李志瑛 穆治華 肖勇 范海闊

摘 ?要：本文對(duì)幾個(gè)影響矮種椰子成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)及褐化程度的因素進(jìn)行研究。以海南優(yōu)良矮種椰子‘文椰2號(hào)和‘文椰4號(hào)11月齡的成熟胚為材料，研究不同的基因型、凝固劑、激素濃度和接種方式對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率和外植體褐化程度的影響。結(jié)果顯示：以‘文椰2號(hào)成熟胚為材料，愈傷率最高個(gè)體為H1;接種至PhytagelTM-P8169凝固劑的愈傷率最高，為71.43%;接種至Gelrite-G1910凝固劑的褐化率最低，為40.00%;接種至添加110?μmol/L 2，4-D的培養(yǎng)基的愈傷率最高，為63%，褐化率最低，為46.67%;剝?nèi)∨哐拷臃N的愈傷率最高，為48.72%，其褐化率與完整胚接種的無(wú)顯著性差異。以‘文椰4號(hào)成熟胚為材料，愈傷率最高個(gè)體為X1;接種至Agar-A8190凝固劑的愈傷率和褐化率最高，分別為46.15%和30.77%;接種至Gelrite-G1910凝固劑的褐化率最低，為16.67%;接種至添加600?μmol/L 2，4-D的培養(yǎng)基愈傷率最高，為40.00%，但與110?μmol/L 2，4-D無(wú)顯著性差異;接種至110?μmol/L 2，4-D的褐化率最低，為50.00%;縱切接種獲得愈傷率最高，為40.00%;完整胚接種褐化率最低，為33.33%。結(jié)果表明：基因型、凝固劑、激素濃度和外植體接種方式對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率均有顯著影響?！囊?號(hào)愈傷組織誘導(dǎo)的最佳2，4-D濃度為110?μmol/L，最佳凝固劑為PhytagelTM-P8169，最佳接種方法為剝?nèi)∨哐拷臃N。‘文椰4號(hào)愈傷組織誘導(dǎo)的最佳2，4-D濃度為110?μmol/L，最佳凝固劑為Agar-A8190，最佳接種方法為胚縱切接種。

關(guān)鍵詞：椰子;愈傷組織;組織培養(yǎng)

Abstract： Tissue culture technique is an efficient way to speed-up coconut multiplication. In this study， the factors limiting callus induction efficiency and the method to control browning rate were studied. Improvement of callus induction efficiency of coconut and the theoretical basis for an optimized condition of induction were presented. The 11-month-old mature embryos of ‘Wenye 2 and ‘Wenye 4， two elite dwarf coconut cultivars， were used as the explant materials. Experiments was conducted to evaluate the influence of genotype， optimum hormone concentration， gelling agent and inoculation method on callus induction and explant browning. When using the embryos from ‘Wenye 2 as the explant， a higher callus induction rate （83.33%） was from H1. The highest number of calluses were observed in the medium with 4 g/L PhytagelTM-P8169 （71.43%） and 110 μmol/L 2，4-D （63.00%） respectively， while rest treatments showed no significant difference. The highest rate of callus induction （48.72%） was observed in the treatment using plumule isolation techniques. As to the browning rate， the lowest were found in the medium containing 3?g/L Gelrite-G1910 （40.00%） and 110?μmol/L 2，4-D （46.67%） and in the plumule isolation treatment （66.67%）. When using the embryos from ‘Wenye 4 as the explant， the improved treatments for callus induction of coconut were genetics X1 （66.67%）， 6?g/L Agar-A8190 （46.15%）， 600 μmol/L 2，4-D （40.00%） and longitudinal cutting （58.33%）， but the difference was not significant between 600?μmol/L 2，4-D and 110 μmol/L 2，4-D. As to the browning， the lowest browning rate was showed in the medium containing 3?g/L Gelrite-G1910 （16.67%） and 110?μmol/L 2，4-D （50.00%） and in the induction method of embryo （33.33%）. This study explored that genotype of parent plants， the concentration of 2，4-D， gelling agent and condition of induction also had significant effects on the rate of callus induction and ‘Wenye 2 was better as the explant than ‘Wenye 4. For the callus induction of ‘Wenye 2， the suitable hormone concentration， gelling agent and inoculation were 110?μmol/L 2，4-D， PhytagelTM-P8169 and inducing plumule. For ‘Wenye 4， 110 μmol/L 2，4-D， Agar-A8190 and longitudinal embryo cutting techniques were the best for callus induction.

Keywords： coconut; callus; tissue culture

椰子（Cocos nucifera L.）為棕櫚科椰子屬多年生喬木，是典型的熱帶木本油料作物和食品作物，也是熱帶沿海生態(tài)林建設(shè)和園林綠化的重要植物之一，主要分布在我國(guó)海南地區(qū)。椰子是海南地理標(biāo)志性物種，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、利用率高，被視為解決熱區(qū)人民對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪能源需要以及增加農(nóng)民就業(yè)機(jī)會(huì)，幫助農(nóng)民脫貧致富的重要作物[1]。目前椰子面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，如產(chǎn)量不穩(wěn)定、病蟲(chóng)害脅迫、種苗良莠不齊、樹(shù)齡老化、自然災(zāi)害等問(wèn)題[2]。而目前椰子市場(chǎng)需求越來(lái)越大，現(xiàn)有椰果及椰苗無(wú)法滿足市場(chǎng)需求[3]。傳統(tǒng)椰子育苗采用種果繁殖，繁殖系數(shù)低，而椰子的莖干不分枝，導(dǎo)致扦插、嫁接和壓條等方法不能應(yīng)用于椰子無(wú)性繁殖。且椰子多為異花授粉，后代性狀分離，個(gè)體差異大。因此，傳統(tǒng)的椰子種苗繁育方式無(wú)法持續(xù)穩(wěn)定地提供大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗[4]。組織培養(yǎng)技術(shù)為椰子快繁提供了新的途徑。1954年，Cutter等[5]使用椰子水培養(yǎng)椰子胚促使其萌發(fā)。此后，隨著體胚發(fā)生途徑技術(shù)在其他作物，如煙草、胡蘿卜和小麥上的日益成熟，椰子組織培養(yǎng)技術(shù)也突飛猛進(jìn)[6]。1976年，Eeuwens[7]發(fā)明椰子專(zhuān)用培養(yǎng)基Y3。1983年，首次利用花藥培養(yǎng)獲得椰子的胚性愈傷組織[8]。此后，未受精子房、胚芽、成熟胚和未成熟花序等外植體均被用于椰子體胚發(fā)生技術(shù)研究，且成功獲得組培苗[9-11]。其中，椰子胚和胚芽的愈傷誘導(dǎo)效率高于其他外植體。Pérez-Núez[12]經(jīng)過(guò)理論計(jì)算得出1個(gè)胚芽通過(guò)誘導(dǎo)可最終產(chǎn)生98 000個(gè)體胚，誘導(dǎo)效率約為體細(xì)胞的五萬(wàn)倍。因此，以胚芽為外植體的椰子組培技術(shù)將是椰子快繁的有效方法之一。但目前為止，椰子組織培養(yǎng)技術(shù)尚未達(dá)到有效無(wú)性繁殖并商業(yè)化推廣的目的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)椰子成熟胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，探討了基因型、凝固劑種類(lèi)、激素濃度和接種方法對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)效果及外植體褐化程度的影響，初步研究成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的條件和方法，以期為椰子組培技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供一定的參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗(yàn)椰子品種為矮種椰子新品種‘文椰2號(hào)和‘文椰4號(hào)，以11月齡椰果的成熟胚為試驗(yàn)材料。椰果取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所椰子種質(zhì)資源圃。

1.2 ?方法

1.2.1 ?取樣及愈傷組織誘導(dǎo) ?選擇發(fā)育良好、“響水”的11月齡椰果，用刀去除部分果皮后砍開(kāi)內(nèi)果皮，倒出椰子水，椰果橫向砍開(kāi)。將胚及其周?chē)呐呷榍懈顬??cm×3?cm的小方塊后取出編號(hào)后帶回室內(nèi)處理。材料至于流水下，使用洗潔精去除表面塵土及污漬。將帶有胚的固體胚乳塊轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行消毒處理。75%酒精浸泡30?s，2.5% NaClO溶液消毒15?min，無(wú)菌水沖洗2～3次后剝?nèi)∨摺Ｈ〕龅呐哌M(jìn)行二次消毒。消毒方法為0.5% NaClO溶液浸泡10?min后無(wú)菌水沖洗2～3次。消毒完成的胚置于無(wú)菌濾紙上晾干表面水分，進(jìn)行直接接種或處理后接種至相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)以誘導(dǎo)愈傷組織。培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度27?℃～28?℃。

1.2.2 ?不同基因型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響 ?以 ‘文椰2號(hào)和‘文椰4號(hào)各6棵樹(shù)的椰果為取胚材料，取胚消毒后，以胚的中軸為準(zhǔn)，剖取胚芽后接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基Y3培養(yǎng)基+30?g/L蔗糖+600?μmol/L 2，4-D+2.5?g/L活性炭+3?g/L Gelrite-G1910。

1.2.3 ?不同凝固劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響 ?將表面干燥的胚置于體式顯微鏡下觀察，以胚中軸為準(zhǔn)，剝?nèi)∨哐拷臃N至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)。以Y3培養(yǎng)基+30?g/L蔗糖+600?μmol/L 2，4-D+2.5?g/L活性炭為基礎(chǔ)，分別添加6?g/L Agar-A8190、4?g/L PhytagelTM-P8169和3?g/L Gelrite-G1910作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基的凝固劑。

1.2.4 ?不同激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響 ?以胚為材料，以胚的中軸為準(zhǔn)，縱切后剝?nèi)∨哐拷臃N至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)。以Y3培養(yǎng)基+30?g/L蔗糖+3?g/L Gelrite-G1910+2.5?g/L活性炭為基礎(chǔ)，分別添加3?μmol/L（不添加活性炭），110?μmol/L和600?μmol/L的2，4-D作為誘導(dǎo)激素。

1.2.5 ?不同接種方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響 ?以胚為材料，采用以下3種方式：（1）將滅菌后的整胚吸干表面水分后直接接種;（2）以胚的中軸為準(zhǔn)，將胚縱切成兩半后切面朝向培養(yǎng)基接種;（3）將胚置于體視顯微鏡下，以胚的中軸為準(zhǔn)，剖取胚芽接種。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Y3培養(yǎng)基+30?g/L蔗糖+600?μmol/L 2，4-D+2.5?g/L活性炭+3?g/L植物凝膠Gelrite-G1910。

1.3 ?測(cè)定內(nèi)容

接種后90?d觀察記錄材料生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率、組織膨大率和萌發(fā)率。

愈傷誘導(dǎo)率=長(zhǎng)出愈傷組織的材料數(shù)/接種材料數(shù)×100%

褐化率=褐化面積>50%的材料數(shù)/接種材料數(shù)×100%

組織膨大率=出現(xiàn)膨大的材料數(shù)/接種材料數(shù)× 100%

萌發(fā)率=萌發(fā)出幼芽的材料數(shù)/接種材料數(shù)× 100%

1.4 ?數(shù)據(jù)分析

愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率、組織膨大率和萌發(fā)差異顯著性分析采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法，SPSS Statistics 22軟件分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同基因型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響

以取自不同樹(shù)的成熟胚的胚芽為材料，接種至培養(yǎng)基中，結(jié)果如表1所示。‘文椰2號(hào)共取胚芽30顆，接種誘導(dǎo)后，組織膨大率為90.00%，愈傷率為43.33%，褐化率為63.33%，萌發(fā)率為10.00%?！囊?號(hào)共取胚芽30顆，接種誘導(dǎo)后，組織膨大率為80.00%，愈傷率為36.67%，褐化率為46.67%，萌發(fā)率為0?！囊?號(hào)6棵樹(shù)中，H1的愈傷率最高，為83.33%，H2的褐化率最低，為25.00%，H3-H5的組織膨大率最高，均為100.00%，H5萌發(fā)率最高，為66.67%。‘文椰4號(hào)6棵樹(shù)中，X1的愈傷率最高，為66.67%，X1、X3和X6的褐化率最低，均為0，X4和X5的組織膨大率最高，均為100.00%。X1-X6的胚芽萌發(fā)率均為0。

2.2 ?不同凝固劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響

以成熟胚的胚芽為材料，接種至3種不同凝固劑的培養(yǎng)基中，結(jié)果如表2所示?！囊?號(hào)成熟胚的胚芽接種至PhytagelTM-P8169中的胚芽的組織膨大率和愈傷誘導(dǎo)率最高，分別為78.57%和71.43%。接種至Gelrite-G1910中的胚芽褐化率最低，為40.00%。接種至Agar-A8190的胚芽萌發(fā)率最高，為7.14%?！囊?號(hào)成熟胚的胚芽接種至Gelrite-G1910中的胚芽的組織膨大率最高，為50.00%。接種至Agar-A8190中的愈傷率最高，為46.15%。接種至Gelrite-G1910中的胚芽褐化率最低，為16.67%。接種至3種培養(yǎng)基

的胚芽萌發(fā)率無(wú)差別，均為0。

2.3 ?不同激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響

以成熟胚的胚芽為材料，接種至含有不同濃度2，4-D的培養(yǎng)基中，結(jié)果如表3所示。以‘文椰2號(hào)為材料，接種至600?μmol/L 2，4-D的胚芽的組織膨大率和萌發(fā)率最高，分別為90.91%和27.27%。接種至110?μmol/L 2，4-D的胚芽的愈傷誘導(dǎo)率最高，褐化率最低，分別為63.00%和46.67%。以‘文椰4號(hào)為材料，接種至110?μmol/L 2，4-D和600?μmol/L 2，4-D的胚芽的組織膨大率和愈傷率無(wú)顯著性差異，均顯著高于3?μmol/L 2，4-D。接種至110?μmol/L 2，4-D的胚芽的褐化率最低，為50.00%。萌發(fā)率在3種不同濃度的培養(yǎng)基上無(wú)顯著差異，均為0。

2.4 ?不同接種方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響

以成熟胚為材料，采用不同接種方式接種培養(yǎng)基中，結(jié)果如表4所示。以‘文椰2號(hào)為材料，3種不同的接種方式得到的組織膨大率無(wú)顯著性差異，剝?nèi)∨哐拷臃N的方式愈傷率最高，為48.72%。以完整胚接種和胚芽剝?nèi)〗臃N2種方式接種的褐化率較低，分別為61.11%和66.67%，二者間無(wú)顯著性差異。以完整胚接種的萌發(fā)率最低，為2.78%。以‘文椰4號(hào)為材料，縱切和胚芽剝?nèi)?種接種方式得到的組織膨大率均為100%?？v切接種的方式愈傷率最高，為58.33%。以完整胚接種的褐化率較低，為33.33%。3種接種方式的萌芽率均為0。

3 ?討論

對(duì)于椰子愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素，目前普遍認(rèn)為有遺傳全能性、外植體種類(lèi)、培養(yǎng)基成分、誘導(dǎo)條件等[13]。椰子愈傷組織誘導(dǎo)外植體通常包含未成熟花序、未受精子房、花藥、頂端生長(zhǎng)點(diǎn)、成熟胚及胚芽等。目前認(rèn)為從胚中剝?nèi)∨哐空T導(dǎo)的誘導(dǎo)效率較高，最適用于誘導(dǎo)愈傷組織[14]。本試驗(yàn)選用海南本土栽種的2種優(yōu)良矮種椰子新品種‘文椰2號(hào)和‘文椰4號(hào)為取樣材料，研究基因型、培養(yǎng)基激素濃度及凝固劑種類(lèi)和培養(yǎng)方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及外植體褐化的影響。

3.1 ?基因型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

前期研究表明取自West African Tall×Malayan Yellow Dwarf[15]、Mexican Malayan Dwarf[10]、Batu Layar Tall[16]、Malayan Green Dwarf[12]、Sri Lanka Tall[17]和Malayan Yellow Dwarf[3]等高種、矮種或雜交種的外植體材料均可誘導(dǎo)出組培苗。對(duì)于不同基因型的組織培養(yǎng)結(jié)果的差異性在椰子上未見(jiàn)報(bào)道。但在其他木本植物中，如紫荊、橡樹(shù)、北美楓香等[18]以及小麥[19]、玉米[20]等糧食作物中，取樣植株的基因型對(duì)再生體系的影響均有報(bào)道。

本研究以‘文椰2號(hào)為誘導(dǎo)材料，組織膨大率、愈傷組織的誘導(dǎo)比例均高于‘文椰4號(hào)，同時(shí)褐化率和胚的萌發(fā)率也高于‘文椰4號(hào)。通過(guò)對(duì)比2個(gè)品種的12棵樹(shù)的誘導(dǎo)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，‘文椰2號(hào)中，H1的愈傷率可達(dá)83.33%，其他5棵的愈傷率均等于小于50%?！囊?號(hào)中，X1的愈傷率高于其他5棵樹(shù)。以上結(jié)果表明取樣親本的品種之間和個(gè)體基因型對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響顯著?！囊?號(hào)更適用于作為愈傷組織的誘導(dǎo)材料，但因其外植體褐化率和萌發(fā)率較高，需要調(diào)整培養(yǎng)基成分及激素濃度如提升培養(yǎng)基糖濃度抑制胚的萌發(fā)，增加抗褐化劑如硫代硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）以降低褐化發(fā)生從而提高愈傷誘導(dǎo)率。

3.2 ?培養(yǎng)基成分對(duì)愈傷組織的影響

目前，椰子組織培養(yǎng)普遍以Y3培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以高濃度的2，4-D為愈傷組織誘導(dǎo)激素[2]。但是不同凝固劑對(duì)椰子組織培養(yǎng)的影響尚未有過(guò)報(bào)道。凝固劑可直接影響培養(yǎng)基的滲透勢(shì)，較高濃度的凝固劑可增強(qiáng)培養(yǎng)基的保水性，限制接種材料對(duì)于水分的吸收[21]。此外，凝固劑的種類(lèi)和濃度還可影響培養(yǎng)基中鈣、鉀、錳等離子的有效含量，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)結(jié)果[22]。長(zhǎng)期以來(lái)植物組織培養(yǎng)中多使用瓊脂作為凝固劑，但瓊脂通常含有較多雜質(zhì)，而植物凝膠Phytagel和Gelrite具有通氣性好、凝固溫度低、雜質(zhì)含量少、不易發(fā)生玻璃化等特點(diǎn)，但Gelrite易發(fā)生水化現(xiàn)象[23]。在巴拉圭冬青（Ilex Paraguariensis）的研究中，7種凝固劑的對(duì)比結(jié)果表明凝固劑的種類(lèi)對(duì)于外植體褐化、愈傷組織誘導(dǎo)、體胚的形成和萌發(fā)、再生芽生根等均有顯著差異[24]。Zimmerman等[25]的研究表明Gelrite作為凝固劑在棉花愈傷組織誘導(dǎo)上的效果優(yōu)于瓊脂。Manokari等[26]的試驗(yàn)結(jié)果表明Phytagel有助于提高香澤蘭[Chromolaena odorata （L.） King & H. Rob.]的芽的再生數(shù)量和生根數(shù)量?！囊?號(hào)在PhytagelTM- P8169中愈傷率和褐化率最高，‘文椰4號(hào)在Agar-A8190中愈傷率和褐化率顯著高于其他兩種凝固劑。從成本控制和培養(yǎng)效果考慮，Gelrite- G1910的價(jià)格高，效果較差，選用PhytagelTM- P8169和Agar-A8190為凝固劑更為適宜。

為誘導(dǎo)椰子胚芽產(chǎn)生愈傷組織，培養(yǎng)基中均添加高濃度的2，4-D，同時(shí)為抑制外植體褐化，通常添加活性炭以吸附外植體在誘導(dǎo)過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)[2]。同時(shí)，活性炭對(duì)于培養(yǎng)基內(nèi)的激素具有強(qiáng)烈的吸附作用，實(shí)際可被外植體所利用的激素濃度并不確定。Sáenz等[13]通過(guò)對(duì)未接種外植體的培養(yǎng)基檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，使用細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的活性炭，培養(yǎng)基內(nèi)的2，4-D濃度可在1?d后下降至原濃度的1.5%以下，而pH值在8?d內(nèi)有先上升至6.2后下降至6.12的趨勢(shì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不添加活性碳，低濃度的2，4-D并不能提升愈傷組織的誘導(dǎo)效率，反而會(huì)導(dǎo)致外植體褐化程度加重。對(duì)比愈傷率和褐化率后發(fā)現(xiàn)，對(duì)于‘文椰2號(hào)，2，4-D適宜濃度為110?μmol/L?！囊?號(hào)在110?μmol/L和600?μmol/L的誘導(dǎo)結(jié)果無(wú)顯著差異?？紤]外植體褐化率、后期愈傷組織變異率和成本控制等因素，以上述2種材料的胚芽為外植體時(shí)，宜選用的2，4-D濃度為110?μmol/L。

3.3 ?不同接種方式對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響

椰子愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中，未成熟胚、成熟胚、胚不同部位的切片及成熟胚中的胚芽均被用作為誘導(dǎo)材料[27-28]。后期經(jīng)驗(yàn)證由胚中心部位取得的切片最適用于組織培養(yǎng)，當(dāng)以遠(yuǎn)離胚中軸的組織為材料時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率會(huì)急劇下降[29]。目前，胚切片接種技術(shù)已不再使用，取而代之的是直接將胚芽從胚中分離[30]。在其他作物如水稻[31]、小麥[32]和杉木[33]中，以胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，最佳的處理方法是不將胚從胚乳中分離，對(duì)胚造成傷口后直接接種誘導(dǎo)。林擁軍等[34]指出胚或種子自身具有相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)源激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對(duì)外界激素具有一定的緩沖調(diào)節(jié)能力，可使胚正常生長(zhǎng)發(fā)育形成植株。而愈傷組織的形成就是要打破植物自身的激素平衡促使組織脫分化。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，接種方式對(duì)同一椰子品種的成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的差異可能與胚芽及胚的完整性有關(guān)，對(duì)于不同品種的差異可能與胚的大小或胚的成熟程度有關(guān)。在相同接種方式的處理下，‘文椰2號(hào)11月齡成熟胚萌發(fā)率高于‘文椰4號(hào)，表明‘文椰2號(hào)的胚內(nèi)源激素平衡能力可能高于‘文椰4號(hào)，且在取樣過(guò)程中發(fā)現(xiàn)11月齡的‘文椰2號(hào)胚和胚芽的體積均大于‘文椰4號(hào)。因此猜測(cè)胚的內(nèi)源激素平衡能力與胚的成熟度也有一定的關(guān)系，需要后期進(jìn)一步驗(yàn)證。本試驗(yàn)表明‘文椰2號(hào)宜選擇胚芽剝?nèi)〗臃N方式，‘文椰4號(hào)宜選擇縱切接種的方式。完整胚接種，未造成傷口，因此產(chǎn)生的酚類(lèi)物質(zhì)較少，褐化率較低，但同時(shí)內(nèi)部胚芽難以接觸到培養(yǎng)基內(nèi)激素，愈傷率也較低?？v切接種的傷口表面積大，褐化率顯著高于其他接種方式，但是縱切接種可將部分胚芽暴露出來(lái)，接收外界激素刺激，同時(shí)對(duì)胚芽造成傷害較小，因此可提升誘導(dǎo)效率。剝?nèi)∨哐拷臃N，可使誘導(dǎo)組織對(duì)外界的接觸面積達(dá)到最大，且減少了胚殘留組織褐化對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，但同時(shí)胚芽體積較小，剝?nèi)∵^(guò)程較為繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。具體采用哪種接種方式需要根據(jù)胚的大小、胚芽的大小及成熟度來(lái)決定。

4 ?結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)‘文椰2號(hào)和‘文椰4號(hào)2個(gè)海南本地優(yōu)良栽培品種進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，明確品種間和品種的個(gè)體間，即不同基因型的愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異。適用于‘文椰2號(hào)的愈傷組織誘導(dǎo)的接種方式為胚芽剝?nèi)〗臃N，適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：Y3+30?g/L蔗糖+110?μmol/L 2，4-D+ 4?g/L?PhytagelTM-P8169+2.5?g/L活性炭。適用于‘文椰4號(hào)的愈傷組織誘導(dǎo)的接種方式為縱切接種，適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：Y3+30?g/L蔗糖+110?μmol/L 2，4-D+6?g/L Agar-A8190+2.5?g/L活性炭。

參考文獻(xiàn)

周煥起， 黃麗云， 許小妹， 等. 椰子愈傷組織誘導(dǎo)與防褐變技術(shù)研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2010， 22（3）： 62-63， 66.

Nguyen Q T， Bandupriya H D D， López-Villalobos A， et al. Tissue culture and associated biotechnological interventions for the improvement of coconut （Cocos nucifera L.）： a review[J]. Planta， 2015， 242（5）： 1059-1076.

Rajesh M K， Radha E， Sajini K K， et al. Polyamine-induced somatic embryogenesis and plantlet regeneration in vitro from plumular explants of dwarf cultivars of coconut （Cocos nucifera）[J]. Indian Journal of Agricultural ences， 2014， 84（4）： 527.

Litz R E. Biotechnology of fruit and nut crops[M]. Boston： MA CABI， 2020.

Cutter V M J， Wilson K S. Effect of coconut endosperm and other growth stimulants upon the development in vitro of embryos of Cocos nucifera[J]. Botanical Gazette， 1954， 115（3）： 234-240.

Nguyen Q T， Bandupriya H D D， López-Villalobos A， et al. Tissue culture and associated biotechnological interventions for the improvement of coconut （Cocos nucifera L.）： a review[J]. Planta， 2015， 242（5）： 1-18.

Eeuwens C J. Mineral requirements for growth and callus initiation of tissue explants excised from mature coconut palms （Cocos nucifera） and cultured in vitro[J]. Physiologia Plantarum， 1976， 36（1）： 23-28.

Thanh-Tuyen N T， De Guzman E V. Formation of pollen embryos in cultured anthers of coconut （Cocos nucifera L.）[J]. Plant Sci Lett， 1983， 29（1）： 81-88.

Hornung R. Micropropagation of Cocos nucifera L. from plumular tissue excised from mature zygotic embryos [J]. Plantations， Recherche， Developpement （France）， 1995， 201： 38-41.

Chan J L， Saenz L， Talavera C， et al. Regeneration of coconut （Cocos nucifera L.） from plumule explants through somatic embryogenesis[J]. Plant Cell Reports， 1998， 17（6-7）： 515-521.

Perera P I P， Hocher V， Verdeil J L， et al. Unfertilized ovary： a novel explant for coconut （Cocos nucifera L.） somatic embryogenesis[J]. Plant Cell Reports， 2007， 26（1）： 21-28.

Pérez-Núez M T， Chan J L， Sáenz L， et al. Improved somatic embryogenesis from Cocos nucifera （L.） plumule explants[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Plant， 2006， 42（1）： 37-43.

Sáenz L， Herrera-Herrera G， Uicab-Ballote F， et al. Influence of form of activated charcoal on embryogenic callus formation in coconut （Cocos nucifera）[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 2010， 100（3）： 301-308.

Rajesh M， Raha E， Sajini K， et al. Polyamine-induced somatic embryogenesis and plantlet regeneration in vitro from plumular explants of dwarf cultivars of coconut （Cocos nucifera）[J]. Indian Journal of Agricultural ences， 2014， 84（4）： 527.

Magnaval C， Noirot M， Verdeil J L， et al. Free amino acid composition of coconut （Cocos nucifera L.） calli under somatic embryogenesis induction conditions[J]. Journal of Plant Physiology， 1995， 146（1-2）： 155-161.

Adkins S W， Samosir Y M， Ernawati A， et al. Control of ethylene and use of polyamines can optimise the conditions for somatic embryogenesis in coconut （Cocos nucifera L.） and papaya （Carica papaya L.）[J]. Acta Horticulturae， 1998（461）： 459-466.

Perera P I P， Vidhanaarachchi V R M， Gunathilake T R， et al. Effect of plant growth regulators on ovary culture of coconut （Cocos nucifera L.）[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 2009， 99（1）： 73-81.

Corredoira E， Merkle S A， Martínez M T， et al. Non-zygotic embryogenesis in Hardwood species[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 2019， 38（1）： 29-97.

張東武， 劉 ?輝， 趙惠賢. 小麥成熟胚組織培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化及高再生率基因型的篩選[J]. 麥類(lèi)作物學(xué)報(bào)， 2011， 31（5）： 847-852.

劉 ?雙， 關(guān)淑艷， 孫 ?蘇， 等. 玉米愈傷組織培養(yǎng)體系優(yōu)化及ICE1基因的遺傳轉(zhuǎn)化[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 39（5）： 518-523.

顧曉川， 徐正偉， 成 ?鏡， 等. 植物凝膠和蔗糖對(duì)橡膠樹(shù)體胚植株再生的影響[J]. 廣西植物， 2018， 38（9）： 1164- 1171.

Li X Y， Huang F H， Gbur E E. Effect of basal medium， growth regulars and phytagel concentration on initiation of embryogenic cultures from immature zygotic embryos of loblolly pine （Pinus taeda L.）[J]. Plant Cell Rep， 1998， 17（4）： 298-301.

張 ?巧， 汪靜兒， 林 ?君， 等. 不同凝固劑對(duì)陸地棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的影響[J]. 棉花學(xué)報(bào)， 2010， 22（1）： 3-9.

Sansberro P A， Rey H Y， Luna C V， et al. Influence of gelling agents on Ilex paraguariensis tissue culture[J]. Acta Horticulturae， 2001（560）： 453-456.

Zimmereman T W， Robacker C W. Media and gelling agent effect on cotton callus in initiation from excised seedhypoeo tyles[J]. Plant Cell Tissue Organ Cul， 1988， 15： 269-274.

Manokari M， Kannan N， Priyadarshini S， et al. Effects of growth regulators and gelling agents on in vitro regeneration of Chromolaena odorata （L.） King & H. Rob.[J]. Social ence Electronic Publishing， 2020： 10.2139/ssrn. 3554240.

Adkins S W， Samosir Y， Godwin I D. Control of environmental conditions and the use of polyamines can optimise the conditions for the initiation and proliferation of coconut somatic embryos[J]. Current Advances in Coconut Biotechnology. Springer. 1999， 35： 321-340.

Samosir Y， Godwin I， Adkins S. The use of osmotically active agents and abscisic acid can optimise the maturation of coconut somatic embryos[J]. Current Advances in Coconut Biotechnology. Springer. 1999， 35： 341-354.

Sáenz-Carbonell L， Montero-Cortés M， Pérez-Nu?ez T， et al. Somatic Embryogenesis in Cocos nucifera L. [M]//Víctor M Loyola-Vargas， Neftalí Ochoa-Alejo Somatic Embryogenesis： Fundamental Aspects and Applications. New York： Springer. 2016.

Fernando S， Verdeil J L， Hocher V， et al. Histological analysis of plant regeneration from plumule explants of Cocos nucifera[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2003， 72（3）： 281-283.

沈 ?娟， 徐利娟， 張啟軍， 等. 不同接種方式對(duì)水稻成熟胚組織培養(yǎng)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 40（8）： 67-69.

左靜靜， 劉少翔， 閆貴云， 等. 小麥幼胚組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2010， 26（19）： 81-87.

陳 ?琴， 陳代喜， 勞廣杰， 等. 杉木未成熟胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)影響因素探析[J]. 廣西植物， 2017， 37（5）： 587-591.

林擁軍， 鄒玉蘭， 萬(wàn) ?驊， 等. 水稻成熟胚組培過(guò)程中胚乳影響的研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 1996， 18（3）： 259- 263.

責(zé)任編輯：白 ?凈