武 順，駱淑媛，江 陽(yáng)，金衛(wèi)華

（武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，武漢 430212）

小球藻是一種單細(xì)胞藻類，分布廣泛，可利用光合作用自養(yǎng)或異養(yǎng)生活，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等，且食品安全性較好，具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，特別是在食品和飼料添加劑方面［1-3］。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的興起，小球藻越來(lái)越受到重視。研究表明，用小球藻喂食的魚(yú)、蝦等，其生長(zhǎng)發(fā)育能得到顯著改善［4］。由于小球藻的開(kāi)發(fā)利用存在諸多難題（如規(guī)模化快速有效地培養(yǎng)等），導(dǎo)致小球藻在國(guó)內(nèi)尚未產(chǎn)業(yè)化。有關(guān)小球藻的培養(yǎng)研究主要集中在利用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)方式［5-8］，或無(wú)機(jī)鹽與有機(jī)試劑混合培養(yǎng)［9］，其次是使用沼液、廢水和家畜糞便發(fā)酵物作為原料進(jìn)行培養(yǎng)［10-12］。而作為飼料的小球藻，利用以上方式培養(yǎng)是存在問(wèn)題的，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中含有較多的重金屬離子，如常用的BG11培養(yǎng)液中含Cu、Mo、Co、Mn等，雖然對(duì)小球藻的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但對(duì)動(dòng)物是有一定毒性的，引起動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育異常甚至死亡，沼液、廢水和糞便發(fā)酵物雖然有很多成分可供應(yīng)小球藻生長(zhǎng)，但難免有很多有害微生物滋生，在水產(chǎn)方面還會(huì)引起氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等的累積，嚴(yán)重影響水產(chǎn)品品質(zhì)。在小球藻培養(yǎng)方面，如何做到廉價(jià)、快速、易操作和無(wú)污染，是目前面臨的問(wèn)題之一。酵母菌可以直接作為飼料或用于發(fā)酵飼料已有廣泛的研究和應(yīng)用［13］。因此，選用廉價(jià)、營(yíng)養(yǎng)豐富的豆粕，采用酵母發(fā)酵的方式，生產(chǎn)的發(fā)酵液直接用于小球藻培養(yǎng)，除了可用作水產(chǎn)養(yǎng)殖的餌料和動(dòng)物的飼料添加劑，也可作為人類的綠色食品。

1 材料與方法

1.1 材料

豆粕市售；安琪福邦釀酒酵母Ⅰ型（飼料級(jí)水產(chǎn)專用）；蛋白核小球藻由武漢東湖學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離純化。

1.2 試劑

CaCl2·2H2O、NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、Na2CO3、H3BO4、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、EDTA、CuSO4·5H2O、Na2MoO4·2H2O、Co（NO3）2·6H2O、葡萄糖（以上化學(xué)試劑均為化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），COD/總磷/總氮/氨氮水質(zhì)測(cè)試包（日本共立理化學(xué)），亞硝酸鹽/硫化物檢測(cè)試劑盒（杭州陸恒生物科技有限公司）。

1.3 儀器

AUY120型分析天平（日本島津公司）；i3型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）、3K18型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；DELTA 320pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）；HQY-C-J型搖床（金壇市鴻科儀器廠）；SPX-300B-G光照恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療期器械有限公司）；CX31型普通顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.4 方法

1.4.1 酵母菌的活化與豆粕發(fā)酵接種 使用液體土豆培養(yǎng)基31℃振蕩培養(yǎng)活化酵母菌，離心收集菌體，菌體用無(wú)菌水清洗兩次后制成同體積菌懸液（A600=0.158），用于豆粕發(fā)酵；取10 g豆粕倒入500mL錐形瓶中，加入150 mL水，混合均勻后121℃蒸汽滅菌20 min，冷卻后無(wú)菌接種酵母菌懸液5 mL（2.5%的接種量），分別放在28、29、30℃搖床中恒溫振蕩發(fā)酵，轉(zhuǎn)速為120 r/min，發(fā)酵72 h。

1.4.2 不同溫度和不同培養(yǎng)液對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響 將發(fā)酵72 h的豆粕發(fā)酵液過(guò)濾后，將濾液6 000 r/min離心10 min，取上清液，一份直接用于小球藻培養(yǎng)，另一份煮沸5 min除去其中大部分活菌體后即為培養(yǎng)小球藻用的發(fā)酵液，按表1加樣后分別在25℃恒溫靜置培養(yǎng)，光照度為1 000 lx，每24 h搖瓶懸浮小球藻1次，并測(cè)定A680，連續(xù)測(cè)定9 d。

表1 小球藻培養(yǎng)前培養(yǎng)液加入量

1.4.3 不同豆粕發(fā)酵時(shí)間對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響 將豆粕在28℃的發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至3、5、7、9 d，取不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液，按表1中1號(hào)瓶加樣并培養(yǎng)小球藻，測(cè)連續(xù)6 d的A680，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值。

1.4.4 總氮、氨氮、亞硝酸鹽、總磷、硫化物、COD、溶氧量測(cè)定 按表1中1號(hào)瓶加樣培養(yǎng)，測(cè)連續(xù)9 d總氮含量和連續(xù)7 d亞硝酸鹽、氨氮濃度，以表1中3號(hào)瓶加樣培養(yǎng)為對(duì)照；總磷、硫化物、COD、溶氧量均按表1中1號(hào)瓶加樣培養(yǎng)測(cè)定7 d后參數(shù)，測(cè)量方法均按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.5 豆粕發(fā)酵后消耗率的測(cè)定 在28℃接種發(fā)酵，分為4組，每組發(fā)酵時(shí)間分別為3、5、7、9 d，發(fā)酵完成后離心棄上清液，烘干殘?jiān)梁阒睾鬁?zhǔn)確稱量，每組做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值。豆粕消耗率=發(fā)酵后固體物質(zhì)質(zhì)量/發(fā)酵前豆粕質(zhì)量×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件的One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵溫度下產(chǎn)生的培養(yǎng)液經(jīng)初步滅菌后對(duì)小球藻生長(zhǎng)促進(jìn)作用

從圖1至圖3可以看出，29℃的發(fā)酵液?jiǎn)为?dú)使用與結(jié)合BG11培養(yǎng)液，與單獨(dú)使用BG11培養(yǎng)液相比，對(duì)小球藻的生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），兩種培養(yǎng)液同時(shí)使用時(shí)，9 d后小球藻仍有生長(zhǎng)趨勢(shì)；其次是使用28℃的發(fā)酵液?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)，小球藻前期生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于添加了BG11培養(yǎng)液（P＜0.05），后期生長(zhǎng)比較穩(wěn)定，7 d即達(dá)到生物累積量最大。與單獨(dú)用BG11培養(yǎng)液培養(yǎng)小球藻相比，3個(gè)不同溫度下的發(fā)酵液均表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用。

圖1 溫度為28℃的發(fā)酵液培養(yǎng)的小球藻生長(zhǎng)趨勢(shì)

圖2 溫度為29℃的發(fā)酵液培養(yǎng)的小球藻生長(zhǎng)趨勢(shì)

圖3 溫度為30℃的發(fā)酵液培養(yǎng)的小球藻生長(zhǎng)趨勢(shì)

2.2 發(fā)酵液未滅菌和初步滅菌后對(duì)小球藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用比較

從圖4可以看出，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)除菌比不除菌效果好很多，培養(yǎng)前5 d，兩者效果無(wú)明顯差異，但后4 d差異顯著（P＜0.05）。

圖4 溫度為28℃的發(fā)酵液未滅菌和煮沸滅菌后培養(yǎng)的小球藻生長(zhǎng)趨勢(shì)

2.3 28℃時(shí)不同發(fā)酵時(shí)間下產(chǎn)生的培養(yǎng)液對(duì)小球藻生長(zhǎng)促進(jìn)作用

從圖5可以看出，豆粕經(jīng)發(fā)酵7 d后所得產(chǎn)物最有利于小球藻生長(zhǎng)，培養(yǎng)的小球藻在第6天仍保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，發(fā)酵后3、5、9 d的代謝產(chǎn)物對(duì)小球藻生長(zhǎng)促進(jìn)效果區(qū)別不大，在第5天后生長(zhǎng)基本處于停止?fàn)顟B(tài)。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)生的培養(yǎng)液培養(yǎng)的小球藻生長(zhǎng)趨勢(shì)

2.4 小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液的總氮、氨氮和亞硝酸鹽濃度變化

由圖6至圖8可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液中的總氮、氨氮和亞硝酸鹽逐漸消耗完，雖然BG11中氨氮也可耗盡，但總氮和亞硝酸鹽卻有較高水平的殘留。

圖6 不同培養(yǎng)液培養(yǎng)小球藻時(shí)總氮濃度變化

圖8 不同培養(yǎng)液培養(yǎng)小球藻時(shí)亞硝酸鹽濃度變化

2.6 培養(yǎng)小球藻后培養(yǎng)液中與水質(zhì)參數(shù)

由表2可以看出，小球藻培養(yǎng)過(guò)程中，能有效增加水中溶氧量，該溶氧量適合各種水產(chǎn)品。培養(yǎng)液中總磷含量偏低，藻類生長(zhǎng)一般在有效磷含量為0.2～1.0 mg/L的范圍內(nèi)比較合適，總磷含量偏低的原因與快速生長(zhǎng)繁殖的小球藻對(duì)磷的利用有關(guān)。硫化物含量略有偏高的原因考慮有3個(gè)方面因素：一是培養(yǎng)液中主要營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)自于高蛋白水解產(chǎn)生的硫化物；二是培養(yǎng)過(guò)程非無(wú)菌培養(yǎng)，由雜菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生；三是小球藻培養(yǎng)在較小空間進(jìn)行，代謝產(chǎn)生的氣體（如硫化氫）難以迅速揮發(fā)，在自然水域或養(yǎng)殖池中，硫化物含量應(yīng)該會(huì)有所下降。培養(yǎng)液中酸堿度偏堿性，是適合水生生物生長(zhǎng)的；培養(yǎng)液中COD＜15.0 mg/L，符合地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ級(jí)。

圖7 不同培養(yǎng)液培養(yǎng)小球藻時(shí)氨氮濃度變化

表2 小球藻培養(yǎng)7 d后培養(yǎng)液中影響水質(zhì)的各項(xiàng)指標(biāo)

2.7 豆粕發(fā)酵后的消耗量

從表3中得出，發(fā)酵7 d后的發(fā)酵液，豆粕消耗量最大，發(fā)酵液中可溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量最多。

表3 豆粕發(fā)酵時(shí)間與消耗量

3 討論

3.1 不同溫度、不同時(shí)間發(fā)酵豆粕的產(chǎn)物不同

在相同培養(yǎng)條件下，與29℃和30℃相比，28℃時(shí)的發(fā)酵產(chǎn)物明顯利于小球藻的吸收利用（P＞0.05），在相同溫度下，發(fā)酵7 d的效果最好，說(shuō)明酵母菌在發(fā)酵豆粕過(guò)程中的代謝活動(dòng)與溫度、發(fā)酵時(shí)間密切相關(guān)。

3.2 豆粕發(fā)酵產(chǎn)物比BG11培養(yǎng)液更適合小球藻的培養(yǎng)

在相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)小球藻9 d，BG11培養(yǎng)液的產(chǎn)率和效率是最低的。豆粕和小球藻同屬植物都能進(jìn)行光合作用，在細(xì)胞的化學(xué)組成上應(yīng)有相似性，通過(guò)酵母菌的降解作用，豆粕中部分物資被降解成可溶性小分子或大分子，這些分子可以被小球藻直接利用合成自身物質(zhì)，省去其中的能量代謝過(guò)程，BG11培養(yǎng)液的組成基本為無(wú)機(jī)鹽分子，要成為小球藻組成成分需一系列復(fù)雜的代謝和光合作用。小球藻在發(fā)酵液中生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)比BG11培養(yǎng)液中的快，發(fā)酵液結(jié)合BG11培養(yǎng)液具有更好的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，這可能是發(fā)酵液中有效成分在9 d后已經(jīng)消耗殆盡，BG11培養(yǎng)液中存在富余養(yǎng)料的原因。當(dāng)給予足夠的發(fā)酵液時(shí)，小球藻也會(huì)持續(xù)生長(zhǎng)，并且不斷沉淀在底部，移除底部的小球藻后，培養(yǎng)液仍然可以繼續(xù)培養(yǎng)至無(wú)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。

3.3 豆粕發(fā)酵液在用于小球藻培養(yǎng)前應(yīng)盡量除去其中菌體

發(fā)酵液不經(jīng)煮沸直接培養(yǎng)小球藻，容易導(dǎo)致酵母菌的快速繁殖。同時(shí)，小球藻生長(zhǎng)緩慢，甚至停止生長(zhǎng)的現(xiàn)象，可能是酵母菌的大量繁殖，二次代謝消耗了培養(yǎng)液的大部分營(yíng)養(yǎng)成分或種群抑制。此外，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果采用在低速搖床中培養(yǎng)小球藻時(shí)，菌體繁殖更快，小球藻基本不能生長(zhǎng)，因此一般采用靜置培養(yǎng)效果比較好。

3.4 發(fā)酵液培養(yǎng)小球藻后，其中總氮、氨氮和亞硝酸鹽的殘留

豆粕發(fā)酵后，發(fā)酵液中有一定量的氨氮和亞硝酸鹽，在不同溫度和不同發(fā)酵時(shí)間下，發(fā)酵液中的氨氮濃度均為0.8 mg/L，亞硝酸鹽濃度為0.005 mg/L，與該酵母菌的代謝特點(diǎn)有關(guān)，在BG11培養(yǎng)基配制后，可能是其中含有硝酸鹽的原因，與其他試劑混合后產(chǎn)生了少量氨氮和較高濃度的亞硝酸鹽，兩種培養(yǎng)液在培養(yǎng)小球藻過(guò)程中，均出現(xiàn)短暫的氨氮濃度上升過(guò)程，經(jīng)過(guò)5 d培養(yǎng)后，氨氮均已消除，發(fā)酵液培養(yǎng)液中亞硝酸鹽在培養(yǎng)3 d后可以完全消除，并且在后4 d培養(yǎng)過(guò)程中再?zèng)]有出現(xiàn)，而B(niǎo)G11培養(yǎng)液中亞硝酸鹽雖然初期濃度降低，但后期培養(yǎng)始終未能消除。以上說(shuō)明BG11培養(yǎng)液的配比存在一定缺陷，其中有富余的N不能被小球藻利用，小球藻不斷生長(zhǎng)、沉淀、再生長(zhǎng)。此外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，以發(fā)酵液培養(yǎng)小球藻，如果出現(xiàn)培養(yǎng)液中菌體大量繁殖時(shí)，氨氮及亞硝酸鹽的濃度將大幅度升高，而小球藻生長(zhǎng)受到抑制，將無(wú)法由小球藻的代謝來(lái)降低氨氮及亞硝酸鹽含量。在比較復(fù)雜的環(huán)境中，如沼液、畜禽糞便發(fā)酵液中含有大量細(xì)菌，對(duì)小球藻的生長(zhǎng)是不利的，可能生長(zhǎng)的是其他藻類。

雖然BG11培養(yǎng)液對(duì)小球藻生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)作用，但其中殘留的亞硝酸鹽和總氮，特別是亞硝酸鹽以及較多的重金屬離子的存在，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖水體會(huì)造成嚴(yán)重污染，可以導(dǎo)致水產(chǎn)品的直接死亡，BG11培養(yǎng)液不適合在水產(chǎn)領(lǐng)域直接應(yīng)用；相反，豆粕發(fā)酵液經(jīng)過(guò)小球藻的生長(zhǎng)利用后，影響水質(zhì)的幾個(gè)重要參數(shù)均已達(dá)到Ⅱ類水質(zhì)水平［14］，在培養(yǎng)小球藻后直接應(yīng)用，試驗(yàn)中使用潔凈的自來(lái)水，一方面可以補(bǔ)充部分小球藻生長(zhǎng)所需的部分金屬離子，如Ca2+、Mg2+等（其他離子均來(lái)自天然豆粕中），另一方面，自來(lái)水具有一定的殺菌抑菌功能，可以抑制有害菌的滋生，整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，來(lái)源豐富而廉價(jià)，適合規(guī)模化培養(yǎng)小球藻。

3.5 豆粕發(fā)酵時(shí)間與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)累積之間的關(guān)系

發(fā)酵7 d的培養(yǎng)液消耗豆粕的量最大，與最能有效促進(jìn)小球藻生長(zhǎng)結(jié)果是一致的，發(fā)酵9 d后的消耗率沒(méi)有發(fā)酵7 d的高，說(shuō)明酵母菌在代謝過(guò)程中可以重新利用代謝產(chǎn)物進(jìn)行再次繁殖，由于通過(guò)離心的方式將菌體質(zhì)量包含在豆粕剩余量中，所以發(fā)酵液中可溶性物質(zhì)是減少的，這與發(fā)酵9 d的發(fā)酵液沒(méi)有發(fā)酵7 d的發(fā)酵液在培養(yǎng)小球藻時(shí)效果明顯相符，也與未煮沸除菌的發(fā)酵液容易導(dǎo)致菌體大量繁殖相符。

4 小結(jié)

豆粕發(fā)酵液對(duì)小球藻生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用；經(jīng)豆粕發(fā)酵液培養(yǎng)后的水體以及小球藻不含影響水質(zhì)的污染因素；豆粕發(fā)酵液培養(yǎng)的小球藻可以直接應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。