姚 錚，李子涵，高利明，胡 星，陳 顏，潘文琦，李 謙

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京210009）

隨著腫瘤生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，腫瘤免疫治療已成為近年來腫瘤治療領(lǐng)域的新途徑［1］。表達(dá)抗原特異性的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的基因工程T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移（一種新型腫瘤免疫療法），在治療一些人類血液惡性腫瘤包括白血病和淋巴瘤方面已經(jīng)取得顯著成功［2］。單鏈可變抗原（single chain variable frag‐ment，scFv）和信號結(jié)構(gòu)域的整合能夠賦予CAR具有顯著的特異性和細(xì)胞毒性，能夠以不依賴人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）的方式發(fā)揮活性。最初的CAR結(jié)構(gòu)包含scFv和CD3ζ信號結(jié)構(gòu)域，這使得T細(xì)胞具有短暫的激活和細(xì)胞毒性［3］。在一些研究和臨床試驗(yàn)中，為了改善CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性和持久性，已經(jīng)將共刺激信號分子，如CD28或CD137（4-1BB）整合到細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域中［4］。

在治療血液瘤方面，特別是在急性淋巴細(xì)胞白血病中，CAR-T細(xì)胞免疫療法盡管有很高的臨床響應(yīng)率，但CAR-T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移對實(shí)體瘤的治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)。從理論上講，修飾的T細(xì)胞對腫瘤部位的歸巢能力差，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）含有許多免疫抑制性細(xì)胞和其他免疫抑制因子（結(jié)構(gòu)如圖1所示）都會降低CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒性。本文全面分析限制CART細(xì)胞治療實(shí)體瘤的因素，介紹一些克服這些障礙的方法，對研究人員和醫(yī)護(hù)人員有效對抗實(shí)體瘤具有一定的參考價值。

1 實(shí)體瘤腫瘤微環(huán)境中的障礙

1.1 物理屏障

TME中的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），包括蛋白聚酶和糖肽酶，對腫瘤的生物學(xué)行為和免疫系統(tǒng)的重塑有多重作用。一些研究表明，ECM中的一些蛋白質(zhì)是非結(jié)構(gòu)基質(zhì)蛋白，如硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG），它們在維持腫瘤細(xì)胞增殖和遷移中起主要作用［5］。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是腫瘤基質(zhì)的主要成分。CAFs主要分布于血管周圍或腫瘤外周纖維間質(zhì)內(nèi)，分泌細(xì)胞因子、ECM以及相關(guān)酶分子。腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成分之間相互作用，形成了功能復(fù)雜的TME。T細(xì)胞在攻擊基質(zhì)豐富的實(shí)體瘤時幾乎沒有能力穿透腫瘤病灶部位，導(dǎo)致抗腫瘤活性的下降［6］。因此，提高工程化T細(xì)胞特異性降解富含基質(zhì)的實(shí)體瘤中ECM而又不損害其細(xì)胞毒性，將顯著增強(qiáng)抗腫瘤活性。

1.2 免疫抑制細(xì)胞和分泌的細(xì)胞因子

在TME中，免疫抑制主要由免疫抑制細(xì)胞介導(dǎo)：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cells，Tregs），會減弱效應(yīng)T細(xì)胞活性，促進(jìn)TME的免疫抑制；骨髓源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs），作為TME中的免疫負(fù)調(diào)控因素，能夠抑制多種免疫細(xì)胞活性；M2型巨噬細(xì)胞，通過分泌輔助T細(xì)胞2（T helper 2，Th2）細(xì)胞因子促進(jìn)血管生成和腫瘤侵襲。這些細(xì)胞在實(shí)體瘤內(nèi)釋放細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子β（teansforming growth factor-β，TGF-β）和白細(xì)胞介素10（IL-10），這些組成與成分都將嚴(yán)重抑制回輸?shù)腃AR-T細(xì)胞療效。

1.2.1 Tregs Tregs在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，包括CD4+CD25+Tregs和Ⅰ型Tregs，生成與作用機(jī)制如圖2所示。TGF-β對CD4+CD25+Tregs發(fā)揮功能至關(guān)重要，而Foxp3（叉頭框蛋白P3）是其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在Tregs中高表達(dá)［7］。Ⅰ型Tregs通過分泌細(xì)胞因子IL-10發(fā)揮抑制活性。一般來說，Tregs在炎癥和腫瘤部位富集，通過各種機(jī)制調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。活化的Tregs可以通過快速吸收IL-2直接消除過多的T細(xì)胞，這導(dǎo)致缺乏足夠的效應(yīng)細(xì)胞抵抗惡性腫瘤。此外，這些抑制性細(xì)胞可以產(chǎn)生許多抑制T細(xì)胞活性的免疫調(diào)節(jié)因子，如TGF-β和IL-10，以此構(gòu)成負(fù)調(diào)節(jié)循環(huán)，形成免疫抑制。

圖2 Tregs生成與作用機(jī)制

1.2.2 MDSCs MDSCs是免疫抑制細(xì)胞的一個主要成分，負(fù)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，從而降低免疫系統(tǒng)的腫瘤免疫能力。MDSCs的負(fù)調(diào)控機(jī)制是通過誘導(dǎo)型一氧化氮酶、精氨酸酶催化酶Ⅰ、環(huán)氧合酶-2、前列腺素E2、TGF-β、IL-10和Tregs介導(dǎo)其抑制作用。另外，MDSCs的存在與腫瘤細(xì)胞的生長有關(guān)，在前列腺癌和結(jié)腸癌中，MDSCs產(chǎn)生活性氮，致使趨化因子CCL2（C-C chemokine ligand2，CCL2）發(fā)生硝化，抑制Th1（T helper 1，輔助T細(xì)胞1）型效應(yīng)細(xì)胞的浸潤。因此，抑制MDSCs功能已被證實(shí)可以改善TME中的抗腫瘤免疫反應(yīng)［8］。靶向治療MDSCs的免疫檢查點(diǎn)c-Rel，可以明顯改善小鼠黑色素瘤模型與淋巴瘤模型的腫瘤情況，腫瘤生長得到明顯抑制［9］。因此，合理處理MDSCs可以有效提高腫瘤免疫活性。

1.2.3 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 M2型巨噬細(xì)胞成為腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞（tumor associated macro‐phages，TAMs），通過表達(dá)可溶性蛋白和細(xì)胞因子（如IL-10、基質(zhì)金屬蛋白酶、尿激酶型纖溶酶原激活劑、血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子等），在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。表達(dá)的IL-10能夠有效地抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活化，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的快速增殖。過量的M2型巨噬細(xì)胞釋放特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9），從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞的遷移，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞更加難以被免疫細(xì)胞的追蹤與殺傷［10］。此外，M2型巨噬細(xì)胞可以通過消耗L-氨基酸，產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的鳥氨酸和多胺［11］。

1.3 免疫抑制性受體

1.3.1 CTLA4 通常機(jī)體內(nèi)T細(xì)胞的活性通過激活信號途徑和抑制信號途徑來調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致健康人體內(nèi)T細(xì)胞的活性平衡。通過抗原刺激信號和共刺激信號活化的T細(xì)胞能夠快速增殖和功能分化。當(dāng)T細(xì)胞過度活躍時，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated anti‐gen4，CTLA4）結(jié)合B7分子接到的抑制信號將終止T細(xì)胞的功能。CTLA4是CD28的同系物，對T細(xì)胞產(chǎn)生抑制信號，然后使其處于無活性狀態(tài)。理論上，CTLA4募集磷酸酯酶到T細(xì)胞受體的CD3ζ結(jié)構(gòu)域，從而通過免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）的去磷酸化來減弱T細(xì)胞的功能。此外，一些研究已經(jīng)證明，T細(xì)胞的T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）激活能夠啟動CTLA4胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化，稱為免疫受體酪氨酸抑制基序，同時也能夠延長活化的T細(xì)胞表面CTLA4的表達(dá)［12］?；贑TLA4功能的原理，減少CTLA4內(nèi)源性表達(dá)或抑制其活性可以用于腫瘤的免疫治療。

1.3.2 PD-1 繼CTLA4后腫瘤免疫治療領(lǐng)域另一個重要免疫檢查點(diǎn)是程序性死亡受體1（pro‐grammed death 1，PD-1），它是一種細(xì)胞表面受體，屬于免疫球蛋白超家族，僅在活化的T淋巴細(xì)胞上表達(dá)。在結(jié)構(gòu)上，成熟的PD-1蛋白包含細(xì)胞外識別結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)以及細(xì)胞內(nèi)尾部。功能上，PD-1在抑制T細(xì)胞活性中起重要作用。具有兩個磷酸化位點(diǎn)的尾部，一個ITM和一個基于免疫受體酪氨酸的轉(zhuǎn)換基序，它們均負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體信號。如果腫瘤細(xì)胞激活PD-1，也會產(chǎn)生抑制信號，從而阻止效應(yīng)T細(xì)胞的增殖，使T細(xì)胞不能及時有效地識別腫瘤細(xì)胞，從而使腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞的追殺。基于CTLA4和PD-1在不同抑制途徑中的功能，CTLA4抗體和PD-1抗體的聯(lián)合治療已經(jīng)成為通過檢查點(diǎn)抑制從而對抗腫瘤的有效方法［13］。

1.3.3 其他免疫檢查點(diǎn) 盡管CTLA4和PD-1通路能夠有效地負(fù)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，但它們僅代表抑制抗腫瘤應(yīng)答潛在靶點(diǎn)的“冰山一角”。隨著腫瘤免疫治療中T細(xì)胞的發(fā)展，隨后又發(fā)現(xiàn)多種抑制免疫應(yīng)答的免疫檢查點(diǎn)，例如淋巴細(xì)胞激活基因3（lymphocyte-activation gene3，LAG3），T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cellimmunoglobulin mucin 3，TM3）和T細(xì)胞活化的V域Ig抑制劑（Vdomain Ig suppressor of T cell activation，VISTA）。蛋白LAG3是一種細(xì)胞耗竭的標(biāo)記，在激活的T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞上廣泛表達(dá)，它是一種重要的抑制性受體，能夠以比CD4更高的親和力結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類（major histocompatibility complex class II，MHCⅡ），進(jìn)而阻止抗腫瘤免疫反應(yīng)。在T細(xì)胞上表達(dá)的受體蛋白TIM3可以啟動TIM3/Galectin-9信號傳導(dǎo)途徑，其可以抑制淋巴細(xì)胞應(yīng)答并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］。VISTA是一種在造血細(xì)胞和白細(xì)胞上表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)受體，可降低T細(xì)胞的活性和細(xì)胞毒性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［15］。

1.4 缺乏趨化因子受體

CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的主要障礙是T細(xì)胞難以滲入實(shí)體瘤組織內(nèi)部。趨化因子是一類能夠吸引白細(xì)胞到感染部位的蛋白質(zhì)，介導(dǎo)多種免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，幫助T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤并影響腫瘤免疫和治療效果。一些實(shí)體瘤能夠分泌趨化因子，如趨化因子12（CXCL12）和趨化因子15（CXCL5），但腫瘤細(xì)胞抑制這些因子的分泌會不利于T細(xì)胞的滲透。相反，T細(xì)胞表面缺乏表達(dá)一些與實(shí)體瘤分泌的趨化因子相匹配的趨化因子受體［16］。一些報道顯示，雖然實(shí)體瘤能夠大量分泌趨化因子，如屬于C-C趨化因子家族的CCL2，但是相應(yīng)的趨化因子受體，如可特異性結(jié)合CCL2的CCR2b和CCR4，在T細(xì)胞上表達(dá)量很低，這導(dǎo)致T細(xì)胞歸巢能力的降低。

1.5 腫瘤抗原不均一性

眾所周知，CAR-T細(xì)胞通過scFv結(jié)構(gòu)識別并靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原，scFv由單克隆抗體的輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域抗體組成。膜蛋白CD19在幾乎所有的B細(xì)胞惡性腫瘤中均有廣泛表達(dá)，這導(dǎo)致了CD19特異性CAR-T細(xì)胞的治療效果令人鼓舞。然而，對于實(shí)體瘤，由于缺乏腫瘤特異性抗原以及腫瘤抗原的異質(zhì)性，CAR-T細(xì)胞治療的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。目前進(jìn)行臨床試驗(yàn)的CAR-T靶點(diǎn)見表1。

表1 處于臨床試驗(yàn)階段的CAR-T實(shí)體瘤靶點(diǎn)

1.6 免疫系統(tǒng)中的其他免疫抑制因子

1.6.1 CD47 在人體免疫系統(tǒng)中，巨噬細(xì)胞基于靶細(xì)胞上吞噬信號（“吃我”）和抗吞噬信號（“不吃我”）之間的平衡發(fā)揮吞噬功能?？雇淌尚盘柸Q于靶細(xì)胞上表達(dá)的CD47分子與巨噬細(xì)胞上呈遞的信號調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory proteinα，SIRPα）之間的相互作用，導(dǎo)致SIRPα的ITM磷酸化?？缒さ鞍證D47在許多腫瘤細(xì)胞中均過度表達(dá)［17］。通常CD47-SIRPα介導(dǎo)的抗吞噬細(xì)胞信號允許腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。因此，為了增強(qiáng)免疫系統(tǒng)應(yīng)對腫瘤的能力，CD47可以用作腫瘤免疫治療領(lǐng)域的新靶點(diǎn)。

1.6.2 CD73和腺苷 CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤未取得成功很大程度上是由于腺苷的大量產(chǎn)生。腺苷由胞外腺苷一磷酸通過胞外酶催化產(chǎn)生，CD73在腫瘤細(xì)胞或免疫抑制性細(xì)胞上表達(dá)，有助于將具有免疫激活作用的ATP轉(zhuǎn)化為腺苷［18］。產(chǎn)生的腺苷促進(jìn)腫瘤生長和疾病發(fā)展，導(dǎo)致T細(xì)胞和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性被抑制，細(xì)胞因子的產(chǎn)生和增殖被抑制從而抑制抗原呈遞細(xì)胞，促進(jìn)Terg的增殖和抑制免疫活性，刺激MDSC和M2型巨噬細(xì)胞的極化［19］。

總之，在被抑制的免疫“監(jiān)視”條件下，CAR修飾的T細(xì)胞會面臨許多障礙。隨著對腫瘤生物學(xué)和免疫學(xué)的進(jìn)一步研究，科學(xué)家開發(fā)了一些策略克服這些障礙，使得對于實(shí)體瘤應(yīng)用CAR-T成為可能。本文根據(jù)作用機(jī)制進(jìn)一步描述了這些方法如何改善TME，進(jìn)而增強(qiáng)T細(xì)胞功能。

2 提高CAR-T細(xì)胞功能的策略

2.1 選擇腫瘤特異性抗原

CAR結(jié)構(gòu)的抗原特異性直接決定了修飾T細(xì)胞的精確活性和安全性。然而，對于實(shí)體瘤，腫瘤抗原的異質(zhì)性導(dǎo)致無效的免疫監(jiān)視，從而導(dǎo)致難治性和復(fù)發(fā)性腫瘤。一些研究人員試圖找到腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，這些標(biāo)志物在腫瘤分化的早期階段被認(rèn)為是腫瘤特異性抗原。有研究報道，生殖干細(xì)胞（POWIL2）異化激活產(chǎn)物（PL2L60）在各種血癌和實(shí)體癌瘤中廣泛表達(dá)，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時PIWIL2/PL2L60蛋白特異性單克隆抗體（克隆KAO3）可以抑制癌前干細(xì)胞在免疫缺陷小鼠內(nèi)的致瘤能力，也能有效抑制多種腫瘤生長，包括淋巴瘤、乳腺瘤、肺癌和宮頸癌等［20］。鑒定腫瘤特異性抗原為開發(fā)用于實(shí)體瘤的靶向療法提供了強(qiáng)有力的工具。

2.2 CAR-T細(xì)胞的浸潤和歸巢

2.2.1 趨化因子受體 為了增強(qiáng)T細(xì)胞對腫瘤的歸巢能力，一些趨化性手段給予T細(xì)胞強(qiáng)大的靶向?qū)嶓w瘤的能力。腫瘤細(xì)胞分泌的趨化因子與修飾T細(xì)胞上的趨化因子受體相結(jié)合可促進(jìn)更多的T細(xì)胞到達(dá)實(shí)體瘤部位。對于惡性胸膜間皮瘤，同時表達(dá)CCR2b和間皮素特異性CAR-T細(xì)胞可增加其遷移至腫瘤部位并消除靶細(xì)胞的能力。此外，其他研究小組也已經(jīng)描述了類似的CAR方法，具有更強(qiáng)的運(yùn)輸和抗腫瘤效力，例如在治療霍奇金淋巴瘤中使用表達(dá)CCR4的CD30特異性CAR-T細(xì)胞和在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中使用表達(dá)CCR2b的GD2特異性CAR-T細(xì)胞［21］。在這些研究中，用功能性趨化因子受體修飾的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)具有顯著的腫瘤定位和抗腫瘤效力。

2.2.2 成纖維細(xì)胞活化蛋白 先前的報道已經(jīng)證明腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibro‐blasts，CAFs）能夠促進(jìn)血管生成，在實(shí)體瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此，CAFs是腫瘤惡性進(jìn)展的關(guān)鍵決定因素，是腫瘤治療的重要目標(biāo)。靶向CAFs是CAR-T治療實(shí)體瘤的新方法。Schuberth等［22］利用CAR開發(fā)了一種特異性針對成纖維細(xì)胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）的T細(xì)胞，F(xiàn)AP在CAFs上大量表達(dá)，在異種移植間皮瘤的動物模型試驗(yàn)結(jié)果中顯示，F(xiàn)APCAR-T治療能顯著提升生存時間，提高生存率。Wang等［23］研究表明，靶向FAP陽性細(xì)胞通過表位擴(kuò)展增強(qiáng)抗腫瘤免疫活性。在小鼠間皮瘤與肺癌模型中，使用FAP-CAR治療3 d后，內(nèi)源性CD4+T細(xì)胞活化，隨后內(nèi)源性CD69+，CD8+T細(xì)胞浸潤數(shù)量增加。使用CAF-CAR-T細(xì)胞進(jìn)行的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中（NCT01722149）?？傊?，靶向CAFs的治療策略是根除腫瘤的有效方法。

2.2.3 整合素 對于實(shí)體瘤而言，修飾的T細(xì)胞缺乏浸潤腫瘤實(shí)質(zhì)的能力，導(dǎo)致其體內(nèi)效力十分有限。一般而言，整合素αvβ3在實(shí)體瘤的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高度表達(dá)，靶向整合素是可以解決T細(xì)胞缺乏浸潤能力的問題。因此，F(xiàn)u等［24］提出了一種很有發(fā)展前景的策略，即將T細(xì)胞植入能偶靶向αvβ3的含有echistatin的CAR（T-eCAR）。T-eCAR細(xì)胞的回輸影響腫瘤新生血管系統(tǒng)，導(dǎo)致腫瘤顯著縮小，但對正常組織的血管沒有脫靶效應(yīng)。一項基于靶向整合素β7的研究設(shè)計了MMG49 CAR特異性靶向整合素β7活性構(gòu)象，該靶點(diǎn)在大多數(shù)骨髓瘤細(xì)胞表面表達(dá)且具有活性構(gòu)象，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MMG49 CAR-T會特異性殺死小鼠體內(nèi)的骨髓瘤細(xì)胞，具有顯著的抗腫瘤活性且對正常細(xì)胞沒有傷害［25］。

2.3 共表達(dá)免疫因子和酶

細(xì)胞因子是一種信號蛋白，具有顯著增強(qiáng)或消除CAR-T細(xì)胞功能的能力。與免疫刺激細(xì)胞因子共同表達(dá)的CAR可顯著提高免疫抑制性，例如IL-12可以調(diào)控T細(xì)胞多種T細(xì)胞的發(fā)育，對免疫反應(yīng)的方向以及免疫相關(guān)疾病具有顯著影響；IL-15在T細(xì)胞運(yùn)輸過程中起關(guān)鍵作用。同時為了進(jìn)一步提升抵抗TME的能力，T細(xì)胞被改造以表達(dá)一些細(xì)胞因子，如IL-12或IL-15，并分泌一些酶，如過氧化氫酶等，結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 共表達(dá)細(xì)胞因子的CAR-T結(jié)構(gòu)

2.3.1 IL-12 免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-12能夠促進(jìn)免疫抑制的快速逆轉(zhuǎn)，在T淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的活化中起重要作用，是抗腫瘤免疫的有效誘導(dǎo)劑。通過設(shè)計表達(dá)IL-12的CAR-T細(xì)胞可以作為改進(jìn)CAR-T的新思路。Pegram等［26］報道，分泌IL-12的靶向CD19的CAR-T細(xì)胞能消除全身性腫瘤并獲得最佳的抗腫瘤反應(yīng)。另一個研究也顯示，通過基因工程改造CAR-T細(xì)胞使其分泌微量IL-12，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，與4只未經(jīng)治療的小鼠相比，分泌IL-12的CAR-T細(xì)胞療法顯著提高了7只淋巴瘤小鼠的存活時間。另外，分泌IL-12的CAR-T細(xì)胞稱為TRUCKs，不僅增強(qiáng)修飾T細(xì)胞的活化和細(xì)胞毒性，而且還導(dǎo)致Th1極化狀態(tài)，吸引內(nèi)源性T細(xì)胞和其他先天免疫細(xì)胞根除腫瘤細(xì)胞。

2.3.2 IL-15 一些研究表明，細(xì)胞因子IL-15通過結(jié)合IL2Rβγc復(fù)合物，能夠有效增強(qiáng)記憶性CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能，而不激活具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞。通過設(shè)計表達(dá)IL-15的CAR-T細(xì)胞便可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞的功能，改善突破腫瘤微環(huán)境。Chow等［27］證明IL-15在體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。因此，表達(dá)IL-15的T細(xì)胞可以作為消除免疫抑制微環(huán)境中靶細(xì)胞的有效武器。有研究聯(lián)合表達(dá)IL-15的CD19 CAR-T細(xì)胞療法，比較CD19 CAR-T與IL15-CD19 CAR-T抗腫瘤能力，給予抗原刺激后，IL-15 CD19 CAR-T具有比CD19 CAR-T細(xì)胞更大的增殖能力，并且在異種移植淋巴瘤動物模型中，注射IL-15 CD19 CAR-T細(xì)胞的小鼠腫瘤消除更快，具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷活性，且不對正常細(xì)胞進(jìn)行殺傷［28］。上述研究證明了CAR-T細(xì)胞通過聯(lián)合分泌IL-15可以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的增殖能力提高抗腫瘤活性。

2.3.3 過氧化氫酶 在實(shí)體瘤中，浸潤的T細(xì)胞經(jīng)常會遇到豐富的活性氧，這是腫瘤微環(huán)境的一個標(biāo)志，會損害修飾T細(xì)胞的抗腫瘤活性。保護(hù)T細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的一種方法是設(shè)計一種CAR-T細(xì)胞共同表達(dá)過氧化氫酶。Ligtenberg等［29］開發(fā)了一種新型T細(xì)胞模式（稱為CAR-CAT-T細(xì)胞），具有共表達(dá)過氧化氫酶的CAR，其催化過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧，從而改善腫瘤微環(huán)境，提升免疫細(xì)胞的抗腫瘤活性。作者還在體外對癌胚抗原（CEA）和從表皮生長因子受體-2（HER2）CAR-T細(xì)胞進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)與單純CAR相比，此類CAR-T具有較低的氧化狀態(tài)，并具有較好的增殖活力和細(xì)胞毒性。工程化的T細(xì)胞可以通過代謝過氧化氫和減少氧化應(yīng)激介導(dǎo)的抑制來減少腫瘤的氧化狀態(tài)，并保持其抗腫瘤活性。

2.3.4 HVEM(皰疹病毒侵入介體)皰疹病毒侵入介體（herpesvirus entry mediator，HVEM，圖4），被稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員14（TNFRSF14），是中心淋巴瘤中最常見的突變基因，這些突變可破壞與BTLA（B and T lymphocyte attenuator，B、T淋巴細(xì)胞衰減因子）的抑制性受體之間的相互作用，通過惡化淋巴基質(zhì)活化和增加濾泡輔助性T細(xì)胞的招募從而誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞癌生長所需要的關(guān)鍵微環(huán)境。工程化T細(xì)胞可以攜帶HVEM從而阻止HVEM-BTLA作用被破壞。HVEM的丟失通常驅(qū)動中心淋巴瘤的發(fā)生并誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境。Boice等［30］設(shè)計攜帶可溶性HVEM的CD19特異性CAR-T細(xì)胞，通過釋放可溶性HVEM在局部增強(qiáng)對淋巴瘤的治療活性，攜帶HVEM的CD19 CAR-T具有更強(qiáng)大的抗腫瘤活性。這些研究結(jié)果也闡明了一種新方法，來修復(fù)腫瘤抑制性的HVEM-BTLA交互，并抑制了淋巴瘤細(xì)胞的生長。此外該方法也表明，CAR-T細(xì)胞不僅直接攻擊腫瘤細(xì)胞，同時還具有精確治療的藥物傳遞工具。

圖4 皰疹病毒侵入介體（HVEM）缺失機(jī)制

2.4 修飾一些相關(guān)受體

2.4.1 4-1BBL 最近的一些報道顯示，第2代CAR組成型表達(dá)CD28配體或4-1BB配體（CD80或4-1BBL）可以增強(qiáng)體內(nèi)T細(xì)胞活性，當(dāng)4-1BB與4-1BBL或抗體激動劑結(jié)合，共刺激信號可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，并抑制活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫殺傷功能。同時，誘導(dǎo)單核細(xì)胞等活化，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，使單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。這可能以雙向的方式在T細(xì)胞內(nèi)直接傳導(dǎo)信號，并間接觸發(fā)TME中其他表達(dá)4-1BB的免疫細(xì)胞。在第2代CAR組成型表達(dá)4-1BBL的研究中，與正常的CD19 CAR-T相比，表達(dá)4-1BBL的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以最低劑量注射，且在回輸CAR-T后一周便消除了腫瘤，顯著優(yōu)于CD19 CAR-T［31］。因此，共表達(dá)4-1BBL可稱為CAR-T設(shè)計的一種有效思路。

2.4.2 CD40L 實(shí)體瘤的免疫治療需要有效地破壞免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。CD40-CD40L介導(dǎo)的信號能夠誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的活化，增強(qiáng)對弱免疫原性腫瘤細(xì)胞抗原的呈遞，從而誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫。設(shè)計CAR-T細(xì)胞表達(dá)CD40L便可以激活該信號通路，增加其抗腫瘤活性。Marigo等［32］證實(shí)在樹突狀細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子時，CD40/CD40L信號通路對與CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤排斥是必須的，CD8+T細(xì)胞是有效抗腫瘤細(xì)胞免疫的核心。另外CD40分子與活化的T細(xì)胞表面CD40L相互作用，增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，增加細(xì)胞因子的釋放，有效提高宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，可以設(shè)想通過將CAR修飾T細(xì)胞與CD40-CD40L途徑組合來實(shí)現(xiàn)腫瘤的消除。

2.4.3 DN TGF-βR Dominant-negative TGF-β受體（DN TGF-βR）是一類TGF-β的受體，可以結(jié)合TGF-β，從而減少TGF-β的量，進(jìn)而減少免疫抑制效應(yīng)。TME中存在許多由腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制性細(xì)胞因子，包括顯著抑制腫瘤特異性免疫的TGF-β?；诖藱C(jī)制，減少T細(xì)胞表面該受體的表達(dá)是克服TGF-β誘導(dǎo)免疫抑制的有效策略。Bol‐lard等［33］證明EBV特異性T細(xì)胞表達(dá)DN TGF-βR可以抑制TGF-B的抑制作用，從而延長T細(xì)胞存活時間，體內(nèi)試驗(yàn)中，表達(dá)DN TGF-βR的CAR-T細(xì)胞在模型體內(nèi)的存活時間明顯優(yōu)于正常的CAR-T細(xì)胞，從而提升CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的作用時間，提升抗腫瘤活性。在臨床試驗(yàn)NCT03089293涉及前列腺癌的治療過程中，在前列腺特異性膜抗原靶向CAR載體中表達(dá)dominant-negative TGFβ受體，以減少TGF-β抑制T細(xì)胞的活性的作用。目前該臨床試驗(yàn)還處于Ⅰ期。

2.5 阻斷免疫檢查點(diǎn)

先前的報道顯示，實(shí)體瘤采用各種對策來削弱T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，包括T細(xì)胞表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)。這些在活化的T細(xì)胞上表達(dá)的免疫性受體與表達(dá)在靶細(xì)胞上的配體具有高親和力，有效抑制T細(xì)胞的效力。為了克服這一障礙，一些有效的技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，包括單克隆抗體（mAb）和基因編輯。對于mAb免疫療法，與免疫檢查點(diǎn)阻斷相關(guān)的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明，mAb可以逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭并恢復(fù)抗腫瘤免疫性，如抗PD-1的mAb，抗LAG3的mAb和抗BISTA的mAb。

CRISPR/Cas9技術(shù)開發(fā)了破壞免疫檢查點(diǎn)來重新編程T細(xì)胞的非病毒方法。Su等證明通過電轉(zhuǎn)染編碼sgRNA和Cas9的治理來敲除T細(xì)胞的PD-1，導(dǎo)致PD-1表達(dá)的顯著降低，細(xì)胞毒性顯著增強(qiáng)。Gao等［34］證明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除CTLA4的細(xì)胞毒性T細(xì)胞能夠抑制腫瘤生長并促進(jìn)腫瘤根除。因此，包括CAR-T細(xì)胞和檢查點(diǎn)阻斷在哪的一體化方法有助于提高T細(xì)胞的功效。

為了逆轉(zhuǎn)PDL-1介導(dǎo)的T細(xì)胞耗竭，Prosser等［35］提供了一種新策略，通過將PD-1的跨膜和胞內(nèi)域與CD28進(jìn)行交換，從而將PD-1轉(zhuǎn)化為T細(xì)胞共刺激受體。研究表明，腫瘤PDL1能夠顯著刺激表達(dá)PD-1，CD28嵌合受體的T細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌增加并增加細(xì)胞毒性。

3 應(yīng)用前景

CAR-T細(xì)胞療法在一些針對血液惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)中取得巨大成功，為治療富含免疫抑制因子的實(shí)體瘤提供了一種可行的方案。最近幾年，免疫抑制環(huán)境的特征已經(jīng)詳細(xì)闡明，提出了一些能夠讓CAR-T細(xì)胞克服這些障礙和增強(qiáng)腫瘤消除的新方法。有研究報道聯(lián)合使用特殊設(shè)計的分子佐劑可以增強(qiáng)CAR-T的殺傷活性，也為探索CAR-T的實(shí)體瘤治療提供了新的思路與方向［36］。借鑒于CAR-T治療實(shí)體瘤的研究，在抗衰老方面CAR-T的應(yīng)用也加速進(jìn)行，近些年就有多篇報道關(guān)于CAR-T抗衰老研究，主要是應(yīng)用于直接對抗衰老細(xì)胞［37］，其基礎(chǔ)也是基于CAR-T的實(shí)體瘤治療。本文概述了實(shí)體瘤TME對免疫監(jiān)視的抑制機(jī)制，并探討了通過優(yōu)化CAR結(jié)構(gòu)和改善腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制環(huán)境來增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞功效的一些有前景的方法。為了增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的療效，通過修飾T細(xì)胞以維持細(xì)胞毒性，同時通過重塑改善實(shí)體瘤腫瘤微環(huán)境以增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的療效，以此來達(dá)到CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體腫瘤的目的。