超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速篩查及測(cè)定蜂蜜中20 種植物源毒性成分

韋 環(huán)，劉珈玲，廖 強(qiáng)

（廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西南寧 530021）

我國(guó)《蜜蜂產(chǎn)品術(shù)語(yǔ)》（GB/T 20573-2006）對(duì)蜂蜜的定義為：是蜜蜂采集植物的花蜜，蜜露等分泌物，與自身分泌物結(jié)合后在巢脾內(nèi)經(jīng)過(guò)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)。不僅口感香甜，且具有潤(rùn)肺止咳、潤(rùn)腸通便、清熱解毒等功效[1?2]，因此深受人們的喜愛(ài)。蜂蜜本無(wú)毒，但在生產(chǎn)過(guò)程中被污染或蜜蜂采集有毒花蜜釀制而成的蜂蜜可能會(huì)引起中毒。尤其野生蜂蜜是食物中毒事件的主要致病因子之一[3?4]。建國(guó)以來(lái)廣西、云南、貴州、福建多地都相繼報(bào)道了食用野生蜂蜜中毒事件[5?7]。食用有毒蜂蜜后會(huì)引發(fā)一系列的中毒癥狀，如惡心、嘔吐、腹瀉、四肢麻木、血壓下降、呼吸中樞麻痹等，嚴(yán)重將引發(fā)休克甚至死亡[4,6,8]，且中毒程度及癥狀與蜂蜜所含的毒素種類(lèi)和含量密切相關(guān)。有毒蜂蜜中所含毒素主要來(lái)源于蜜蜂采集了有毒源性的植物花粉，如斷腸草、雷公藤和狼毒等[6,8?10]；雷公藤、斷腸草、洋金花、烏頭、千里光等所含毒性物質(zhì)主要為生物堿和萜類(lèi)化合物，如烏頭中的二萜類(lèi)生物堿：烏頭堿[11]；博落回中的異喹啉類(lèi)生物堿：小檗堿、原阿片堿和別隱品堿[12]；菊科（如千里光屬和澤蘭屬）中的吡咯里西啶類(lèi)生物堿：千里光寧堿、千里光菲林生物堿、倒千里光堿[10,13]；胡蔓藤屬中的吲哚類(lèi)生物堿：鉤吻堿、鉤吻素已、胡蔓藤堿丙、胡蔓藤堿丁[14]；馬桑屬中的萜類(lèi)化合物馬桑亭[15]等。

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜》（GB 14963-2011）中明確規(guī)定“蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露應(yīng)安全無(wú)毒，不得來(lái)源于雷公藤、博落回、狼毒等有毒蜜源植物。”但并未列出具體植物源毒性成分和相關(guān)檢測(cè)方法。目前國(guó)內(nèi)對(duì)植物中相關(guān)毒性物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[16?17]、氣相色譜法[18]、酶聯(lián)免疫吸附分析[19?20]、薄層層析測(cè)定法[21?22]、氣相色譜-質(zhì)譜法[23?25]、液相色譜-質(zhì)譜法[15?16,26?28]等。液相色譜法檢測(cè)靈敏度較低，適合于含量較高的樣品如中草藥；酶聯(lián)免疫吸附分析法酶活性易損失、無(wú)法對(duì)各類(lèi)成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析；氣相色譜-質(zhì)譜法及液相色譜-質(zhì)譜法均可實(shí)現(xiàn)微量衡量同時(shí)多組分分析，是目前司法鑒定主要方法，但氣相色譜-質(zhì)譜法不適用于熱不穩(wěn)性及高沸點(diǎn)化合物，液相色譜-質(zhì)譜法可有效解決這樣難題，但傳統(tǒng)的三重四極桿質(zhì)譜需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)定性確證。高分辨質(zhì)譜儀可依據(jù)其高質(zhì)量準(zhǔn)確度、高質(zhì)量分辨率的全掃描數(shù)據(jù)在不需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下實(shí)現(xiàn)定性確證，在食品定向和非定向篩查中應(yīng)用廣泛。

目前我國(guó)關(guān)于蜂蜜的質(zhì)量安全研究多以獸藥殘留[29]、農(nóng)藥殘留[30]、重金屬[31]和真?zhèn)舞b別[32?33]為主，對(duì)于蜂蜜中植物源性毒性成分的研究甚少，僅有少數(shù)對(duì)有毒蜜源性植物雷公藤、昆明山海棠和博落回中毒性成分及其分析方法進(jìn)行了報(bào)道[6,10,34?35]，但是研究成分單一，各方法相對(duì)獨(dú)立且選擇性差、定性能力弱。食物中毒作為突發(fā)公共衛(wèi)生事件，往往需要在短時(shí)間內(nèi)查明中毒原因，對(duì)于行蹤不定的野生蜜蜂其蜜源難以通過(guò)其行蹤來(lái)推斷其蜜源植物。因此，迫切需要建立蜂蜜中植物源性多種毒性物質(zhì)的快速篩查方法。四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜儀（QExactive）具有良好的定性分析和高分辨率的特點(diǎn)，在單個(gè)分析周期內(nèi)即可完成對(duì)樣品高通量、高精度的一級(jí)、二級(jí)掃描，為化合物的準(zhǔn)確鑒定提供了客觀依據(jù)。

本研究以固相萃取法純化樣品，應(yīng)用高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立蜂蜜中20 種植物源毒性成分的快速篩查和測(cè)定方法，基于高分辨質(zhì)譜的精準(zhǔn)分子量和多級(jí)碎片信息確立了20 種植物源毒性成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。該方法快速、準(zhǔn)確、通量高，為進(jìn)一步開(kāi)展蜂蜜溯源，安全性評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)評(píng)估食用蜂蜜中毒提供參考，保障了蜂蜜的食用安全和提升了質(zhì)量控制水平。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)野百合堿（CAS：315-22-0，純度99.48%）、鉤吻堿（CAS：509-15-9，純度98.19%）、東莨菪堿氫溴酸鹽（CAS：114-49-8，純度98.7%）、倒千里光堿（CAS：480-54-6，純度98.02%）、鉤吻素子（CAS：1358-76-5，純度98.34%）、千里光寧（CAS：130-01-8，純度99.48%）、鉤吻堿己（CAS：82354-38-9，純度99.53%）、馬桑亭（CAS：91653-75-7，純度98.96%）、鬧羊花毒素II（CAS: 26116-89-2，純度99.79%）、鬧羊花毒素V（CAS：37720-86-8，純度99.82%）、原阿片堿（CAS：130-86-9，純度99.56%）、A-別隱品堿（CAS：485-91-6，純度98.58%）、次烏頭堿（CAS：6900-87-4，純度99.04%）、烏頭堿（CAS：302-27-2，純度98.52%） 美國(guó)斯坦福化學(xué)公司；春千里光堿（CAS：72755-25-0，純度99.72%）、春千里光堿N 氧化物（CAS：101687-28-9，純度99.87%）、N-氧化芝麻菜葉千里光（CAS：123864-94-8，純度99.35%）、胡蔓藤堿乙（CAS：82375-29-9，純度98%）

德國(guó)PhytoLab 公司；千里光菲靈堿（CAS：480-81-9，純度99.53%） 成都德思特生物技術(shù)有限公司；鬧羊花毒素III（CAS：26342-66-5，純度98.6%） 上海源業(yè)生物科技有限公司）；SPE 小柱：混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱（MCX，60 mg，3 cc） 美國(guó)沃特斯有限公司；甲醇、乙腈、甲酸 均為色譜純，德國(guó)默克公司；其余 均為分析純；實(shí)驗(yàn)用樣品為蜜博士百花蜂蜜（批號(hào)20190115） 廣西蜜博士蜂業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，經(jīng)預(yù)檢驗(yàn)樣品中不含有上述20 種化合物），其余66 批均購(gòu)于廣西南寧、崇左、貴港、來(lái)賓、欽州等地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或蜜蜂養(yǎng)植基地。

Ultimate 3000 超高效液相色譜儀-Q-Exactive四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；XS205 DU 電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Multi Reax 全自動(dòng)振蕩儀德國(guó)Heidolph 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取野百合堿、鉤吻堿、東莨菪堿氫溴酸鹽、倒千里光堿、鉤吻素子、千里光寧、鉤吻堿己、馬桑亭、鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III、鬧羊花毒素V、原阿片堿、別隱品堿、次烏頭堿、烏頭堿、春千里光堿、春千里光堿N 氧化物、N-氧化芝麻菜葉千里光、胡蔓藤堿乙、千里光菲靈堿等20 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各約10 mg（精確至0.1 mg），分別置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成約1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別精密量取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL，置于同一100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，得到10 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

1.2.2 樣品處理 稱(chēng)取1 g（精確至0.01 g）樣品，置于15 mL 聚丙烯離心管中，加入水5 mL，振蕩使溶解，將所有溶液通過(guò)混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱使用前依次用5 mL 甲醇、5 mL 水活化）中，棄去洗脫液，然后用10 mL 水淋洗小柱，棄去，再用9 mL 5%氨化甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液至10 mL 容量瓶中，使用5%氨化甲醇定容，混勻后經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相濾膜過(guò)濾，即得。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 液相條件 色譜柱：Thermo GOLD AQC18柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A 為含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸銨溶液，B 為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序：0.0～5.0 min，5%～20% B；5.0～10.0 min，20%～45% B；10.0～13.0 min，45%～90% B；13.0～14.0 min，90 % B；14.0～15.0 min，90%～5% B；15.0～20.0 min，5% B。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源采用HESI 源（heated ESI），噴霧電壓為3.5 kV（+）/3.0 kV（?），透鏡電壓為50 V，離子傳輸管溫度：320 °C，鞘氣流量：35 arb；輔助氣體流量：10 arb；輔助氣溫度：300 °C。掃描方式：采用正、負(fù)離子同時(shí)掃描，采集模式：Full MS/dd-MS2模式，其中一級(jí)全掃描的分辨率：70000 FWHM，掃描范圍：m/z 50～1200，自動(dòng)增益（AGC）：3×106，最大駐留時(shí)間：100 ms；二級(jí)掃描分辨率：17500 FWHM，自動(dòng)增益（AGC）：2×105，最大駐留時(shí)間: 50 ms；質(zhì)荷比窗口寬度（Isolation Window）：m/z 2.0；頂點(diǎn)激發(fā)（Apex tigger）：4～8 s；排除同位素峰（Exclude isotopes）設(shè)為“on”，動(dòng)態(tài)排除（Dynamic Exclusion）設(shè)為6.0 s，歸一化碰撞能量（NCE）為20%、40%、60%。20 種物質(zhì)其他條件詳見(jiàn)表1。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

精取“1.2.1”標(biāo)準(zhǔn)使用液1.0 mL，置于100 mL 容量瓶中用甲醇定容至刻度；按“1.2.3”條件進(jìn)樣，將得到的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)Xcalibar 軟件得到目標(biāo)物的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、二級(jí)碎片離子等信息，將信息輸入到篩查軟件TraceFinder 下，建立質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（Compound Database）。

1.4 定量檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用Full MS/dd-MS2 模式，選擇母離子（見(jiàn)表1）進(jìn)行外標(biāo)法定量。

表1 20 種植物源性毒性成分的分子式、保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)、質(zhì)量數(shù)偏差及主要二級(jí)離子Table 1 Molecular formula, retention time, precise mass number, mass number deviation and main secondary ion mass number of 20 plant-derived toxic

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于本次實(shí)驗(yàn)20 種化合物來(lái)源于多種植物，且大部分為生物堿類(lèi)成分，極性差異較大。故本實(shí)驗(yàn)分別考察了Thermo GOLD AQ-C18、Agilent HILIC（150 mm×2.1 mm，3 μm）、ACE Excel2 C18-PFP（150 mm×2.1 mm，3 μm）三種類(lèi)型的色譜柱，結(jié)果Thermo GOLD AQ-C18在20 種化合物中分離效果和峰形最佳；在流動(dòng)相的考察中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈離子化能力強(qiáng)于甲醇，且基線(xiàn)噪音較低；0.1%甲酸乙腈能有效改善峰形及離子化效果，故選0.1%甲酸乙腈作為有機(jī)相；水相中加入0.1%甲酸后離子化效率、化合物響應(yīng)值更高；加入10 mmol/L 甲酸銨后能兼顧負(fù)離子掃描時(shí)也得到較好的響應(yīng)，故最終0.1%甲酸（含10 mmol/L 甲酸銨）作為水相流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)使用了Full MS/dd-MS2采集模式，該模式首先進(jìn)行一級(jí)全掃描，然后對(duì)指定的前級(jí)離子做進(jìn)一步的二級(jí)掃描。在實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)一級(jí)全掃描的質(zhì)譜參數(shù)先后考察了35000、70000及140000 的分辨率對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的影響，結(jié)果顯示使用140000 的分辨率一級(jí)離子的靈敏度會(huì)顯著降低，這可能是由于過(guò)高的分辨率會(huì)顯著降低掃描速度，造成一級(jí)掃描點(diǎn)數(shù)不足，造成色譜峰形變差，影響分析，故選擇了一級(jí)質(zhì)譜掃描采用70000 的分辨率。

2.2.2 物質(zhì)電離方式的優(yōu)化 在1.2.3 質(zhì)譜條件下，鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III 易發(fā)生離子源內(nèi)裂解，鬧羊花毒素II m/z=410.22990 考慮到其結(jié)構(gòu)可能在離子源內(nèi)裂解失去-C2H3O2, 形成了穩(wěn)定的雙鍵得到m/z=297.18439（見(jiàn)圖1）；鬧羊花毒素III m/z=329.19587 在離子源內(nèi)裂解失去4 個(gè)H2O 后形成了穩(wěn)定的雙鍵，得到m/z=297.18439（見(jiàn)圖2）。鬧羊花毒素V[M+H]+電離模式下沒(méi)有加氫峰，而在[M+Na]+電離模式下有極強(qiáng)的加鈉峰；馬桑亭在[M-H]?電離模式下能得到很好的減氫峰，其它17 種植物源性毒性成分在[M+H]+電離模式下均能得到很好的加氫峰。

圖1 鬧羊花毒素II 的裂解圖Fig.1 Chinese azalea flowers toxins II cracking figure

圖2 鬧羊花毒素IIII 的裂解圖Fig.2 Chinese azalea flowers toxins IIII cracking figure

2.3 固相萃取小柱的選擇

由于20 種植物源性毒性成分多數(shù)生物堿等堿性物質(zhì)，故本實(shí)驗(yàn)選擇了混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱（MCX）、混合型弱陽(yáng)離子交換固相萃取小柱（PCX）、Waters Oasis HLB 三種類(lèi)型對(duì)生物堿有效好保留的固相萃取小柱進(jìn)行前處理考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱（MCX）對(duì)20 種植物源性毒性成分具有高的選擇性和靈敏度，均獲得了很好的凈化效果；而Waters Oasis HLB 對(duì)千里光菲靈堿的保留較差，回收率只有62.81%；從圖3 中能看出 PCX 對(duì)鉤吻堿、千里光菲靈堿、鉤吻素子、千里光寧（千里光堿）、春千里光堿、鉤吻堿己、原阿片堿、胡蔓藤堿乙、別隱品堿、次烏頭堿、烏頭堿保留較差，回收率都無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求；故首選了Waters Oasis MCX 混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱進(jìn)行樣品提取凈化。

圖3 20 種植物源性毒性成分過(guò)不同萃取小柱的回收率Fig.3 Recovery rate of 20 plant-derived toxic ingredients through different extraction column

2.4 凈化方法的優(yōu)化

2.4.1 淋洗溶劑的優(yōu)化 蜂蜜屬于高復(fù)雜度過(guò)飽和混合物，而糖類(lèi)作為其主要化學(xué)成分，占蜂蜜干物質(zhì)的95%左右，其中葡萄糖和果糖含量最高，蔗糖其次[36]。在淋洗溶劑的選擇上，對(duì)甲醇和水進(jìn)行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用甲醇進(jìn)行淋洗會(huì)導(dǎo)致馬桑亭、鬧羊花毒素V、鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III 等成分跟隨淋洗液共流出，使得回收率降低。而水對(duì)糖類(lèi)物質(zhì)溶解性較好，且用水淋洗時(shí)目標(biāo)成分隨淋洗液共流出較少，故洗擇水作為淋洗液。進(jìn)而對(duì)淋洗溶劑的量進(jìn)行了考察，分別考察了使用5、10、15 mL 水進(jìn)行淋洗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15 mL 水洗脫會(huì)導(dǎo)致雷公藤乙素回收降低10%左右，10 mL 水能夠?qū)⑻穷?lèi)物質(zhì)洗脫完全，且目標(biāo)成分獲得較好的回收，回收率結(jié)果均大于70%

2.4.2 洗脫溶劑的優(yōu)化 因目標(biāo)成分均為生物堿類(lèi)物質(zhì)，在堿性條件下較易洗脫，故選擇5%氨化甲醇作為洗脫溶劑。分別考察了5、9、15 mL 5%氨化甲醇3 種洗脫劑對(duì)目標(biāo)分析物的影響，綜合考慮目標(biāo)分析物的洗脫效果和節(jié)省溶劑等因素，最后選擇9 mL 5%氨化甲醇作為洗脫溶劑，能夠達(dá)到最佳洗脫效果。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的影響

基質(zhì)效應(yīng)普遍存在于質(zhì)譜檢測(cè)中，表現(xiàn)為離子增強(qiáng)效應(yīng)或離子抑制效應(yīng)，從而導(dǎo)致定量結(jié)果有一定的偏差。通?；|(zhì)效應(yīng)消除方法有固相萃取凈化、同位素內(nèi)標(biāo)法、稀釋法等[37]，而通過(guò)對(duì)比基質(zhì)匹配標(biāo)液與相同濃度的純?nèi)軇?biāo)液的儀器響應(yīng)值來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)，計(jì)算公式為基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配標(biāo)液響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)液響應(yīng)值，若兩者比值在85%～115%，則基質(zhì)效應(yīng)可忽略[38]。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取凈化的方法來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，如圖4 所示，經(jīng)過(guò)MCX凈化之后，兩者比值在85%～115%之間，其基質(zhì)效應(yīng)得到有效消除。因此，本文采用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，外標(biāo)法定量。

圖4 20 種植物源性毒性成分的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 The matrix effects of 20 plant-derived toxic ingredients

2.6 數(shù)據(jù)庫(kù)的篩查

通過(guò)TraceFinder 軟件建立的數(shù)據(jù)庫(kù)與樣品的保留時(shí)間、主要二級(jí)碎片、同位素分布和二級(jí)質(zhì)譜圖相識(shí)度比對(duì)等多種方法，綜合判斷，以得到準(zhǔn)確定性結(jié)果，避免假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的出現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)多組分無(wú)對(duì)照同時(shí)篩查的定性分析。具體分析物質(zhì)的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)及碎片離子、保留時(shí)間、電離模式如表1 所示；20 種植物源性毒性成分的提取離子流色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 20 種植物源性毒性成分的提取離子流色譜圖Fig.5 Extracted ion flow chromatograms of 20 plant-derived toxic ingredients

2.7 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別精密吸取“1.2.1”項(xiàng)下溶液0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 mL 至10 mL 容量瓶中，使用甲醇溶液稀釋成濃度約為10.0、20.0、50. 0、100. 0、200.0 μg /L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按1.2.3 方法測(cè)定。用外標(biāo)法定量，以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/L）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求得回歸方程。再分別吸取“1.2.1”溶液，逐步稀釋?zhuān)凑铡?.2.3”色譜條件測(cè)定；取信噪比為3:1 的質(zhì)量濃度為檢出限，詳見(jiàn)表2，結(jié)果表明20 種待測(cè)化合物在各自范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，r均大于0.995。

表2 20 種植物源性毒性成分的線(xiàn)性及相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linearities and correlation coefficients and detection limits of 20 plant-derived toxic ingredients

2.8 精密度試驗(yàn)

精密吸取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果測(cè)得20 種化合物峰面積的RSD 范圍在0.5%～2.3%之間，表明儀器精密度良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

分別稱(chēng)取1.00 g 樣品六份，置于15 mL 聚丙烯具塞離心管中，分別添加0.02 mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（加入量約200 ng），按“1.2.2”項(xiàng)下制備并依法測(cè)定。結(jié)果測(cè)得野百合堿、鉤吻堿、東莨菪堿氫溴酸鹽、倒千里光堿、鉤吻素子、千里光寧、鉤吻堿己、馬桑亭、鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III、鬧羊花毒素V、原阿片堿、A-別隱品堿、次烏頭堿、烏頭堿、春千里光堿、春千里光堿N 氧化物、N-氧化芝麻菜葉千里光、胡蔓藤堿乙、千里光菲靈堿的RSD 分別為0.8%、 1.3%、 1.6%、 1.1%、 0.8%、 1.9%、 2.1%、1.4%、 0.8%、 0.6%、 1.3%、 0.7%、 0.5%、 2.4%、1.8%、1.6%、1.1%、0.5%、1.8%、2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“1.2.2”項(xiàng)下同一樣品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12 和24 h 按“1.2.3”色譜條件進(jìn)樣，記錄相應(yīng)的色譜峰面積，結(jié)果樣品中20 種峰面積的RSD 范圍在0.8%～2.1%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

分別稱(chēng)取1.00 g 樣品18 份，置于15 mL 聚丙烯具塞離心管中，分別添加0.01、0.02、0.1 mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液各6 份，按“1.2.2”操作，進(jìn)行低、中、高3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，按1.2.3操作進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率（結(jié)果見(jiàn)表3）；結(jié)果如表所示各植物源性毒性成分回收率介于74.1%～114.6%之間，表明本檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度高，可滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室的日常分析需求。

表3 20 種植物源性毒性成分的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Aaverage recoveries and relative standard deviations of 20 kinds of plant-derived toxic ingredients (n = 6)

2.12 實(shí)際樣品分析

按“1.2”方法將66 批蜂蜜樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在8 批蜂蜜樣品中檢出東莨菪堿，含量在20～1400 μg/kg 之間；其中2 批蜂蜜中另檢出倒千里光堿，含量在48～150 μg/kg 之間；2 批蜂蜜中檢出N-氧化千里光菲靈堿含量在49～80 μg/kg 之間，詳情見(jiàn)表4，結(jié)果表明，在蜂蜜中檢出有毒化合物占12%，在蜂蜜中存在一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果（μg/kg）Table 4 Results of random test (μg/kg)

3 結(jié)論

本研究建立了以純水提取，混合型陽(yáng)離子交換固相萃取小柱（MCX）凈化，結(jié)合超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法對(duì)蜂蜜中的20 種植物源性毒性成分進(jìn)行測(cè)定，其中檢出了東莨菪堿、倒千里光堿和N-氧化千里光菲靈堿，提示食用蜂蜜還是存在一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。方法的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果都符合要求，證明該方法在對(duì)蜂蜜進(jìn)行20 種植物源性毒性成分的定性定量分析時(shí)提供可靠、重復(fù)、并且準(zhǔn)確的結(jié)果；滿(mǎn)足日常檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)篩查要求。