柯欽豪，馬慧敏，曹 琴，王世越，周宏福，鄭 敏

(湖北科技學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

植物多糖由十個以上單糖通過糖苷鍵連接而成，能通過水提取、超聲波提取、堿提取、酶輔助提取、微波輔助提取和超臨界流體萃取[1]等方法獲得。研究報道，植物多糖具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗氧化[2]等多種生物活性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健行業(yè)。但提取純化后的植物多糖仍然是一個含有多種多糖的混合體系，對后續(xù)的定性等結(jié)構(gòu)表征分析及生物活性分析帶來很大的影響，所以，植物多糖的分離為多糖研究的重要部分。目前為止，植物多糖的分離分為初步分離和精細(xì)分離，初步分離的方法包括鹽析法、分級沉淀法、膜分離法等；精細(xì)分離的方法包括凝膠柱色譜法、離子交換柱色譜法、離子交換柱色譜和凝膠柱色譜聯(lián)用法、親和色譜法、高效逆流色譜法等。我們以近十年植物多糖分離的相關(guān)研究成果作為基礎(chǔ)，對植物多糖的分離進(jìn)行綜述，為深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 初步分離

多糖是聚合程度不同的物質(zhì)的混合體系，其分子量范圍從幾千到幾千萬，其純度用“均一多糖”來表示，不同于一般化合物，“均一多糖”為一定分子量范圍的均一組分，代表某一多糖的相似鏈長的平均分布。

多糖的分離就是將多糖這一混合體系分離成成分更加均一的多糖，其中分離方法較為粗獷的為初步分離，主要有鹽析法、分級沉淀法、膜分離法等。

1.1 鹽析法

鹽析法分離多糖常用到季銨鹽，季銨鹽為一種乳化劑，在水中能形成陽離子，可與酸性多糖陰離子形成不溶于水的沉淀，再經(jīng)過過濾就得到了中性及堿性多糖溶液和酸性多糖沉淀，再向溶液中加入堿性物質(zhì)如硼砂緩沖液，則中性多糖沉淀，最終可以得到酸性多糖、中性多糖及堿性多糖。

鹽析沉淀后，可以取沉淀和上清，分別濃縮，得到兩個多糖組分，如張瑞妮等[3]將提取得到的柿子多糖與3%的十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)混勻，靜置得到沉淀和上清兩個多糖組分。秦垂新等[4]以中藥口服液為原料，利用CTAB沉淀法，得到了沉淀酸性多糖組分和上清中性多糖組分。還可以沉淀后只取沉淀的多糖組分，如何偉珍等[5]用季銨鹽沉淀法分離銀耳多糖。沉淀多糖的物質(zhì)也可以是十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)的堿(CTA-OH)和十六烷基吡啶。同樣可以用硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鉀等進(jìn)行鹽析分離多糖。還有金屬絡(luò)合物法，也可以將多糖沉淀出來，如用費林溶液、氯化銅、氫氧化鋇、醋酸鉛等[6]。鹽析法操作簡單，節(jié)約成本，根據(jù)多糖酸堿性分離多糖，但不足之處是分離后得到的多糖組分均一性不夠高，只適用于多糖的初步分離。

1.2 分級沉淀法

多糖在甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑中的溶解度與多糖的分子量、聚合度及有機(jī)溶劑的濃度等因素有關(guān)，有機(jī)溶劑會破壞多糖的氫鍵，進(jìn)而破壞多糖的二級結(jié)構(gòu)，使多糖的溶解度降低。一般隨著有機(jī)溶劑濃度的增加，多糖會按分子量從大到小依次被沉淀下來，這種分離多糖的方法就叫分級沉淀法。

乙醇毒性小且可回收，為分級沉淀法較常用的有機(jī)溶劑。景永帥等[7]向熱水浸提的多糖濃縮液中加入一定體積的乙醇，使乙醇終濃度為30%、50%及70%，依次得到了不同乙醇濃度下沉淀的多糖。分級沉淀法的特點與鹽析法類似，分離后得到的多糖組分均一性不夠高，不同之處為分級沉淀法分離得到的多糖分子量接近，而鹽析法分離得到的多糖酸堿性接近。

1.3 膜分離法

以選擇透過性膜為分離介質(zhì)，多糖或其中的雜質(zhì)在壓力差、化學(xué)位差或電位的推動力作用下，將能透過膜的和不能透過膜的成分分開。根據(jù)選擇透過性膜孔徑由大到小可分為微濾、超濾、納濾和反滲透膜。其中超濾還可以進(jìn)一步選擇可通過的物質(zhì)的分子量，進(jìn)而對多糖進(jìn)行分離，而且還可以除去粗多糖中的鹽及小分子物質(zhì)。

Du 等[8]通過微孔超濾系統(tǒng)，用500、100、10kDa分子量的選擇透過性膜對多糖進(jìn)行過濾，依次得到了較純的銀耳多糖組分TAP50w、TAP10-50w、TAP1-10w。還可以通過微濾法，除去粗多糖中比膜孔大的微粒及微生物。膜分離法成本低，操作簡單，節(jié)能環(huán)保，可在室溫下進(jìn)行，缺點是部分多糖對濾膜有一定的吸附作用。

2 精細(xì)分離

2.1 凝膠柱色譜法

凝膠是一種特殊的分散體系，其中，膠體粒子或高分子形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)間隙充滿了作為分散介質(zhì)的液體。凝膠又可分為彈性凝膠和脆性凝膠。彈性凝膠失去分散介質(zhì)后體積顯著縮小，吸收分散介質(zhì)后體積又顯著膨脹，如明膠、聚酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚酰胺葡聚糖凝膠、葡聚糖瓊脂糖凝膠等，這類凝膠使用前常需要進(jìn)行活化及緩沖液浸泡。脆性凝膠失去或吸收分散介質(zhì)，其性狀和體積均不發(fā)生改變，如硅膠等。凝膠根據(jù)分子篩原理分離物質(zhì)，含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)色譜柱時，大分子物質(zhì)由于直徑較大，只能通過顆粒之間的間隙向下移動，速度較快。小分子物質(zhì)還可進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，在向下移動的過程中，從一個凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒的微孔，速度較慢，即小分子物質(zhì)的下移速度慢于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，分子小的后流出。

2.1.1 瓊脂糖凝膠柱色譜法

瓊脂糖是半乳糖的線性多聚物，溶于水后在35℃～40℃時形成良好的半固體狀凝膠。Lin等[9]通過Sepharose 6B凝膠柱色譜法將番石榴種子粗多糖分離出了3種蛋白質(zhì)多糖。瓊脂糖還為一種強(qiáng)陰離子型凝膠，能夠結(jié)合酸性多糖。瓊脂糖不但能將脂多糖和一般多糖分離，還能夠?qū)⒅嗵桥c色素進(jìn)行分離，如陳正行[10]分離米糠多糖得到了純度99.5%純度的米糠脂多糖。崔杰等[11]將得到的莼菜多糖1和莼菜多糖3進(jìn)行純化時使用瓊脂糖凝膠柱Sepharose CL-6B，證明了莼菜多糖1和莼菜多糖3組分較為均一。

2.1.2 葡聚糖凝膠柱色譜法

葡聚糖凝膠是葡聚糖和甘油基交聯(lián)形成的一類凝膠。梁宇芝等[12]將羊肚菌胞內(nèi)多糖與胞外多糖分別用葡聚糖凝膠G-100柱分離，均得到了5個多糖組分。吳金松等[13]將得到的信陽毛尖茶多糖用濃度梯度的NaCl洗脫Sephadex-G100葡聚糖凝膠柱，得到了3個多糖組分，然后再用Sephadex-G150葡聚糖凝膠柱進(jìn)行多糖純度的鑒定，最終得到了一種純度為92.4%的多糖。瓊脂糖凝膠柱色譜法和葡聚糖凝膠柱色譜法所需設(shè)備簡單、操作方便、不需有機(jī)溶劑，且對多糖及其他高分子物質(zhì)有很好的分離效果，應(yīng)用廣泛。

2.2 離子交換柱色譜法

DEAE(二乙基氨基乙基)與不溶性的葡聚糖、瓊脂糖或纖維素等交聯(lián)結(jié)合后，形成DEAE-纖維素和DEAE-瓊脂糖凝膠等，DEAE在水中可形成不溶性的陽離子物質(zhì)，對不同多糖在水中電離產(chǎn)生的陰離子的吸引力不同，通過增強(qiáng)洗脫溶劑的離子強(qiáng)度或改變洗脫溶劑的pH值，可以依次按與離子交換柱吸引力從弱到強(qiáng)的順序洗脫出不同的多糖。此方法適合用來分離中性多糖和酸性多糖，常用的洗脫溶劑為濃度梯度的NaCl水溶液等。

DEAE-纖維素適合用來分離酸性多糖、中性多糖和粘多糖，多糖對DEAE的吸附力隨著多糖酸性基團(tuán)的增多而增強(qiáng)，用濃度梯度的鹽溶液或堿性溶液洗脫，即可依次得到不同酸性的多糖。Li等[14]通過DEAE-52纖維素色譜柱，分別用0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8mol/L的NaCl溶液洗脫熱水浸提、超聲輔助提取及酶提取法提取得到的kurome昆布多糖，均得到了6個多糖組分。

劉衛(wèi)寶等[15]將得到的黃芪粗多糖用DEAE瓊脂糖凝膠柱DEAE Fast low進(jìn)行分離，得到了兩個純化的多糖組分。孟祥勇等[16]將得到的黃酒多糖用DEAE-Sepharose FF色譜柱進(jìn)行分離純化，得到了3種黃酒多糖組分。這種分離多糖的方法污染小，分離出來的多糖純度高，不足之處是洗脫液體積大，后處理較為麻煩費時。

2.3 離子交換柱色譜法和凝膠柱色譜聯(lián)用法

近年來越來越多的文獻(xiàn)報道，先通過DEAE色譜柱將植物多糖分離成若干個組分，然后再用凝膠柱色譜法進(jìn)行進(jìn)一步的分離或純化。如裴若楠等[17]先用DEAE-52離子交換層析柱分離得到石花菜多糖1，然后用Sephadex G-200層析柱進(jìn)一步純化多糖。這種兩種色譜柱聯(lián)用的方法，能得到分離更徹底的多糖組分，分離效果佳，得到的多糖組分多為均一多糖。

2.4 親和色譜法

生物分子間存在很多特異性的結(jié)合力，這樣一對的分子常稱為配體與受體，配體與受體的這種結(jié)合力又被稱為親和力。親和色譜就是將配體以共價鍵固定在不溶性基質(zhì)中，再將不溶性基質(zhì)裝填成色譜柱，用含有受體的溶液洗脫色譜柱時，受體會被吸附在固定相上，其他物質(zhì)被洗脫下來，再用適當(dāng)?shù)南疵撘簩⑹荏w洗脫下來，就得到了只含有受體和洗脫液的物質(zhì)，進(jìn)而分離得到只含有受體的單一成分。

王啟龍[18]首先將酰化的CNTm(復(fù)壁碳納米管)與硅烷化的硅膠(SiO2)反應(yīng)制成CNTm@SiO2復(fù)合物，然后將人單核細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞(Mφ)通過蔗糖濃度梯度溶液超速離心法獲得脂筏，冰水浴條件下向Mφ脂筏溶液及XOD(黃嘌呤氧化酶)中加入CNTm@SiO2復(fù)合物，就分別得到了Mφ@CNTm@SiO2和XOD@CNTm@SiO2親和色譜柱裝柱材料。低壓裝柱后，篩選多糖的免疫活性，分別篩選出了7種與Mφ及XOD有免疫活性的植物多糖。路垚等[19-20]發(fā)現(xiàn)金銀花多糖能與凝集素發(fā)生凝集反應(yīng)，推測能與凝集素發(fā)生凝集反應(yīng)的就是活性多糖，于是以蓖麻油凝集素為親和載體，制備親和色譜柱，并得到了由3種不同分子量混合而成的親和活性多糖。親和色譜法除了可以用來分離多糖，還可以除去多糖中特有的雜質(zhì)，如張娟娟等[21]用Affi-Prep Polymyxin柱親和色譜除去魚腥草總多糖中的內(nèi)毒素。親和色譜法的優(yōu)點是分離得到的多糖組分有較好的同等生物活性，適合用來進(jìn)行生物活性實驗，缺點是色譜柱的制作較為復(fù)雜，技術(shù)難以掌握，所以使用并不廣泛。

2.5 高效逆流色譜法

高效逆流色譜法發(fā)展自多級萃取技術(shù)，通過自轉(zhuǎn)和公轉(zhuǎn)(同步行星式運動)產(chǎn)生的二維力場使兩相容劑萃取頻率及效率大為提高。不相溶的上下兩相平衡溶液在螺旋管內(nèi)交替分布，當(dāng)螺旋管高速轉(zhuǎn)動時兩相溶液分別占據(jù)螺旋管的兩端(首端與尾端)，將首端溶液從尾端注入后會迅速回到首端，不斷地進(jìn)行萃取，最終根據(jù)分配系數(shù)的不同實現(xiàn)樣品的分離[22]?，F(xiàn)有的高效逆流色譜儀上樣量從數(shù)十微克到數(shù)十克不等，且其分析能力可與高效液相色譜相媲美，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于花色苷、多糖及其他天然產(chǎn)物的分離純化[23]。

Yu等[24]利用高效逆流色譜純化Anoectochilus roxburghii(wall)多糖，得到了純度為95.01%的多糖。王曉麗等[25]根據(jù)分配系數(shù)測定實驗，得出了當(dāng)聚乙二醇∶磷酸二氫鉀∶磷酸氫二鉀∶水比例為5∶15∶15∶65時加入2%NaCl，可分離蘆薈粗多糖得到兩個多糖組分，經(jīng)葡聚糖凝膠柱色譜及凝膠滲透色譜分析，確定這兩個多糖組分的成分均一。此方法不會用到任何的固態(tài)支撐體，不會造成樣品被污染、生物活性改變，而且避免了分離的物質(zhì)被固相載體吸附導(dǎo)致樣品的損失，并且有機(jī)溶劑使用少，可同時實現(xiàn)純化和分離，具有重現(xiàn)性好、操作簡單、用時較短的優(yōu)點。

3 展 望

通過綜述以上多糖的分離方法，發(fā)現(xiàn)各有特點。鹽析法和分級沉淀法分離操作簡單，所用耗材試劑常見，但其分離的組分常純度不夠，無法得到均一多糖。膜分離法操作簡單，分離效果也較好，但對多糖有一定的選擇性，部分多糖容易黏附膜孔，采用此法時分離效果不佳。凝膠柱色譜法分離效果較好，能分離出不同分子量范圍的多糖，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用。離子交換柱色譜法可以根據(jù)多糖酸堿性的不同分離多糖，也較常用。凝膠柱色譜法及離子交換柱色譜法分離多糖效果均較好，常進(jìn)行聯(lián)用，以取得更好的分離效果，現(xiàn)應(yīng)用較廣泛。親和色譜法為近年來發(fā)展起來的根據(jù)多糖對生物細(xì)胞或組織的親和特性，將多糖進(jìn)行分離，分離效果好，并且尤其適合用分離出來的多糖進(jìn)行生物實驗，但缺點是色譜柱的制作方法較為復(fù)雜，難以掌握。高效逆流色譜法分離多糖的方法用時較其他方法較為短暫，并且分離效果好，重現(xiàn)性好，但缺點是分離設(shè)備昂貴，難以普及。

隨著近年來植物多糖被研究得越來越深入，多糖在醫(yī)療上的價值越來越高。但多糖是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，為聚合程度不同的物質(zhì)的混合物，而且多糖還可以與蛋白質(zhì)、油脂類以糖苷鍵結(jié)合成為糖蛋白、脂多糖等。所以，操作簡單、分離效果好的多糖分離方法尤為關(guān)鍵。隨著各種多糖分離技術(shù)在研究中的應(yīng)用，越來越多具有生物活性的多糖被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行分離純化，相信隨著對多糖研究的進(jìn)一步深入，多糖的結(jié)構(gòu)及藥效關(guān)系會取得進(jìn)一步的闡明，植物多糖的開發(fā)和應(yīng)用會得到不斷拓寬和發(fā)展，以便于更好地應(yīng)用于食物、保健及醫(yī)藥領(lǐng)域。