斑馬魚模型在中藥心血管藥理學(xué)研究中的應(yīng)用

秦小妹 郭帥杰 李悅 周明學(xué)

摘要 斑馬魚是現(xiàn)代生命科學(xué)研究中的重要實驗動物模型之一，具有繁殖能力強，可視性好、實驗周期短、成本低和可體外受精等特點。中藥成分復(fù)雜，治療心血管病藥理學(xué)機制和靶點多樣。近幾年，斑馬魚作為一種新穎的實驗動物模型，在中醫(yī)心血管病藥理學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用日益增多?，F(xiàn)從心肌損傷、高脂血癥、促血管新生、心力衰竭等幾個方面綜述斑馬魚模型在中藥心血管藥理學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并認為斑馬魚模型在中藥心血管藥理學(xué)研究中具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 斑馬魚;動物模型;心血管病;藥理學(xué);中藥

Application of Zebrafish Model in Cardiovascular Pharmacology

QIN Xiaomei， GUO Shuaijie， LI Yue， ZHOU Mingxue

（Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University，

Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100010， China）

Abstract Zebrafish is one of the important experimental animal models in modern life science research. It has the characteristics of strong reproduction ability， good visibility， short experiment period， low cost and in vitro fertilization. Chinese medicinal has complex components， and there are various pharmacological mechanisms and targets for treating cardiovascular diseases. In recent years， zebrafish， as a novel experimental animal model， has been increasingly applied in the field of pharmacology of cardiovascular diseases in traditional Chinese medicine. In this paper， the application status of zebrafish model in cardiovascular pharmacology of Chinese medicinal was reviewed from myocardial injury， hyperlipidemia， angiogenesis promotion， heart failure and other aspects， and it was believed that zebrafish model had a good application prospect in cardiovascular pharmacology of Chinese medicinal.

Keywords Zebrafish; Animal models; Cardiovascular diseases; Pharmacology; Chinese medicinal

中圖分類號：R285文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.025

斑馬魚是現(xiàn)代生命科學(xué)研究中最重要的實驗動物模型之一，既往一直被應(yīng)用于發(fā)育、基因工程和病理生理學(xué)等研究領(lǐng)域[1]，近幾年，越來越多的實驗將其作為活體高通量篩選模型，并逐漸拓展至新藥研發(fā)和藥理學(xué)研究等領(lǐng)域。中藥成分復(fù)雜，治療心血管病藥理機制和靶點多樣。斑馬魚模型因?qū)π》肿拥牧己脻B透性，可視性強等優(yōu)勢，在中藥治療心血管藥理學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用日益增多。本文介紹了斑馬魚模型的基本特點和優(yōu)勢，并從心肌損傷、高脂血癥、促血管新生、心力衰竭和心律失常等方面探討斑馬魚模型在中藥心血管藥理學(xué)中的應(yīng)用進展，以期為相關(guān)科研人員提供借鑒和參考。

1 斑馬魚模型的基本特點和優(yōu)勢

斑馬魚具有解剖和生理優(yōu)勢，與鼠類實驗動物不同，斑馬魚體型小，喂養(yǎng)成本低，繁殖周期短，產(chǎn)卵數(shù)量多，有獨特修復(fù)能力，具有高效、快速、規(guī)模大，試驗周期短等優(yōu)勢。哺乳動物成本高且實驗周期長，不適于大規(guī)模實驗和活體觀察，斑馬魚在實驗室環(huán)境中可以節(jié)省珍貴試劑進行藥物篩選，并且倫理學(xué)限制更少。此外，斑馬魚的基因組與人類有87%的相似度，易進行轉(zhuǎn)基因和基因敲除，適合藥物基因靶標(biāo)研究，并且對小分子有良好通透性[2]。基于上述優(yōu)勢，斑馬魚可作為很好的驗藥動物，用于高通量藥效篩選和毒理學(xué)研究，并逐漸拓展到藥理學(xué)研究領(lǐng)域。

2 斑馬魚在心血管疾病中藥藥理學(xué)中的應(yīng)用

斑馬魚的心率和心電圖參數(shù)、心臟形態(tài)、心房、心室、心臟瓣膜結(jié)構(gòu)以及心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)與人類極其相似。此外，斑馬魚的心臟可再生，胚胎幾乎是透明的，血管具有可視化特點。它的組織和結(jié)構(gòu)與脊椎動物相似，但心臟比哺乳動物小、簡單，并且血脂組成、代謝和人類基本一致。此外，斑馬魚的胚胎及幼體透明，方便活體觀察，可觀察到心跳、血管形成和血管病變?；谝陨仙硖攸c和優(yōu)勢，斑馬魚模型在心血管疾病中藥藥理學(xué)中的應(yīng)用日益廣泛。

2.1 心肌損傷

斑馬魚心臟損傷在形成血凝塊后損傷區(qū)可被正常心肌組織取代，并且不留瘢痕。藥物如馬兜鈴酸、阿奇霉素、異丙腎上腺素和特非那定等均可誘導(dǎo)斑馬魚形成心肌損傷。

崔國禎等[3]采用0.3 mm和1 mm濃度的阿奇霉素作用于受精后2 d的斑馬魚胚胎，3 d后，斑馬魚的胎心腫大，心搏量變小，心膜出血和心率減慢。阿霉素可導(dǎo)致斑馬魚胚胎心膜出血、循環(huán)受阻、血細胞堆積、心囊水腫、心率變慢，中藥益母堿干預(yù)后，斑馬魚出血癥狀和心率得到明顯改善[4-5]。

瓜蔞能明顯提高特非那定誘導(dǎo)的心肌損傷斑馬魚的心率，對心臟具有保護作用[6]。采用100 μmol/L丹參酮ⅡA和磺酸鈉共同給藥能抑制舒尼替尼導(dǎo)致的斑馬魚心率降低和心包水腫，從而發(fā)揮心臟保護作用[7]。李智平等[8]研究發(fā)現(xiàn)處理斑馬魚后，原花青素可明顯改善特非那定誘導(dǎo)的斑馬魚心臟出現(xiàn)形態(tài)、心率和功能等異常改變。薛迪[9]用4 μmol/L阿司咪唑誘導(dǎo)斑馬魚胚胎心肌損傷模型，再以不同濃度的白藜蘆醇和丹紅注射液分別處理，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和丹紅注射液對阿司咪唑產(chǎn)生的心臟損傷有修復(fù)作用。

2.2 高脂血癥和動脈粥樣硬化

斑馬魚血脂組成、代謝和人類基本一致，被認為是研究藥物降脂作用的理想模式動物[10]。Gut等[11]研究表明，長期喂養(yǎng)高膽固醇飲食的斑馬魚可形成與人類動脈粥樣硬化（AS）類似的病變，出現(xiàn)高膽固醇血癥、脂蛋白氧化、動脈中脂肪條紋形成和血管脂質(zhì)蓄積以及內(nèi)皮細胞層紊亂和增厚，這種模型適用于研究早期動脈粥樣硬化一些炎癥過程的時間特征和血管細胞的體內(nèi)功能。

韓冰[12]建立斑馬魚高脂血癥模型，并進行了藥物篩選，證實了小檗胺的降血脂作用。王成等[13]給5dpf轉(zhuǎn)基因斑馬魚高脂飲食喂養(yǎng)10 d，斑馬魚TC、TG、LDL-C以及血管中膽固醇含量均顯著上升，體質(zhì)量、體長均顯著增加，存活率、HDL-C水平均顯著降低。加入不同濃度的大黃素，明顯提高斑馬魚存活率，改善脂代謝紊亂。陳彪[14]以HepG2細胞和斑馬魚為細胞和動物模型，證實了黃連堿能通過調(diào)節(jié)多個參與膽固醇代謝基因從而調(diào)節(jié)血脂。此外，有研究表明姜黃和月桂水提取物主要成分1，8-桉葉素具有強抗氧化作用，可吞噬LDL-C、預(yù)防載脂蛋白糖基化、抑制膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白，進而減少斑馬魚肝中的脂質(zhì)沉積，減輕體質(zhì)量，降低TG和TC，發(fā)揮抗AS作用[15]。Jin和Cho[16]認為，肉桂和丁香的親水成分通過抗氧化、吞噬LDL-C、抑制膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白而減少斑馬魚AS的發(fā)生。Kim等[17]研究表明，枇杷葉能降低斑馬魚TC和TG，有抗AS作用。Dalli等[18]發(fā)現(xiàn)，山楂能減少糖尿病伴有冠心病患者中性粒細胞彈性蛋白酶，降低LDL-C。Littleton等[19]利用斑馬魚幼魚，發(fā)現(xiàn)山楂葉和山楂花可以抑制腸道膽固醇的吸收，降低膽固醇水平和提高心排血量。冉蓋等[20]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在未影響體長、體質(zhì)量和血脂的情況下，能顯著改善過度喂飼誘導(dǎo)的斑馬魚脂肪浸潤和肝臟脂滴形成，調(diào)節(jié)脂代謝，這可能與pAMPKa/Sirt1/自噬通路有關(guān)。陳侃等[21]發(fā)現(xiàn)大黃酚可加快斑馬魚吸收的高脂食物從腸道排出，減少腸道對脂質(zhì)的吸收，從而降低TG和TC。

2.3 心肌缺血側(cè)支循環(huán)建立，促血管新生

血管新生是指從已有的血管網(wǎng)絡(luò)、內(nèi)皮細胞中通過神經(jīng)發(fā)芽來形成新的血管，包括血管出芽、內(nèi)皮細胞遷移、增殖和管腔形成等，由冠心病心肌缺血側(cè)支循環(huán)代償建立不足引起，在冠心病等缺血性疾病中起重要作用[22]。心肌缺血區(qū)的新生血管相當(dāng)于“自我搭橋”，可建立有效的側(cè)支循環(huán)，因此促血管新生可能成為缺血性心臟病的一種治療策略[23]。He等[24]將斑馬魚胚胎在28.5 ℃條件下暴露于1.5 μg/mL舒尼替尼24 h，導(dǎo)致其血管損傷，而用舒尼替尼和益母草生物堿共同處理斑馬魚胚胎，血管損傷顯著降低，發(fā)現(xiàn)益母草生物堿是有效的血管生成劑。杜孟姣等[25]采用酪氨酸激酶抑制劑PTK787（0.06 μg/mL）誘導(dǎo)斑馬魚血管損傷模型，知母皂苷BⅡ通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子受體和炎癥介質(zhì)，促血管新生和修復(fù)受損血管。吳峰等[26]研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸鹽通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），促進斑馬魚胚胎血管新生。楊龍飛等[27]采用HPLC法建立了丹參水溶性成分指紋圖譜，用斑馬魚建立了不同的藥效學(xué)模型，闡明丹參水溶性成分促血管生成及心臟保護的作用。段文娟等[28]發(fā)現(xiàn)瓜蔞不同部位能促進斑馬魚的血管生成并具有心臟保護作用。應(yīng)軍等[29]用1 mmol/L濃度落新婦苷恢復(fù)了血管生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（VRI）所誘導(dǎo)的血管損傷模型中新生血管的生長。Hong等[30]研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷提取物通過上調(diào)VEGF-KDR/Flk-1和PI3K-AKT-eNOS信號通路促進血管生成。Chen等[31]采用VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ（VRI）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因斑馬魚血管損傷，而茜草恢復(fù)了其血管損傷，具有促血管生成活性。研究發(fā)現(xiàn)雞血藤提取物[32]通過上調(diào)VEGF通路，黃芪甲苷[33]通過上調(diào)VEGF和AKT通路，肉桂醛[34]通過上調(diào)PI3K和MAPK信號通路促進斑馬魚胚胎體內(nèi)血管生成，可加速傷口愈合;地黃根水提物[35]，黃芪根水提物[36]以及牛膝和川牛膝整體提取物[37]，均具有顯著的血管生成作用。

蘇梅等[38]研究發(fā)現(xiàn)，腦脈利顆粒在250和500 μg/mL濃度時有顯著的促進血管新生作用，可能與上調(diào)VEGFR1的表達有關(guān)。Zhou等[39]發(fā)現(xiàn)舒心飲方減弱了VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ（VRI）誘導(dǎo)的節(jié)間血管缺陷的濃度依賴性，具有促血管生成作用，作用機制涉及VEGF/PI3K/AKT/MAPK信號通路、細胞連接、凋亡和自噬等。研究發(fā)現(xiàn)麝香保心丸[40]、丹紅注射液[41]能促進斑馬魚的血管新生。

2.4 心力衰竭

心力衰竭是導(dǎo)致心血管疾病死亡的主要原因之一，是許多心血管病的終末階段。異丙腎上腺素（ISO）、馬兜鈴酸（AA）、阿霉素（DOX）等藥物可誘發(fā)斑馬魚心力衰竭模型[42]。ISO使斑馬魚心室變大、射血分數(shù)降低、心率下降、心包水腫率增加，從而建立慢性心力衰竭模型[43]。Huang等[44]發(fā)現(xiàn)AA可導(dǎo)致斑馬魚胚胎的心臟收縮功能障礙。Zhu等[45]發(fā)現(xiàn)48 hpf到72 hpf的斑馬魚胚胎暴露于各種濃度的仲丁威（2-仲丁基苯基甲基氨基甲酸酯，BPMC）會出現(xiàn)嚴重的心力衰竭，伴有心臟收縮，心動過緩，心排血量和血流動力學(xué)下降，心肌細胞凋亡。

Zhu等[46]將2 dpf的斑馬魚用維拉帕米以200 μmol/L的濃度處理30 min，建立斑馬魚心力衰竭模型，通過直接浸泡或循環(huán)顯微注射將被測藥物注入斑馬魚體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)芪藶強心膠囊和參麥注射液可顯著降低心臟擴張和靜脈充血，增加了心排血量和血流動力學(xué)，增強心臟功能并改善心力衰竭癥狀，這可能與其增加冠狀動脈血流量，減少心肌耗氧量，改善心肌能量代謝和凝血功能有關(guān)。此外，另有研究表明神香蘇合丸能抑制心力衰竭斑馬魚的心臟擴大，增加其心排血量，改善靜脈淤血和加快血流速度[47]。

2.5 心律失常

心律失常是心臟搏動速率（心率）的異常和節(jié)律（心律）的異常。利用斑馬魚模型可幫助了解遺傳心律失常與鈣、鈉和鉀選擇性離子通道突變的關(guān)系[48]。Burns等[49]采用不同濃度的實驗藥物干預(yù)心肌細胞熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，通過系統(tǒng)自動檢測來評價抗心律失常藥物對斑馬魚心率和心律的影響。Collins等[50]發(fā)現(xiàn)斑馬魚pitx2c的缺失導(dǎo)致心律失常、心房傳導(dǎo)功能受損，而抗氧化劑能降低心律失常的發(fā)生率和嚴重程度。崔國禎等[51]將2天的心臟表達綠色熒光的斑馬魚幼魚用不同濃度烏頭堿處理后表現(xiàn)出心律失常的特征，為抗心律失常藥物研發(fā)提供了一個新的體內(nèi)外藥物篩選模型。

3 結(jié)論與展望

在中藥心血管藥理研究中，斑馬魚因其再生能力強、可視性高，給藥方便、實驗周期短等獨特優(yōu)勢，成為研究心血管病新穎有效的優(yōu)勢模型生物。斑馬魚可進行活體研究，通過活體觀察，評估藥物干預(yù)療效，基于靶標(biāo)進行藥物篩選，可運用在心肌損傷、心肌梗死、高脂血癥、促血管新生、心力衰竭等中藥心血管藥理學(xué)研究中，進而篩選出有效的心血管病治療藥物，其作為重要實驗動物模型，有著廣闊的應(yīng)用前景[52]。但斑馬魚的藥理學(xué)研究仍有一定局限性：1）斑馬魚心血管藥理模型造模時間較短，藥物作用時間也較短，無法觀察藥物時效和療程作用;2）斑馬魚通過浸泡和顯微注射給藥，與人類給藥方式不同，可能影響藥物療效結(jié)果的臨床應(yīng)用;3）觀察分析技術(shù)多難以精確量化，評價結(jié)果容易摻雜主觀因素;4）斑馬魚相關(guān)試劑、抗體以及檢測指標(biāo)較少，難以在蛋白水平上分析其相關(guān)機制。5）斑馬魚生長迅速，不利于復(fù)制心血管慢性疾病模型。盡管有上述限制，但是在中藥藥理學(xué)研究方面，斑馬魚模型易于短時間大規(guī)模繁殖，費用相對低廉，用藥較少;而中藥單體比較昂貴，傳統(tǒng)動物實驗花費高，耗時久，所以斑馬魚非常適用于中藥單體的篩選，有利于研究其藥效、作用機制以及不良反應(yīng)。斑馬魚模型體現(xiàn)的潛力，隨著未來自動化觀察分析、基因敲除等技術(shù)的發(fā)展，將會作為重要的高效模型，更為廣泛地應(yīng)用在心血管疾病的藥理研究中。

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（2020-11-13收稿 責(zé)任編輯：吳珊，徐穎）

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81673744）

作者簡介：秦小妹（1993.11—），女，碩士研究生在讀，研究方向：心血管病的中西醫(yī)結(jié)合研究，E-mail：18535874040@163.com

通信作者：周明學(xué)（1978.11—），男，博士研究生，研究員，研究方向：心血管病的中西醫(yī)結(jié)合研究，E-mail：mingxue78@163.com