王黎霞，張 鵬，張建軍，安 健*

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧醫(yī)系，北京 102442；2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

球蟲病是艾美耳屬球蟲感染所引起的原蟲病[1]。疫苗是雞球蟲病主要的防控手段。其中，基因工程疫苗以獨(dú)特的優(yōu)勢具有廣闊的應(yīng)用前景[2]，保護(hù)性抗原在球蟲病重組疫苗的研制中起著十分重要的作用，尋找合適的抗原是未來球蟲免疫的重要選擇[3]。柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白4(Eimeriatenellamicroneme protein 4，EtMIC4)是一種新發(fā)現(xiàn)的艾美耳球蟲蛋白，分子量240 kD，具有重復(fù)的TSP-1和EGF結(jié)構(gòu)域，在球蟲入侵宿主細(xì)胞的過程中起到重要的作用。JAVIER等[4]用5’RACE的方法首次克隆到EtMIC4基因的全長序列。黃欣梅等[5]和DU等[6]利用大腸桿菌表達(dá)EtMIC4蛋白的C端，此重組蛋白免疫試驗(yàn)雞，能夠部分抵抗柔嫩艾美耳球蟲的攻蟲的致病性，然而真核表達(dá)的蛋白在表達(dá)后修飾方面優(yōu)于原核表達(dá)產(chǎn)物，更接近原來蛋白的結(jié)構(gòu)。本研究是為了獲得重組柔嫩艾美耳球蟲微線N端蛋白(RecombinantEimeriatenellamicroneme protein 4 N，rEtMIC4N)，所以克隆EtMIC4N基因，與已發(fā)表的基因序列比較，構(gòu)建真核表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N，利用畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)rEtMIC4N，為后續(xù)其免疫原性研究打基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊，北京農(nóng)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存。

pGEM-T克隆載體、表達(dá)載體pPICZαA、大腸桿菌JM109、畢赤酵母GS115、Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Oligo(dT)15、Rnasin、DNA膠回收試劑盒為TaKaRa產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 EtMIC4N特異性片段的克隆和序列分析 Trizol一步法從柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊分離總RNA，根據(jù)Genebank設(shè)計柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白4基因N端(EtMIC4N)引物[7]，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、克隆、測序和序列分析。

1.2.2 重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建 EtMIC4N片段與pPICZαA連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，生長菌落即為疑似陽性菌落，提取質(zhì)粒，PCR鑒定，驗(yàn)證pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建成功與否。

1.2.3 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及陽性菌株的篩選 將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體、空表達(dá)載體電轉(zhuǎn)入感受態(tài)畢赤酵母，在100 μg/mL含Zeocin的YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，凡生長菌落即是疑似菌落，用AOX通用引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 rEtMIC4N的小規(guī)模表達(dá)篩選及鑒定 試驗(yàn)分為3組：空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)對照組、重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母未用甲醇誘導(dǎo)對照組和重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組，對這3組進(jìn)行rEtMIC4N的小規(guī)模表達(dá)。

收集空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)對照組第2天的上清和重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母未用甲醇誘導(dǎo)對照組第36小時的上清各1 mL為對照；分別收集重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天的上清各1 mL進(jìn)行SDS-PAGE電泳、硝酸銀染色鑒定。收集重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組第3天的上清1 mL，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.5 rEtMIC4N的大規(guī)模表達(dá)及純化 以搖瓶的方式對重組載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)，進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)，離心收集第3天的150 mL的培養(yǎng)上清，超濾除鹽后濃縮為5 mL，先流經(jīng)Ni-NTA柱，再通過250 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，以柱容積為單位分別收集洗脫液，利用分光光度計在OD280對重組蛋白進(jìn)行測定，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、硝酸銀染色和Western blot鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 EtMIC4N特異性片段的克隆和序列分析

EtMIC4N特異性片段的克隆后得到773 bp的EtMIC4N特異性片段(圖1)。EtMIC4N基因序列經(jīng)Blast分析顯示，克隆序列與Genebank中EtMIC4N的1 004～1 766 bp序列基本吻合，與開放閱讀框保持一致，其中4個堿基發(fā)生突變和1個Gap，基因相似度99.5%。在蛋白水平上，與Genebank的EtMIC4N蛋白比較，有4個氨基酸發(fā)生突變，相似度為98%。

2.2 重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建與鑒定

經(jīng)連接成功的重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N轉(zhuǎn)染大腸桿菌JM109，挑取白色單菌落LLB/Zeocin液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的條帶，說明重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建成功，見圖2。

2.3 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及陽性菌株的篩選

提取JM109感受態(tài)細(xì)胞中PICZαA/EtMIC4N重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)畢赤酵母，涂布于含Zeocin的YPD平板，對菌落進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示預(yù)期的目的條帶(圖3)，證明轉(zhuǎn)化成功，且為陽性重組畢赤酵母。

2.4 rEtMIC4N的小規(guī)模表達(dá)篩選及鑒定

SDS-PAGE顯示，重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天的上清中約45 kD的位置出現(xiàn)彌散狀的條帶，而空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)對照組和重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母未用甲醇誘導(dǎo)對照組的上清中均沒有此條帶(圖4)，Western Blot分析顯示，表達(dá)的蛋白大小為45 kD(圖5)，說明rEtMIC4N是由甲醇誘導(dǎo)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母產(chǎn)生的。SDS-PAGE和Western Blot的結(jié)果一致，說明45 kD的條帶為分泌表達(dá)的rEtMIC4N。

2.5 rEtMIC4N的大規(guī)模表達(dá)及純化

大規(guī)模表達(dá)濃縮液經(jīng)Ni-NTA柱洗脫，收集的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE，在45 kD處出現(xiàn)單一條帶，且主要是被第2個柱容積的洗脫液洗脫下來(圖6)。純化后的蛋白經(jīng)Western Blot鑒定，條帶同SDS-PAGE結(jié)果一致，但在80 kD的位置還出現(xiàn)一個條帶(圖7)。通過OD280對蛋白進(jìn)行測定，每升的酵母發(fā)酵液3 d能夠表達(dá)大約為10 mg的rEtMIC4N。

3 討 論

目前的抗原篩選研究與自然條件下球蟲感染雞的免疫途徑并不相同，在自然條件下，艾美耳球蟲主要引起的是細(xì)胞免疫應(yīng)答，如果能建立一種雞腸道細(xì)胞模型，用細(xì)胞免疫的水平來篩選有效的抗原，再用細(xì)胞免疫的途徑對雞進(jìn)行免疫來預(yù)防艾美耳球蟲病，此研究思路可望在艾美耳球蟲病的預(yù)防方面獲得突破性的進(jìn)展[7]。而真核表達(dá)的抗原更為接近天然結(jié)構(gòu)，這對抗原的有效篩選有著重要的意義。

JAVIER等[4]用5’RACE的方法首次克隆到EtMIC4的全序列，發(fā)現(xiàn)EtMIC4與巨型艾美耳球蟲TFP250蛋白有較高的同源性，而與剛地弓形蟲翻譯起始位點(diǎn)的一致，說明EtMIC4的起始密碼子同樣在Kozol序列中[8]。對EtMIC4的內(nèi)含子和外顯子分析，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含子還有剪接的保守序列[9-10]。經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)生樹的分析，EtMIC4和TF250的TSP-1結(jié)構(gòu)域與TgMIC12的遺傳距離較遠(yuǎn)[11]。EtMIC4基因的進(jìn)化祖先可能含有連續(xù)的TSP-1外顯子區(qū)域，通過內(nèi)含子的重組和進(jìn)化，最后形成艾美耳屬的MIC4。EGF樣結(jié)構(gòu)域之間含有大量的內(nèi)含子，說明EGF的多拷貝進(jìn)化要早于TSP-1。這與缺少內(nèi)含子的EGF樣結(jié)構(gòu)域的層黏蛋白在進(jìn)化上的結(jié)果一致[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)rEtMIC4時，蛋白條帶銀染的結(jié)果灰度分析顯示第1天到第2天未發(fā)現(xiàn)可見條帶，說明前2 d表達(dá)量較少，3～6 d差異不大，所以在大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)時，選擇在第3天回收上清。

CHEN等[14]表達(dá)乳鐵蛋白相關(guān)抗菌多肽時，發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物比預(yù)期的分子量大。王鑫等[15]表達(dá)豬β-防御素也出現(xiàn)相似現(xiàn)象。本試驗(yàn)中rEtMIC4N的基因序列和表達(dá)載體的標(biāo)簽序列組成的重組蛋白分子量大小為29 kD，畢赤酵母分泌表達(dá)的蛋白約為45 kD，比預(yù)測的分子量要大。其原因可能是由于rEtMIC4是一個重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白，導(dǎo)致其蛋白的折疊等高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，也可能是由于rEtMIC4N的糖基化作用，使分子量增大，但其具體原因尚待進(jìn)一步研究。

SDS-PAGE的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示在62 kD到83 kD之間未出現(xiàn)條帶，但經(jīng)Western Blot檢測，在這個位置有輕微的條帶，說明重組蛋白有微量的出現(xiàn)，這可能是表達(dá)的rEtMIC4N形成少量二聚體，被靈敏度較高的Western Blot檢測出。

EtMIC4蛋白分子量較大，較難整體重組表達(dá)，需分段進(jìn)行。rEtMIC4C是C端重組蛋白，rEtMIC4N是N端蛋白。DANFORTH等[16]對rEtMIC4C的免疫原性進(jìn)行研究，證明rEtMIC4C對雞預(yù)防球蟲同源感染有一定效果。DU等[6]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷與原核表達(dá)的rEtMIC4C聯(lián)合免疫雞，能夠部分抵抗柔嫩艾美耳球蟲的攻擊，且發(fā)現(xiàn)rEtMIC4C沙門氏菌載體疫苗對雞同源艾美耳球蟲攻擊的保護(hù)作用[17]。JAVIER等[4]獲得EtMIC4的全長序列后，還未見對其新發(fā)現(xiàn)的N端序列進(jìn)行表達(dá)和免疫原性的研究。本試驗(yàn)成功對rEtMIC4N進(jìn)行畢赤酵母表達(dá)及鑒定，并獲得一定量純度較高的蛋白，搖瓶發(fā)酵的表達(dá)量可達(dá)到10 mg/L，至于其免疫原性及臨床應(yīng)用前景值得進(jìn)一步探索。