外源鈣對(duì)低溫脅迫下西藏野生垂穗披堿草生理及相關(guān)基因表達(dá)的影響

其美拉姆，普布卓瑪，崔彤彤，張新飛，姜惠娜，付娟娟*，呼天明*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西藏自治區(qū)農(nóng)科院草業(yè)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850000)

Ca2+是植物體必需的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素之一，在植物生長(zhǎng)過(guò)程中起著必不可少的作用[7]。作為重要的信號(hào)物質(zhì)，Ca2+在逆境脅迫下，能通過(guò)激活保護(hù)酶系統(tǒng)、改善光合作用等機(jī)制緩解高低溫、干旱、高鹽和病蟲(chóng)害等脅迫對(duì)植物的傷害[8-12]。而且鈣可與細(xì)胞內(nèi)Ca2+受體——調(diào)蛋白結(jié)合，參與脅迫信號(hào)的感受、傳遞、響應(yīng)和表達(dá)。外源施鈣可增強(qiáng)質(zhì)膜的穩(wěn)定性和鈣平衡，能減輕環(huán)境脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜的傷害[13-14]。在低溫脅迫下，Ca2+不僅可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)無(wú)機(jī)離子的運(yùn)輸，對(duì)維持細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、膜結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性起著重要的作用[15-16]，而且Ca2+與受體結(jié)合可發(fā)生磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)將信號(hào)傳遞至下游脅迫響應(yīng)基因，調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)和產(chǎn)物的活化，增加植株抗寒性[17]。Shi等[18]研究發(fā)現(xiàn)外源CaCl2能夠調(diào)控植物的光合響應(yīng)、氧化還原平衡、三羧酸循環(huán)等多種代謝途徑，而且在脅迫相關(guān)基因誘導(dǎo)表達(dá)方面起著關(guān)鍵作用。但目前尚未見(jiàn)關(guān)于外源CaCl2調(diào)控西藏野生垂穗披堿草抗寒性的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試野生垂穗披堿草種子于2016年采集于西藏拉薩市當(dāng)雄縣(91°05′ E，30°51′ N，海拔4 618 m)。種子凈度為100%，種子發(fā)芽率可達(dá)到98%，種子的保存溫度為4℃。

1.2 試驗(yàn)方法

選取顆粒飽滿(mǎn)一致的野生垂穗披堿草種子，用1%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒5 min，用滅菌超純水清洗數(shù)次。將種子整齊擺放在鋪有雙層濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙(內(nèi)徑9.0 cm)的無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿中，將其放置在人工氣候培養(yǎng)箱(25℃)中催芽萌發(fā)，萌發(fā)過(guò)程濾紙始終保持濕潤(rùn)。待幼苗長(zhǎng)到2 cm左右時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健康植株轉(zhuǎn)移至鋪滿(mǎn)石英砂的培養(yǎng)缽中，每缽4株。將培養(yǎng)缽放置于恒溫恒濕植物培養(yǎng)箱(光強(qiáng)12 000 lux，光期16 h，23℃，濕度80%；暗期8 h，20℃，濕度60%)中培養(yǎng)，培養(yǎng)周期時(shí)為4周，期間每2 d換1次Hogland營(yíng)養(yǎng)液[20]。為了篩選外源CaCl2作用最佳濃度，分別設(shè)置5 mM，10 mM，15 mM，20 mM，25 mM CaCl2濃度，將植株做好標(biāo)簽后轉(zhuǎn)移至人工4℃冰箱，早晨和晚上對(duì)植株葉面均勻噴施對(duì)應(yīng)濃度的CaCl2，噴施7 d后進(jìn)行株高，根長(zhǎng)，鮮重，干重，相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定。經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定15 mM CaCl2為最佳處理濃度，試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理CK(常溫，Hogland)，CK+CaCl2(常溫，15 mM CaCl2)、低溫(4℃，Hogland)和低溫+CaCl2(4℃，15 mM CaCl2)，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。待幼苗培養(yǎng)至三葉期時(shí)，進(jìn)行CaCl2葉片噴施處理，每天定時(shí)噴施2次(以不滴下液體為準(zhǔn))，處理7 d之后采集樣品進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定。

脅迫相關(guān)基因和抗氧化酶基因的相對(duì)表達(dá)水平測(cè)定：分別采集4℃處理不同時(shí)間(0 h，0.5 h，2 h，6 h，12 h，24 h，72 h，120 h)的葉片樣品100 mg，立刻放入液氮，使用組織研磨機(jī)研磨樣品，采用RNA提取試劑盒(Takala，中國(guó)大連)提取樣品中的總RNA，使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，放于—80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 用直尺(精度為1 mm)測(cè)量株高和根長(zhǎng)并記錄；根、葉進(jìn)行分離，去除表面水分后稱(chēng)重后，記各部分鮮重，生物量用單株鮮重表示(g)。然后將樣品放入烘箱中110℃殺青10 min并60℃烘干48 h，稱(chēng)重后，記各部分干重。

1.3.3RT-qPCR測(cè)定低溫相關(guān)基因及抗氧化酶相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量 采用Light Cycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。以Tublin基因?yàn)閮?nèi)參，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，基因特異性引物見(jiàn)表1。反應(yīng)體系和程序按照hamQ SYBRqPCR MasterMix試劑盒(中國(guó)南京)操作方法進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品有3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法基因的相對(duì)表達(dá)量[28]。

表1 RT-qPCR引物列表

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007錄入，采用Origin 2020b作圖，采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA分析，采用Duncan’s法對(duì)平均值進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源CaCl2對(duì)低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖1A和1B可知，低溫脅迫抑制垂穗披堿草幼苗的生長(zhǎng)，葉片較稀疏；而噴施CaCl2能夠減輕低溫脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制，表現(xiàn)為葉片較為密集、葉片脫水現(xiàn)象較輕。低溫脅迫(4℃)與常溫(CK)相比，株高和根長(zhǎng)分別降低了15.07%和17.35%；低溫脅迫下噴施外源CaCl2對(duì)其株高和根長(zhǎng)影響較小，在CK條件下噴施CaCl2，與CK相比差異也不顯著(圖1C)。低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗地上及地下鮮重和地上及地下干重分別較CK下降了72.64%，64.7%和69.41%，76.73%(P<0.05)。低溫脅迫下噴施CaCl2能夠提高幼苗的生物量，其中地上及地下鮮重和地上及地下干重與低溫處理相比，分別增加了164.42%，106.08%和160.88%，92.88%(P<0.05；圖1D,E)。由此得出，外源CaCl2能在一定程度上緩解低溫對(duì)垂穗披堿草幼苗造成的傷害。

2.2 外源CaCl2對(duì)低溫脅迫下垂穗披堿草細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響

圖2 低溫(4℃)脅迫下CaCl2對(duì)垂穗披堿草幼苗相對(duì)電導(dǎo)率(A)，丙二醛(B)，超氧陰離子自由基(C)的影響

2.3 外源CaCl2對(duì)低溫脅迫下垂穗披堿草葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累的影響

低溫脅迫(4℃)導(dǎo)致葉片中可溶性糖和脯氨酸含量顯著上升，與CK相比分別增加了105.81%和85.53%(P<0.05；圖3)。低溫條件(4℃)下噴施CaCl2進(jìn)一步提高了葉片中可溶性糖和脯氨酸含量，與低溫(4℃)相比分別增加了61.03%和178.46%(P<0.05)。而在常溫條件下噴施CaCl2，葉片中可溶性糖和脯氨酸含量差異不顯著。

2.4 外源CaCl2對(duì)低溫脅迫下垂穗披堿草葉片中抗氧化酶活性的影響

低溫脅迫不同程度地改變垂穗披堿草葉片中抗氧化酶活性(圖4)。低溫脅迫(4℃)下，葉片中SOD，CAT，APX，GR活性比CK分別增加了109.41%，82.22%，53.41%和46.5%(P<0.05)，而POD活性變化不顯著。低溫脅迫(4℃)下噴施CaCl2進(jìn)一步提高葉片SOD，POD，CAT，APX活性，與4℃相比分別增加26.80%，62.66%，20.48%和32.44%(P<0.05)，但對(duì)GR活性影響較小。在CK條件下噴施CaCl2，葉片SOD活性比CK增加了67.78%，但其他酶活性與CK相比差異不顯著。

圖4 低溫(4℃)脅迫下CaCl2對(duì)垂穗披堿草幼苗SOD,POD,CAT,APX和GR的影響

2.5 外源CaCl2對(duì)低溫脅迫下垂穗披堿草葉片中抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖5可知，隨著低溫時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，CaCl2處理能夠改變抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)水平。除低溫脅迫24 h外，外源CaCl2顯著提高低溫脅迫下EnCu/ZnSOD，EnFeSOD和EnMnSOD基因的表達(dá)水平(圖5A-C)；與CAT活性變化不同的是，EnCAT2基因的表達(dá)響應(yīng)在低溫脅迫(24～120 h)下變化較小，而CaCl2處理顯著提高低溫脅迫120 h下EnCAT2基因的表達(dá)水平(圖5D)；EnPER1基因隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增后降的變化趨勢(shì)，外源CaCl2處理下EnPER1基因的表達(dá)趨勢(shì)與之相似，并在低溫脅迫24 h時(shí)顯著提高EnPER1基因表達(dá)量(圖5E)；隨著低溫脅迫進(jìn)程的推進(jìn)，外源CaCl2處理顯著提高EnAPX基因的表達(dá)(圖5F)；EnGPX基因的表達(dá)水平隨著低溫脅迫的進(jìn)程表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，低溫24 h時(shí)外源CaCl2能顯著提高EnGPX基因的表達(dá)量。EnGST4基因的表達(dá)水平隨著脅迫時(shí)間表現(xiàn)出遞減趨勢(shì)(圖5G)，在72～120 h外源CaCl2處理能夠顯著提高此基因的表達(dá)水平(圖5H)；EnMDAR基因的表達(dá)水平隨著低溫脅迫的推移呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化趨勢(shì)，外源CaCl2處理對(duì)EnMDAR基因的表達(dá)水平無(wú)顯著影響(圖5I)。

圖5 CaCl2對(duì)低溫(4℃)脅迫下3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的垂穗披堿草幼苗抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)量的影響

2.6 外源CaCl2對(duì)低溫脅迫下垂穗披堿草葉片中脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響

CaCl2處理能夠誘導(dǎo)低溫脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生改變。EnCBF12，EnCOR410，EnCS120，EnDHN5和EnMYB4基因的表達(dá)量在脅迫0～12 h內(nèi)迅速上升，在低溫脅迫24～120 h時(shí)呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)；外源CaCl2處理也呈現(xiàn)相似地變化趨勢(shì)(圖6)。EnSDR1基因在低溫脅迫2和12 h時(shí)出現(xiàn)2個(gè)表達(dá)峰值；低溫脅迫6 h下噴施CaCl2能顯著誘導(dǎo)EnCS120基因的表達(dá)，與低溫6 h下噴施水相比分別增加184.80%，799.58%，100.57%(P<0.05)；在低溫脅迫12 h時(shí)，CaCl2處理顯著誘導(dǎo)EnCOR410和EnDHN5基因表達(dá)，較低溫處理12 h分別增加30.11%和192.40%；在低溫脅迫24 h 時(shí)，CaCl2處理顯著上調(diào)EnCS120和EnMYB4基因的表達(dá)，與低溫處理相比分別增加173.20%和137.41%(P<0.05)。

3 討論

3.1 外源CaCl2對(duì)低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗形態(tài)的影響

低溫作為常見(jiàn)的非生物因素，能夠影響植物超微結(jié)構(gòu)、形態(tài)和生理，嚴(yán)重時(shí)能導(dǎo)致植物死亡[29]。Shi等[18]發(fā)現(xiàn)低溫抑制了狗牙根幼苗的生長(zhǎng)，而5～20 mM外源CaCl2能明顯改善低溫脅迫引起的生長(zhǎng)抑制。與之相似，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫會(huì)降低垂穗披堿草的鮮重、株高和根長(zhǎng)[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在低溫脅迫(4℃)下，垂穗披堿草幼苗的株高和根長(zhǎng)、地上及地下鮮重和地上及地下干重顯著低于CK；在低溫條件下噴施15 mM CaCl2能夠緩解低溫對(duì)垂穗披堿草幼苗的生長(zhǎng)抑制作用，提高了低溫脅迫下的生物量。

3.2 外源CaCl2對(duì)低溫脅迫下垂穗披堿草葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

3.3 外源CaCl2對(duì)低溫脅迫下西藏野生垂穗披堿草低溫相關(guān)基因表達(dá)的影響

植物在遭受低溫脅迫時(shí)，通過(guò)低溫信號(hào)感知、傳遞，產(chǎn)生一定的生理應(yīng)答響應(yīng)，這個(gè)過(guò)程會(huì)引發(fā)一系列與低溫脅迫應(yīng)答相關(guān)的各種生理生化反應(yīng)與脅迫相關(guān)的基因表達(dá)變化[43]。如R2R3型轉(zhuǎn)錄因子MYB4和CBFs及COR410，CS120等脫水素相關(guān)的基因能夠誘導(dǎo)一系列的生理代謝防御響應(yīng)，保護(hù)植物細(xì)胞免受低溫脅迫損傷[44-46]；SDR1(dehydrogenase/reductase 1)基因編碼脂肪酸脫氫酶，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性保護(hù)植物不受低溫傷害[47]。Zhu等[48]報(bào)道，Ca2+作為第二信使能夠?qū)⒌蜏匦盘?hào)傳遞到CBF-COR低溫響應(yīng)通路，從而調(diào)控植物的低溫應(yīng)答。本試驗(yàn)研究表明，低溫脅迫處理下，外源CaCl2處理顯著改變垂穗披堿草葉片中EnCOR410，EnCS120，EnDHN5和EnMYB4基因的表達(dá)。相似地，王慶杰和王立[17]研究也表明Ca2+通過(guò)誘導(dǎo)低溫基因的表達(dá)在植物應(yīng)答低溫脅迫時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用。

4 結(jié)論