長枝木霉引發(fā)靈芝綠霉病的快速檢測體系的建立

李承達 張亞鑫 劉權(quán)德 唐玉琴

摘 ? ?要：為建立一種由長枝木霉引發(fā)靈芝綠霉病的快速檢測體系，通過對形態(tài)特征及致病性的測定確定病原菌菌株，針對病原菌的特異性基因設(shè)計合成引物，對引物進行特異性和靈敏度試驗，再對接種過病原菌的土壤進行靈敏度驗證。結(jié)果表明，病原菌為長枝木霉，設(shè)計的引物具有較高的特異性，檢測濃度下限為10-2 ng·μL-1;可從含有4.28×106個孢子的1 g土壤中擴增出條帶。相比較于傳統(tǒng)的檢測方法耗時更短，結(jié)果檢測性高，具有高特異性和靈敏度。

關(guān)鍵詞：長枝木霉;靈芝;快速檢測

中圖分類號：S435.673 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.07.014

Abstract： In order to establish a rapid detection system of green mold on Ganoderma lingzhi caused by Trichoderma longibrachiatum，the identification of the pathogen strains was based on determining of morphological and pathogenic characteristics. The study designed and synthesized primers aiming at the specific genes of pathogens， and then carried out specificity and sensitivity tests on the primers. The soil inoculated pathogens were also tested. The results indicated that the pathogen was Trichoderma longibrachiatum. The designed primers have high specificity and the minimum testing concentration was 10-2 ng·μL-1. In the polymerase chain reaction （PCR） for Genomic DNA of soil inoculated pathogens， products occurred in the 1 g soil contained 4.28×106 spores with the designed primers. Compared with the traditional detection methods， the system is more accurate and costs less time.

Key words： Trichoderma longibrachiatum; Ganoderma lingzhi; rapid detection

靈芝（Ganoderma lingzhi）屬擔子菌門傘菌綱多孔菌目靈芝科[1]。靈芝是我國傳統(tǒng)名貴藥材，具有多種生理活性和藥理作用[2]。中國人工栽培靈芝已有60多年歷史， 主要分布在四川、山東、廣東、廣西、福建、江西、浙江及吉林等地，栽培模式主要以覆土栽培為主[3]。近年來，靈芝市場需求大約每年在以18%～30%的速度增長[4]，2015年我國靈芝栽培面積已達到1萬hm2， 靈芝及孢子粉產(chǎn)量約12萬t， 產(chǎn)值16億美元，分別約占全球的75%和30%，已成為世界上靈芝的主要生產(chǎn)和出口國[5]。隨著靈芝市場的走俏，其栽培從業(yè)者與日俱增，隨之發(fā)生的病害也作為一個重要的研究方向來開展。靈芝菌絲體生長初期顏色潔白、濃密，綠霉染病初期菌絲體為灰白色、致密，因此早期病害特征肉眼難以辨別。當菌椴顏色逐漸變?yōu)闇\綠直至深綠色時，輕者導(dǎo)致靈芝減產(chǎn)，重者則絕收。且連作過程中土壤積累的有害微生物導(dǎo)致靈芝老產(chǎn)區(qū)綠霉菌源較多，造成靈芝子實體生長緩慢、子實體變小、畸形等現(xiàn)象[6]。因此，要盡量避免重茬地栽培，3年內(nèi)不宜再次栽培[7]，病害發(fā)生嚴重影響了生產(chǎn)者的積極性。目前對于綠霉病傳統(tǒng)的檢測方法，存在著檢測準確度低、耗時長、環(huán)境要求苛刻等缺點[8]。而中國對于靈芝綠霉病分子檢測的研究僅見黃鑫偉等[9]2018年中對側(cè)耳木霉進行了快速檢測體系的建立。因此，本研究擬建立一種針對于由長枝木霉所引發(fā)的靈芝綠霉病的快速檢測體系，從而在今后的靈芝栽培和靈芝綠霉病的防治中提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

供試 菌株：XU0177—長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）、XU0032—深綠木霉（Trichoderma atroviride）、XU0052—擬康寧木霉（Trichoderma koningiopsis）、XU8130—側(cè)耳木霉（Trichoderma pleuroticola）、XU8074—哈茨木霉（Trichoderma harzianum）均為吉林農(nóng)業(yè)科技學院菌物資源開發(fā)與利用實驗室分離、鑒定后保藏備用。

試劑及儀器：CTAB、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇，馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，去離子水定容至1 000 mL。C-96 G基因擴增儀，杭州龍揚科學儀器有限公司;JY 600電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)特征及致病性的測定 將保存的菌株XU0177（分離自吉林市左家鎮(zhèn)靈芝生產(chǎn)基地靈芝病原木霉）接種在PDA培養(yǎng)基中25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。觀察菌落形態(tài)以及菌株產(chǎn)色素情況，并在光學顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子梗、分生孢子大小、形態(tài)等顯微特征。菌株致病性的測定方法依據(jù)植病研究法[10]進行測定。

1.2.2 RNA polymerase II second largest subunit（rDNA-RPB2）基因序列分析 用改良的CTAB法提取病原菌菌株基因組DNA。擴增引物為fRPB2-5F（GAYGAYMGWGATCAYTTYGG）和bRPB2-7R2（ACYTGRTTRTGRTCNGGRAANGG）[11]，引物均由華大基因科技有限公司合成。50μL PCR反應(yīng)體系：2× Es Taq MasterMix（Dye）25 μL、10 μmol·L-1上下游引物各1 μL、病原菌菌株基因組DNA模板10 μL、無菌ddH2O 13 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后， 由華大基因科技有限公司測序，利用MEGA 7.0軟件以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 系統(tǒng)樹分支的可信度用Bootstrap檢測，1 000次重復(fù)。

1.2.3 引物設(shè)計與合成 將菌株XU0177與其他5種長枝木霉、哈茨木霉、擬康寧木霉、深綠木霉、側(cè)耳木霉的rDNA-RPB2序列進行比對，針對菌株XU0177 通過RPB2所擴增的特異性基因，依據(jù)引物設(shè)計原則應(yīng)用Permier 5.0軟件設(shè)計引物：0177-2-1：5′-CCGAGCTGGCCAACTATTTGAGACGT-3′;0177-2-2：5′-TTCAAGCCGTTGGAGAGCGTGCC-3′，引物特異性初步驗證在GeneBank中進行，引物均由華大基因科技有限公司合成。

1.2.4 引物的特異性及靈敏度試驗 ? ?以菌株XU0177、側(cè)耳木霉、哈茨木霉、擬康寧木霉、深綠木霉的DNA作為特異性試驗的模板，與引物0177-2-1/0177-2-2進行特異性驗證，50 μL PCR反應(yīng)體系：2× Es Taq MasterMix（Dye）25 μL、10 μmol·L-1上下游引物各1 μL、病原菌菌株基因組DNA模板10 μL、無菌ddH2O 13 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取6 μL PCR產(chǎn)物與2 μL loading buffer混合，加入到瓊脂糖凝膠加樣口中，以DNA Mraker作為參照。電壓調(diào)至恒壓100 V，30 min后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，并拍照保存。試驗重復(fù)3次。將提取得到的XU0177菌株DNA用無菌ddH2O 10倍梯度稀釋至10-1 ，10-2，

10-3，10-4，10-5 ng·μL-1，各取10 μL作為靈敏度檢測的模板，用同上述相同的PCR反應(yīng)體系進行引物靈敏度試驗。試驗重復(fù)3次。

1.2.5 土壤中病原菌的檢測 配制4.28×107個·mL-1分生孢子懸浮液，并以10倍濃度梯度連續(xù)稀釋5次。取1 mL孢子懸液分別與10 g土壤均勻混合，分別獲得每克土壤中含有4.28×106，4.28×105，4.28×104，4.28×103，4.28×102個孢子的接種土壤[12]。通過Ezup Column Soil DNA Purification Kit試劑盒（生工生物工程股份有限公司）對土壤微生物基因組DNA進行提取，用同上述相同的PCR反應(yīng)體系進行引物試驗，并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳來進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征及致病性

菌株XU0177的菌落于25 ℃黑暗條件下在PDA培養(yǎng)基上菌落初期為綠灰色，后期為深綠色;分生孢子堆深綠色，有時有白色的雜斑點。菌落背面初期為無色，后期由于菌株產(chǎn)生黃色的可擴散性色素，導(dǎo)致背面成黃色（圖1—圖2）。分生孢子橢圓形至細長橢圓形，大小為3.2～5.3 μm × 2.2～3.5 μm。致病性的結(jié)果與Zhang等[13]2019年研究結(jié)果相一致。初步確定該病原菌為長枝木霉。基于菌株XU0177的rDNA-RPB2基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)與長枝木霉序列同源性為100%，聚為一支，最終確定菌株XU0177為長枝木霉（圖3）。

2.2 特異性試驗

根據(jù)特異性驗證結(jié)果表明， 設(shè)計的引物0177-2-1/0177-2-2具有高度的特異性， 僅菌株XU0177 DNA模板的反應(yīng)中擴增出大小為98 bp的特異性目的條帶（圖4）， 而其他5種常見導(dǎo)致靈芝綠霉病的菌株均未出現(xiàn)特異性條帶。

2.3 靈敏度試驗

靈敏度試驗結(jié)果表明，將模板DNA稀釋至10-1，

10-2 ng·μL-1后仍能擴增出目的性條帶，雖有少量雜帶出現(xiàn)，但通過只添加引物的對照性試驗和膠回收處理可知，少量雜帶的出現(xiàn)并非是引物二聚體引起的，可能是因為小分子的存在，所以該研究檢測濃度的下限為10-2 ng·μL-1（圖5）。

2.4 土壤中病原菌的檢測

采用人工接種的土壤樣本對已建立的PCR檢測體系進行有效性及靈敏度驗證，每克土壤中含有4.28×106個孢子時引物能擴增出條帶，而在其他的土壤樣本中未見擴增條帶。由此可知，該引物對土壤中長枝木霉孢子檢測靈敏度為4.28×106個· g-1（圖6）。3 結(jié)論與討論

對于難以分離和純化的病原真菌來說，病原真菌的早期發(fā)現(xiàn)和準確檢測對靈芝栽培業(yè)具有重要參考意義。傳統(tǒng)的分離、檢測方法由于限制因素過多且很難在病原菌早期侵染時作出及時、準確的鑒定，而分子生物學檢測方法可以對病原真菌進行早期檢查，及時控制病原菌的傳播并且防止病害的流行。

本研究主要目的是建立由長枝木霉引發(fā)的靈芝木霉病的快速檢測體系。研究結(jié)果表明，根據(jù)rDNA-RPB2基因序列的分析設(shè)計引物，0177-2-1和0177-2-2對所研究的目標菌株存在特異性，對其他近似種的菌株無特異性。凝膠成像系統(tǒng)中觀察發(fā)現(xiàn)存在少量條帶，但并不影響引物的特異性，在后續(xù)研究中可以進一步改進。所以該檢測體系可用作對長枝木霉的特異性檢測，能夠用來區(qū)分其他物種。

目前針對于木霉所引起的靈芝綠霉病快速檢測體系研究僅黃鑫偉等[9]對側(cè)耳木霉進行過報道，而傳統(tǒng)的檢測方法主要是基于子實體的形態(tài)學特征并結(jié)合其生理生化性狀的描述、平板分離病原菌、免疫學檢測和鑒定的方法對病原真菌進行鑒別。存在著方法耗時長，經(jīng)驗性強，效率和檢測靈敏度低、程序繁瑣等缺點，并且不易從發(fā)病初期的植株中分離鑒定病原菌，難以做到對病害的早期發(fā)現(xiàn)和檢測。而本研究所建立的體系從分子水平對樣品進行分析和鑒定，結(jié)果準確性極高，并且具有高度特異性和靈敏性，為有效防治由長枝木霉所引發(fā)的靈芝木霉病提供了技術(shù)支持，同時也為相關(guān)研究提供了參考。

參考文獻：

[1] CAO Y， WU S H， DAI Y C. Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom "Lingzhi"[J]. Fungal Diversity， 2012， 56（1）： 49-62.

[2] 張曉云， 楊春清. 靈芝的化學成分和藥理作用[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床， 2006， 21（4）： 152-155.

[3] 張含波. 靈芝的栽培[J]. 特種經(jīng)濟動植物， 2009， 12（6）： 36-37.

[4] 馬英. CW電子商務(wù)有限公司靈芝茶產(chǎn)品市場營銷策略研究[D]. 長春： 吉林大學， 2017： 35-38.

[5] 金鑫， 劉宗敏， 黃羽佳， 等. 我國靈芝栽培現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 食藥用菌， 2016， 24（1）： 33-37.

[6] 馬紅梅， 陳永敢， 徐小雄， 等. 靈芝連作障礙的土壤微生態(tài)研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版）， 2013， 44（4）： 539-542.

[7] 解宜林， 檀根甲. 靈芝綠霉病發(fā)病原因分析及防治措施[J]. 中國食用菌， 2015， 34（1）： 74-76.

[8] 趙爽. 土壤病原真菌的檢測及土壤中真菌群落多樣性的研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學， 2012.

[9] 黃鑫偉， 嚴寅琿， 張通， 等. 靈芝綠霉病病原菌的分離鑒定及快速檢測[J]. 植物保護學報， 2018， 45（6）： 1435-1436.

[10] 方中達. 植病研究法[M]. 北京： 農(nóng)業(yè)出版社， 1998： 161-224.

[11] LIU Y J， WHELEN S， HALL B D. Phylogenetic relationships among ascomycetes： evidence from an RNA polymerse II subunit[J]. Molecular Biology and Evolution， 1999， 16（12）： 1799-1808.

[12] 鐘鑫， 趙靜， 吳曉蕾， 等. 西瓜枯萎病菌PCR分子檢測方法研究[J]. 果樹學報， 2019， 36（12）： 1771-1779.

[13] ZHANG T， LU M Z， ZHANG C L. First report of Trichoderma longibrachiatum causing green mold disease on Ganoderma lingzhi[J]. Plant Disease， 2019， 103（1）： 156-157.