曾維星， 程 賢， 畢良武*， 李勝男， 陳玉湘， 趙振東

(1.中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學工程重點實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.南京林業(yè)大學 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)屬于樟科植物，一般指桂皮，也分為桂皮、桂枝、桂葉，中國的主要產(chǎn)地有廣東、廣西、云南等省區(qū)。桂皮一般作為傳統(tǒng)的辛香料，用作食物烹飪的調(diào)味品，而肉桂枝葉則用于提取肉桂油。利用新鮮肉桂枝葉直接提取肉桂油，通常提取得率較低。在實際生產(chǎn)過程中，肉桂油加工企業(yè)通常將肉桂枝葉貯存一段時間進行自然陳化，通過加強肉桂枝葉代謝物的積累從而促進肉桂油提取得率的提高。此外，隨著多學科的相互滲透和交叉，生物技術(shù)研究與天然產(chǎn)物研究的結(jié)合日益密切，微生物發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)開始作為生物預處理手段，應用于天然產(chǎn)物的提取分離[1-4]。李軍集等[5]以經(jīng)水蒸氣蒸餾提取肉桂油后所得肉桂葉渣為原料進行生物發(fā)酵，研究顯示發(fā)酵后肉桂葉渣的化學成分發(fā)生了明顯變化，產(chǎn)生了其他具有揮發(fā)性芳香氣味的化學成分。張笮晦等[6]利用微生物菌株XJ26的發(fā)酵液處理肉桂葉成功提取了肉桂醛等肉桂葉精油成分，并且在最優(yōu)工藝條件下，肉桂醛、香豆素和鄰甲氧基肉桂醛的提取得率分別為1.40%、 0.73%和0.92%，其中香豆素和鄰甲氧基肉桂醛的得率均高于已報道的數(shù)據(jù)。此外，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)肉桂枝葉經(jīng)酵母菌等預處理后，可以增加肉桂油的提取得率[7]。因此，明確不同預處理條件下肉桂枝葉主要化學成分的變化規(guī)律對于探索其預處理作用機理具有重要意義。本研究分別使用加水、加酵母液、45天陳化的方式對新鮮肉桂枝葉進行預處理，先采用氣質(zhì)聯(lián)用鑒定肉桂油揮發(fā)性化學成分，再借助UHPLC-QTOFMS技術(shù)對空白對照組和預處理后的肉桂枝葉主要化學成分(包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分)進行全面表征，最后對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行聚類和熱圖分析，探索肉桂枝葉主要化學成分經(jīng)不同方式預處理后的變化及其內(nèi)在轉(zhuǎn)化規(guī)律，以期為肉桂枝葉的生物預處理研究提供重要參考。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

新鮮肉桂枝葉，采摘自廣西梧州市藤縣金雞鎮(zhèn)；蒸餾水，實驗室純水儀制備；酵母粉，湖北安琪酵母股份有限公司；甲醇，市售分析純。

10 mL揮發(fā)油測定器，四川蜀玻公司。KH5200B型超聲波儀器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀，美國安捷倫公司；Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，美國Waters公司；Shimadzu LC-30A Series UHPLC系統(tǒng)，配備SIL-20AC自動進樣器，LC-20AD 二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A二極管陣列檢測器，日本島津公司；AB SCIEX QTOFTM 5600+質(zhì)譜儀system，美國SCIEX公司；移液槍、5424高速離心機，德國Eppendorf公司。

1.2 生物預處理

取大小均勻的肉桂枝葉均分為4組，處理方式如下：1) 按肉桂枝葉與水質(zhì)量比5 ∶1將水均勻噴灑在枝葉表面，作為水預處理組(W)；2) 將0.1 g/mL的酵母水溶液按肉桂枝葉與酵母液質(zhì)量比5 ∶1均勻噴灑在枝葉表面，作為酵母液預處理組(Y)；3) 葉片不做任何預處理，作為空白組(C)。W、Y和C組枝葉分別置于玻璃培養(yǎng)皿中，并用透氣封口膜密封，靜置一周，葉片不做任何預處理，靜置45天，作為陳化存放組(A)。

1.3 肉桂油的提取及其成分鑒定

1.3.1肉桂油的提取 分別將空白組、水預處理組、酵母液預處理組和陳化存放組的肉桂枝葉用小型植物粉碎機粉碎成約1 cm×1 cm大小的碎葉片，使用水蒸氣蒸餾法提取6 h，冷卻后從油水分離器中收集肉桂油，稱質(zhì)量，計算肉桂油提取得率。

1.3.2肉桂油成分鑒定 吸取10 μL提取得到的肉桂油加入到40 μL甲醇中，稀釋至原體積的5倍進樣氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。GC-MS分析條件：色譜柱為石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為He，流量1.6 mL/min；進樣口溫度為170 ℃；進樣量為0.2 μL；分流比為100 ∶1；色譜柱升溫程序為 80 ℃保持2 min，以3 ℃/min的速率升至170 ℃保持10 min。質(zhì)譜條件：EI電離源，電離源溫度為230 ℃，電子轟擊能量為70 eV，掃描范圍(m/z)為50～500。

1.4 肉桂枝葉提取物制備及分析

1.4.1樣品制備 將不同方式處理的肉桂枝葉用小型粉碎機粉碎至粒徑約0.4 mm，稱取0.26 g左右粉碎的肉桂枝葉轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，平行加入8 mL甲醇后蓋緊離心管，使用功率250 W，頻率40 kHz 超聲波處理10 min后取出放置12 h；第二天再次超聲波處理10 min后取出，取上清液1 mL轉(zhuǎn)移至離心管，10 000 r/min離心5 min后取出，用移液槍吸取0.8 mL上清液至進樣瓶中，進行UHPLC-QTOFMS分析，每組樣品平行操作6次。同時將所有提取后的樣品等量混合后進行UHPLC-QTOFMS分析，用于化合物鑒定。

1.4.2色譜條件 Shimadzu LC-30A Series UHPLC系統(tǒng)，柱溫為35 ℃。流動相為0.1%甲酸/水(A)和乙腈(B)，流速為0.2 mL/min。流動相梯度：0～3 min，5% B；3～10 min，5%～60% B；40～45 min，60%～95% B；45～55 min，95% B；55～56 min，95%～5% B；56～60 min，5% B，進樣體積為2 μL。

1.4.3質(zhì)譜條件 AB SCIEX QTOFTM 5600+質(zhì)譜儀，ESI離子源，正負離子模式下進行檢測。霧化：N2，1.5 L/min；干燥器：N2，140 kPa；CID碰撞氣：氬氣，50 kPa；解簇電壓90 V；碰撞能45 V；離子源溫度350 ℃；毛細管溫度300 ℃；掃描范圍(m/z)50～1 000；所有樣品數(shù)據(jù)采集均采用全掃描模式，非靶向模式獲得MS/MS二級碎片。

1.5 數(shù)據(jù)處理

肉桂油提取得率(Y)計算公式如下：Y=(me/mt)×100%，其中Y為肉桂油提取得率，%；me為收集的肉桂油質(zhì)量，g；mt為用于提取的肉桂枝葉質(zhì)量(以干質(zhì)量計)，g。液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)借助美國AB公司Peak View軟件對化合物的分子式進行分析；數(shù)據(jù)分析及繪圖使用Originlab Corporation公司Origin2018軟件；化合物結(jié)構(gòu)式繪制采用ChemBioDrawUltra 14.0。GC-MS數(shù)據(jù)對比譜庫，鑒定肉桂油的成分，根據(jù)峰面積歸一化法計算得到各成分的相對峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物預處理對肉桂油提取得率及其成分的影響

以原料枝葉的干質(zhì)量計算不同預處理方式下的肉桂油提取得率。酵母液預處理組(Y)、水預處理組(W)、空白組(C)和陳化存放組(A)枝葉的肉桂油提取得率分別為0.76%、 0.68%、 0.63%、 0.95%?？梢钥闯?，空白組、水預處理組、酵母液預處理組和陳化存放組的提取得率比為1 ∶1.08 ∶1.21 ∶1.51。利用酵母液預處理原料枝葉后肉桂油提取得率相比空白組提高20.63%，雖然酵母液預處理組的肉桂油提取得率低于陳化存放組，但預處理時間僅為7天，遠小于陳化存放時間(45天)。陳化過程中伴隨著肉桂枝葉中部分化學成分向肉桂油成分的轉(zhuǎn)化，推測利用酵母進行預處理，加快了陳化的轉(zhuǎn)化過程。因此，利用酵母液作為預處理手段，能夠在較短時間內(nèi)促進肉桂油提取得率的提高。

借助氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀得到譜圖，結(jié)合NIST標準質(zhì)譜庫以及Pub Med數(shù)據(jù)庫，共鑒定出了10種化合物，利用峰面積歸一化法計算得到各個化合物的相對峰面積，結(jié)果見表1。

表1 不同預處理方式下的肉桂油成分

由表1可知，4組原料枝葉提取所得肉桂油中主要化學成分相同，反式肉桂醛為含量最高的成分。經(jīng)過生物預處理或自然陳化干預后，主成分反式肉桂醛含量有所下降，但考慮到4組肉桂油提取得率本身存在差異，空白組、水預處理組、酵母液預處理組和陳化存放組提取所得肉桂油中的反式肉桂醛的實際量的比為1 ∶1.01 ∶1.06 ∶1.25，因此，預處理后反式肉桂醛實際量均有所增加。此外，在生物預處理后鄰甲氧基肉桂醛、乙酸肉桂酯實際量也有所增加。

由此可見，以酵母液預處理和自然陳化后所得肉桂油的主要組成成分基本一致，并且生物預處理有助于肉桂油中反式肉桂醛等主成分的積累。

2.2 肉桂枝葉甲醇提取物成分的鑒定

為了進一步明確肉桂枝葉甲醇提取物成分(包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性成分)在預處理干預下的變化規(guī)律，本研究采用高分辨質(zhì)譜儀對肉桂枝葉甲醇提取物分別在正、負離子模式下進行檢測，混合樣品的質(zhì)譜離子流圖如圖1所示。綜合考慮化合物的保留時間、精確相對分子質(zhì)量、分子式、相對分子質(zhì)量偏差、特征離子碎片及文獻數(shù)據(jù)，鑒定出了34個化學成分，包含17個酸類化合物、5個醇類化合物、4個苷類化合物、 3個醛類化合物、3個黃酮類化合物和2個酯類化合物，鑒定結(jié)果見表2。

a.正離子模式 positive ion mode； b.負離子模式 negative ion mode

表2 肉桂枝葉甲醇提取物成分的定性分析

續(xù)表2

化合物1的保留時間為18.71 min，準分子離子峰為m/z163.07，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C10H10O2，其相對分子質(zhì)量偏差為-0.5，其中離子碎片m/z135.09分析推測為準分子離子失去1個CO(28 u)后產(chǎn)生的，離子碎片m/z107.05則是準分子離子相繼失去1個CO和1個C2H4(28 u)后產(chǎn)生的，推斷化合物1為鄰甲氧基肉桂醛，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(I)所示。結(jié)合文獻[8]，同理推斷醛類化合物2為反式肉桂醛[9]，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(II)所示，化合物3為松柏醛[10]。

化合物4的保留時間為12.63 min，準分子離子峰為m/z287.05，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C15H10O6，其相對分子質(zhì)量偏差為-0.9，其中離子碎片m/z165.02分析推測為準分子離子C環(huán)(C6H6O，94 u)斷開后，再失去一個CO(28 u)后產(chǎn)生的，離子碎片m/z153.02為AB環(huán)C—C的斷裂，即Retro Diels-Alder(RDA)反應，結(jié)合文獻[11]，推斷化合物4為山柰酚，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(III)所示。同理推斷其他黃酮類化合物5和6分別為槲皮素、蘆丁[12]。

化合物10的保留時間為7.39 min，準分子離子峰為m/z327.11，其加和形式為[M-H]-，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C15H20O8，其相對分子質(zhì)量偏差為-6.6，其中離子碎片m/z147.05推測為準分子離子失去1分子葡萄糖(C6H12O6，180 u)后產(chǎn)生，離子碎片m/z103.06推測為準分子離子相繼失去1分子葡萄糖和1分子CO2(44 u)后產(chǎn)生，因此推斷化合物10為木犀草苷[9]，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(IV)所示。同理推斷其他苷類化合物7、8和9分別為槲皮苷[13]、金絲桃苷[14]和槲皮素-3-O-木糖苷。

化合物11的保留時間為18.71 min，準分子離子峰為m/z135.08，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C9H10O，其相對分子質(zhì)量偏差為0.4，其中離子碎片m/z103.05分析推測為準分子離子相繼失去1個H2O(18 u)和1個CH2(14 u)后產(chǎn)生的，這與已知肉桂醇的離子碎片解離路徑一致[8]，因此推斷化合物11為肉桂醇，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(V)所示。同理推斷其他醇類化合物12和13分別是松脂醇[14]和丁香樹脂醇[15]，化合物14和15分別為豆甾醇和肉桂萜醇A[14]。

化合物16的保留時間為11.63 min，準分子離子峰為m/z147.04，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C9H6O2，其相對分子質(zhì)量偏差為0.9，其中離子碎片m/z101.04分析推測為準分子離子相繼失去1個CO(28 u)和1個H2O(18 u)后產(chǎn)生的，離子碎片m/z91.05分析推測為準分子離子失去2個CO(28 u)后產(chǎn)生的，這與香豆素酯鍵結(jié)構(gòu)處斷裂相吻合[16]，推斷化合物16為香豆素，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(VI)所示。同理推斷其他酯類化合物17為水楊酸乙酯[17]。

化合物23的保留時間為2.62 min，準分子離子峰為m/z355.09，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C16H18O9，其相對分子質(zhì)量偏差為-6.9，其中離子碎片m/z193.05推斷為準分子離子失去一個咖啡酸(180 u)所產(chǎn)生，m/z163. 09推斷為準分子離子失去一個奎寧酸(192 u)后繼續(xù)失去一個H2O所產(chǎn)生，上述2種碎片與綠原酸酯鍵斷裂所得碎片完全一致，結(jié)合文獻[17]，推斷化合物23為綠原酸，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(VII)所示。同理推斷化合物18為肉桂酸，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(VIII)所示。其他酸類化合物19～25分別為芥子酸、香草酸、異香草酸、咖啡酸、綠原酸、對香豆酸、鄰香豆酸[8,17-18]。27～29分別為丁香酸、對羥基苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸[18]。

化合物31的保留時間為53.41 min，準分子離子峰為m/z339.32，其加和形式為[M+H]+，根據(jù)元素構(gòu)成規(guī)則和軟件分析，推測出該化合物的分子式為C22H44O2，其相對分子質(zhì)量偏差為-9.6，其中離子碎片m/z183.25推斷為準分子離子失去一個C11H24(156 u)所產(chǎn)生，上述碎片與山崳酸碳鏈斷裂所得碎片完全一致，結(jié)合文獻[8]，推斷化合物31為山崳酸，該化合物質(zhì)譜裂解路徑如圖2路徑(IX)所示。同理推斷其他酸類化合物26為二十七烷酸，化合物30為油酸，化合物32～34分別為花生酸、軟脂酸、硬脂酸[18]。

另外，通過表2與表1相關(guān)成分比對后發(fā)現(xiàn)，肉桂油揮發(fā)性次要成分乙酸肉桂酯在肉桂枝葉甲醇提取物中未被檢測到，目前尚不清楚其原因。當然提取肉桂油的水蒸氣蒸餾法與分離提取物的甲醇提取法是有區(qū)別的，肉桂油和甲醇提取物檢測所用手段(GC-MS與UHPLC-QTOFMS)的檢測器也不盡相同。

圖2 肉桂枝葉化學成分的質(zhì)譜裂解路徑

2.3 生物預處理干預下肉桂枝葉成分的變化規(guī)律

首先利用熱圖聚類分析描述了4組樣本34種化學成分質(zhì)譜響應強度的接近程度，將34種化學成分分為3個級別，結(jié)果如圖3所示。第I級包括反式肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛、肉桂醇、肉桂酸、松柏醛等，大部分屬于醛類化合物，在肉桂枝葉中的含量較高且在離子源中容易離子化[19]。

C：空白組 control；W：水處理組water pretreatment；Y：酵母液處理組yeast pretreatment；A：自然陳化aging

第I級包括的化合物的質(zhì)譜響應強度見表3。由表3可以發(fā)現(xiàn)，肉桂枝葉經(jīng)酵母液預處理后，反式肉桂醛、鄰甲氧基肉桂醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、松柏醛的質(zhì)譜響應強度在Y組樣品中最高。已有報道表明酵母菌預處理能夠通過破壁作用促進天然產(chǎn)物的提取[20]，這可能是酵母液預處理促進肉桂油提取得率提高的重要誘因。

第II級化合物包括松脂醇等，共計17種化學成分，屬于肉桂枝葉的次要成分，大部分屬于非揮發(fā)性化合物。通過熱圖分析可以發(fā)現(xiàn)：肉桂枝葉的次要成分在酵母菌預處理后的變化趨勢與自然陳化干預下的變化趨勢一致，具體表現(xiàn)為肉桂枝葉的次要成分在Y組和A組樣品中的質(zhì)譜響應強度普遍低于C組。因此，初步推斷在生物預處理或自然陳化過程中肉桂枝葉次要成分可能發(fā)生了轉(zhuǎn)化，具體機制有待進一步驗證。

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)：1) 酵母液預處理促進了反式肉桂醛等揮發(fā)性成分在肉桂枝葉中的積累；2) 肉桂枝葉的非揮發(fā)性成分在生物預處理干預下的變化趨勢與自然陳化干預下的變化趨勢一致。因此，本研究所涉及的生物預處理方式對改善肉桂枝葉的陳化轉(zhuǎn)化有積極指導作用。

3 結(jié) 論

3.1采用加水、加酵母液和45天自然陳化3種方式預處理肉桂枝葉，考察預處理方式對肉桂油及肉桂枝葉甲醇提取物中主要成分的影響。結(jié)果表明：經(jīng)過酵母液預處理原料枝葉后，肉桂油提取得率相對于空白組提高20.63%，因此，生物預處理手段能夠在較短時間內(nèi)促進肉桂油提取得率的提高。同時，以生物預處理干預后所得肉桂油和自然陳化后所得肉桂油的主要成分組成基本一致。

3.2采用UHPLC-QTOFMS技術(shù)對4組肉桂枝葉甲醇提取物進行分析，通過參照比對等分析手段從肉桂枝葉甲醇提取物中共鑒定出了34個化合物，包含17個酸類化合物、5個醇類化合物、4個苷類化合物、3個醛類化合物、3個黃酮類化合物和2個酯類化合物。

3.3酵母液預處理干預下，肉桂枝葉提取物中揮發(fā)性成分的相對含量有所提高，非揮發(fā)性成分的相對含量有所下降，變化趨勢與自然陳化干預下的變化趨勢一致，因此生物預處理在肉桂油提取方面具有潛在應用價值。