王澤華，聶興華，張 煜，郝雅瓊，李伊然，張 卿， 張鐵強(qiáng)，王廣鵬，秦 嶺，邢 宇*

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 2.河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所，河北昌黎 066600)

板栗(CastaneamollissimaBl.)是中國重要的經(jīng)濟(jì)林樹種之一，已有6 000多年栽培歷史[1]。中國板栗品種豐富，分布范圍廣泛。板栗在生產(chǎn)栽培過程中，會(huì)受到栗疫病的危害，影響板栗產(chǎn)量。栗疫病是一種由栗疫病菌引起的真菌性病害[2]，主要危害板栗枝干，其最適生長溫度為25～28 ℃[3]。1904年，在美國紐約動(dòng)物園的美洲栗上首次發(fā)現(xiàn)栗疫病[4]。在隨后不到半個(gè)世紀(jì)的時(shí)間內(nèi)該病幾乎摧毀了全境的美洲栗樹[5]。隨后在歐洲意大利、法國等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)栗疫病[6-8]。在中國部分地區(qū)也發(fā)現(xiàn)栗疫病。目前，栗疫病已成為危害栗屬植物的一種全球性病害。

解決栗疫病最有效途徑是選育抗病品種，而篩選抗性強(qiáng)的種質(zhì)資源和解析栗疫病的抗病遺傳機(jī)制對(duì)抗病育種有重要的指導(dǎo)作用。在栗疫病抗性評(píng)價(jià)方面，中國板栗一直被認(rèn)為是對(duì)栗疫病抗性最強(qiáng)的一個(gè)種[9]。中國板栗栗疫病抗性基因是選育抗病品種的重要基礎(chǔ)。秦嶺等[10]從中國北方板栗21個(gè)品種(類型)中選出北峪2號(hào)、興隆城9號(hào)、野生板栗、渤海所18、燕魁和短花栗等7個(gè)抗性品種(類型)；HUANG等[11]從中國13個(gè)傳統(tǒng)板栗品種中篩選出葉里藏、紅光和晚薄殼3個(gè)抗性品種，為生產(chǎn)上選用抗栗疫病品種資源及抗栗疫病親本選擇提供參考。

在栗疫病抗性基因挖掘方面，前人進(jìn)行大量研究。已有證據(jù)表明中國栗樹對(duì)栗疫病的抗性是由2個(gè)不連鎖的共顯性基因控制[12]；KUBISIAK等[13]鑒定出與栗疫病相關(guān)的3個(gè)抗性區(qū)段，其中2個(gè)抗性區(qū)段與桃中的白粉病抗性相關(guān)；通過對(duì)美國和中國板栗的轉(zhuǎn)錄組分析比較，已經(jīng)鑒定幾種可能參與栗疫病防御反應(yīng)的基因[14-15]；在歐洲，亞洲和歐洲板栗之間的種間雜交已經(jīng)產(chǎn)生對(duì)栗疫病具有一定程度抗性的雜交種[16-17]；同時(shí)，XING等[18]發(fā)布中國板栗基因組；JI等[19]構(gòu)建中國板栗高密度遺傳圖譜，為今后中國板栗栗疫病抗性研究提供一定基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步挖掘中國板栗栗疫病抗病數(shù)量性狀位點(diǎn)，本研究選用河北省昌黎果樹研究所栽培的‘燕山早豐’與‘燕晶’及其正反交群體。對(duì)該雜交群體175個(gè)F1代進(jìn)行栗疫病接種試驗(yàn)并對(duì)抗病數(shù)量性狀位點(diǎn)進(jìn)行初定位，鑒定板栗栗疫病抗病數(shù)量性狀位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料育種

以河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所雜交育種圃栽培的‘燕山早豐’與‘燕晶’及其正反交群體為試材，共選用175個(gè)F1代，其中‘燕山早豐’一年生枝條接種栗疫病菌后病斑面積為51 mm2；‘燕晶’一年生枝條接種栗疫病菌后病斑面積72 mm2。試驗(yàn)材料選擇在田間已栽培7年的成熟板栗樹體，隨機(jī)選取3根結(jié)果母枝上長約30 cm、直徑約10 mm的一年生枝條，隨后進(jìn)行離體抗性評(píng)價(jià)。

1.2 供試菌株與菌株培養(yǎng)

供試菌株為‘EP155’(CryphonectriaparasiticaEP155)，菌落橘黃色的野生型強(qiáng)毒力菌株，保存于北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院秦嶺課題組(圖1)。

將活化EP155菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，光照16 h/d條件下培養(yǎng)。

1.3 枝條離體接種

采用枝條離體接種[20]。將接種枝條進(jìn)行酒精消毒后吹干，用長6 mm、寬2 mm的打孔器在枝條上按一定間距打3個(gè)孔，要求孔能夠見木質(zhì)部。用直徑6 mm的打孔器挑取在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d的供試菌株，用于離體枝條接種。同時(shí)用未接菌的PDA培養(yǎng)基接種枝條，設(shè)置對(duì)照。每個(gè)子代重復(fù)3次，在接種完成后將枝條平放在鋪有濕潤吸水紙的托盤上，放入溫度28 ℃、濕度60%、光照16 h/d的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

接種后每隔1 d觀測一次枝條發(fā)病情況，測量記錄病斑長度、寬度，觀察病斑擴(kuò)展速率。調(diào)查持續(xù)4 d。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)病斑長度、寬度計(jì)算出枝條發(fā)病面積，對(duì)枝條發(fā)病面積進(jìn)行抗性分級(jí)；將雜交群體離體接種枝條的病斑面積用Excel整理，把其改為*qua文件格式保存。結(jié)合秦嶺課題組已發(fā)表的中國板栗高密度遺傳圖譜[19]，以區(qū)間作圖法(Interval Mapping, IM)進(jìn)行栗疫病抗性相關(guān)基因的數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait loci，QTL)定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交群體抗性分級(jí)

栗疫病菌接種雜交群體4 d后，枝條平均潰瘍面積呈連續(xù)變異且頻數(shù)分布符合正態(tài)分布趨勢(圖2)，有利于栗疫病抗性基因QTL分析。根據(jù)接種后離體枝條的潰瘍面積，將雜交群體分為5級(jí)。第I級(jí)38個(gè)子代，平均潰瘍面積33～48 mm2；第II級(jí)68個(gè)子代，平均潰瘍面積48～63 mm2；第III級(jí)42個(gè)子代，平均潰瘍面積63～78 mm2；第IV級(jí)26個(gè)子代，平均潰瘍面積78～93 mm2；第V級(jí)1個(gè)子代，平均潰瘍面積93～107 mm2；將第I級(jí)定為抗病子代、第III級(jí)定為中抗子代，第V級(jí)定為易感子代(圖3)。

2.2 雜交群體栗疫病抗性QTL定位

根據(jù)雜交群體的栗疫病抗性鑒定結(jié)果，結(jié)合北京農(nóng)學(xué)院秦嶺課題組已發(fā)表的板栗高密度遺傳圖譜[19]，利用區(qū)間作圖法，對(duì)抗病QTL的位置和效應(yīng)進(jìn)行分析(表1和圖4)。共檢測到13個(gè)栗疫病抗性QTL，分布在LG1、LG5、LG6、LG7和LG11連鎖群上，單個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率為6.4%～12.0%。其中，np1010、lm1157和hk52的貢獻(xiàn)率較高，分別為12.0%、8.3%、8.1%，這3個(gè)位點(diǎn)可能是板栗栗疫病抗性基因的關(guān)鍵位點(diǎn)。

表1 基于區(qū)間作圖法鑒定的中國板栗栗疫病抗性QTLTab.1 QTL for resistance to chestnut blight by IM mapping

3 討 論

人們對(duì)栗疫病的研究集中在病菌的侵染循環(huán)、遺傳結(jié)構(gòu)、毒力分化方面[21]。黃宗安[22]在錐栗栗疫病的研究中發(fā)現(xiàn)，樹皮中多酚類物質(zhì)、黃酮類化合物、木質(zhì)素含量以及多酚氧化酶活性等物質(zhì)與錐栗栗疫病抗性相關(guān)；STATON等[23]篩選到15個(gè)可能與栗疫病抗性相關(guān)基因。近年來，植物免疫調(diào)控研究取得一系列研究進(jìn)展[24-25]。越來越多的抗病機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，比如激酶通過磷酸化反應(yīng)在生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，目前已報(bào)道多種受體激酶或受體蛋白參與植物免疫信號(hào)的識(shí)別和激活[26]；XING等[18]發(fā)布中國板栗基因組；這些研究進(jìn)展都將促進(jìn)栗疫病抗病育種的進(jìn)程。

利用遺傳連鎖圖譜進(jìn)行數(shù)量性狀QTL定位在果樹分子育種中有很重要的作用。姚玉新等[27]利用蘋果品種‘東光’和‘富士’的正反交F1群體，獲得與果實(shí)酸度基因Ma相連鎖的分子標(biāo)記SDY085；梨樹上，MONTANARI等[28]對(duì)‘PEAR3’בMoonglow’F1群體抗枯萎病性狀進(jìn)行QTL分析，在父本LG2上發(fā)現(xiàn)一個(gè)主效QTL位點(diǎn)；YUAN等[29]利用2個(gè)寬皮橘雜交的F1群體對(duì)柑橘果皮果肉的色差值進(jìn)行QTL定位得到一些候選區(qū)間。本研究利用‘燕山早豐’與‘燕晶’雜交后代進(jìn)行栗疫病抗性QTL定位，挖掘與栗疫病抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記，為栗疫病抗病分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定一定理論基礎(chǔ)。本研究選用一年生枝條作抗病評(píng)價(jià)材料，評(píng)價(jià)1年的數(shù)據(jù)，這些因素可能會(huì)影響抗病QTL定位結(jié)果。

本研究在JI等[19]遺傳圖譜第1連鎖群、第5連鎖群、第6連鎖群、第7連鎖群、第11連鎖群上鑒定到栗疫病抗性QTL位點(diǎn)，通過與已發(fā)表的栗疫病抗性QTL位點(diǎn)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)本研究鑒定到的第6連鎖群與KUBISIAK等[13]定位的Cbr2位點(diǎn)重合。