Technologies，Inc.提供。磷酸化AMPK(p-AMPK)、總AMPK、p-哺乳動物雷帕霉素復(fù)合靶點-1(p-mTORC1)、總mTORC1、p-p70核糖體蛋白S6激酶(p-p70S6K)、總p70S6K和β-actin多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司。MTT檢測試劑盒購自Sigma-Aldrich公司。PA、鞣花酸及其他試劑均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT檢測細(xì)胞增殖

用2.25g/L葡萄糖、10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素的DMEM，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞。將H9C2細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，孵育24h后，細(xì)胞分組給藥，37℃下進行孵育，孵育結(jié)束后每個孔加入MTT，在37℃下孵育4h后丟棄培養(yǎng)基。每個孔加入150μL的DMSO，震蕩混勻后，用分光光度計測量570nm處的吸光度。實驗重復(fù)3次。

1.2.2 ROS水平檢測

我們用Dihydroethidium(DHE)(ex=535nm，em=610nm)檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子。H9C2細(xì)胞接種于6孔板(2×104個細(xì)胞/孔)中，培養(yǎng)24h，細(xì)胞貼壁后，分組給藥，即分別在37℃暴露于PA(0.2mmol/L)或PA(0.2mmol/L)+鞣花酸(1、20、100μmol/L)中孵育24h。然后用冷PBS洗滌細(xì)胞，在37℃下，細(xì)胞加入DAPI孵育20min，進行細(xì)胞核染色，熒光顯微鏡用于觀察熒光信號的強度。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 主要生化指標(biāo)的測定

MDA屬于細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的評價指標(biāo)，SOD屬于細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激衰減程度的評價指標(biāo)。為了檢測兩個指標(biāo)的變化，將H9C2細(xì)胞分為不同給藥組孵育24h，即PA(0.2mmol/L)或PA(0.2mmol/L)+鞣花酸(1、20、100μmol/L)。孵育結(jié)束后，細(xì)胞用RIPA裂解緩沖液裂解，4℃離心收集上清，檢測蛋白含量。取100μL的上清，加入200μL的MDA測試溶液，混合后煮沸15min，冷卻至室溫，在4℃，12 000g離心10min。在96孔板上加入200μL上清液，使用酶標(biāo)儀測定532nm處的吸光度。實驗重復(fù)3次。

另一組實驗中，為了檢測SOD，將分組給藥的細(xì)胞均質(zhì)化，并將所得勻漿在4℃離心收集上清，檢測蛋白含量。向離心管中添加20μL上清液和160μL NBT/酶工作液，并在4℃下孵育5min。然后將混合物加入20μL的反應(yīng)起始工作液中，在37℃下孵育30min。使用上述相同的酶標(biāo)儀檢測560nm處吸光度。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)

將培養(yǎng)24h的H9C2細(xì)胞分為不同給藥組，即PA(0.2mmol/L)或PA(0.2mmol/L)+鞣花酸(1、20、100μmol/L)，然后用RIPA裂解緩沖液裂解30min，在4℃離心收集上清，檢測蛋白含量。用SDS-PAGE(8%～12%)進行蛋白的電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1h后，加入以下抗體進行孵育(均以1∶1 000稀釋)：p-AMPK(#2535)，AMPK(#5831)，p-mTORC1(#5536)，mTORC1(#2972)，p-p70S6K(#9209)，p70S6K(#9202)和β-actin(#4970)。一抗孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶連接的兔抗鼠IgG(ab6728；1∶2 000，Abcam)室溫下孵育2h。最后，用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)對蛋白進行顯影，并用圖像分析軟件(GeneTools；SynGene)進行定量分析。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

GraphPad Prism v5軟件中單向方差分析和Tukey檢驗用于統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 鞣花酸對PA誘發(fā)的H9C2細(xì)胞增殖損傷的影響

將不同濃度的PA與H9C2細(xì)胞孵育，通過測量細(xì)胞增殖來觀察PA誘導(dǎo)的細(xì)胞脂毒性損傷，結(jié)果如圖1A和B所示。當(dāng)PA濃度>0.1mmol/L時，或當(dāng)PA刺激時間>24h時，細(xì)胞增殖能力均開始急劇下降。這些數(shù)據(jù)表明，當(dāng)PA濃度或刺激時間超過一定閾值時，PA會導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)損傷。基于這些結(jié)果，我們認(rèn)為將PA濃度設(shè)為0.2mmol/L，刺激時間設(shè)為24h，可以成功建立PA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型，以供后續(xù)實驗使用。圖1C說明，鞣花酸能夠有效地抵抗PA誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，與PA組相比，PA+鞣花酸組細(xì)胞增殖率出現(xiàn)隨鞣花酸濃度依賴性上升趨勢，尤其在鞣花酸濃度為20μmol/L以上時開始差異顯著(P<0.01)?？梢姡坊ㄋ峥梢杂行ё钄郟A誘發(fā)的心肌細(xì)胞增殖能力的損傷。

2.2 鞣花酸對PA誘發(fā)的細(xì)胞ROS水平、MDA含量和SOD活性的影響

使用DHE作為熒光探針檢測PA誘導(dǎo)的ROS水平，如圖2(封二)所示，與對照組相比，PA給藥組細(xì)胞顯示更強的紅色熒光，這意味著PA可以誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著的升高。另一方面，與PA組相比，PA+鞣花酸組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光出現(xiàn)明顯的降低，表明鞣花酸可以阻止細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，如圖3A所示，表明鞣花酸可以顯著抑制PA誘發(fā)的ROS水平升高(P<0.05)。圖3B、3C表明，PA誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)MDA的大量增加，同時導(dǎo)致SOD活性顯著降低(P<0.05)，并且這種變化與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的升高密切相關(guān)。與這些觀察結(jié)果相反，20μmol/L鞣花酸可以顯著抑制MDA的增加，調(diào)節(jié)SOD活性，使這兩個典型指標(biāo)恢復(fù)到正常細(xì)胞水平。

與control組比較，*P<0.05；與PA組比較，#P<0.05(n=3)

2.3 鞣花酸保護心肌細(xì)胞免受PA脂毒性損傷的可能機制

AMPK通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、氧化應(yīng)激和凋亡中起著重要作用。我們用免疫印跡法分別檢測了細(xì)胞中AMPK和p-AMPK以及關(guān)鍵下游蛋白(p-mTORC1和p-p70S6K)的表達(dá)水平。如圖4A所示，與對照組相比，PA組p-AMPK明顯降低，p-mTORC1和p-p70S6K明顯增加，而三個蛋白的總蛋白表達(dá)無顯著改變；另一方面，PA+鞣花酸組p-AMPK、p-mTORC1和p-p70S6K均恢復(fù)到對照組水平。圖4B數(shù)據(jù)表明，鞣花酸能夠抵消PA所致p-AMPK、p-mTORC1和p-p70S6K水平的異常變化。以上結(jié)果提示，鞣花酸可通過AMPK途徑保護心肌細(xì)胞免受脂毒性損傷。

與control組比較，*P<0.05；與PA組比較，#P<0.05(n=3)

3 討 論

心肌梗死是一種急性的致命性的心臟病[7]，高脂血癥通過促進心臟過度氧化應(yīng)激的誘發(fā)，參與了高脂致心臟損傷的發(fā)病過程，進而導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。高脂血癥與ROS的過度生成和抗氧化防御系統(tǒng)的受損密切相關(guān)[6]，ROS生成和ROS清除系統(tǒng)之間平衡的破壞將使細(xì)胞內(nèi)的超氧離子過度積累，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙和損傷。鑒于此，目前各種類型的抗氧化劑在治療高脂血癥方面被廣泛研究[8]。鞣花酸屬于一種天然的抗氧化保護劑[9]，它可以消除過量的ROS，增強抗氧化防御能力[10-11]。在本研究中，PA可以明顯增加心肌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS及MDA的水平，并明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激超氧化物歧化酶SOD的水平，而鞣花酸能顯著阻斷PA所致心肌細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA及SOD的變化。另一組數(shù)據(jù)證實，PA明顯降低心肌細(xì)胞增殖率，預(yù)處理鞣花酸明顯改善PA所致心肌細(xì)胞增殖下降。以上數(shù)據(jù)說明，鞣花酸可以明顯抑制PA所致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

高脂血癥的發(fā)生與多種因素有關(guān)[12]，這些因素包括NADPH氧化酶產(chǎn)生超氧物、氧化磷酸化、蛋白激酶C水平異常、多元醇激活和己糖胺途徑。研究表明[6]，AMPK通路在調(diào)節(jié)高脂血癥并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。眾所周知，AMPK是一種關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶[13-15]，它不僅可以調(diào)節(jié)涉及脂肪酸和葡萄糖的細(xì)胞代謝，還可以調(diào)節(jié)抗凋亡過程。激活A(yù)MPK可以防止PA誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體斷裂和功能障礙。基于這些研究結(jié)果，本研究旨在探討AMPK通路與心肌細(xì)胞脂毒性損傷的關(guān)系，并探討鞣花酸是否也能通過激活A(yù)MPK保護心肌細(xì)胞免受脂毒性損傷。本研究中，PA可以明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)p-AMPK，增加p-mTORC1和p-p70S6K水平，而預(yù)處理鞣花酸組，p-AMPK、p-mTORC1和p-p70S6K均可以恢復(fù)到對照組水平。這個數(shù)據(jù)說明，鞣花酸能夠通過激活p-AMPK升高到正常水平來抑制p-mTORC1和p-p70S6K，從而保護心肌細(xì)胞免受PA的脂毒性損傷。

綜上所述，鞣花酸能夠抑制PA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，同時通過激活p-AMPK，降低p-mTORC1和p-p70S6K的表達(dá)，參與心肌細(xì)胞抗脂毒性損傷的作用過程，從而證實了鞣花酸具有預(yù)防心肌脂質(zhì)毒性損傷的潛力。本研究主要集中在體外實驗的各種檢測，在下一步研究中，我們將用體內(nèi)實驗進一步證明鞣花酸對心肌的保護作用。