田苗新,邵君琳,王光強(qiáng),熊智強(qiáng),張匯,宋馨,艾連中,夏永軍

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海食品微生物工程技術(shù)研究中心,上海,200093)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性的、反復(fù)發(fā)作的腸道炎癥疾病。IBD主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)兩種表型[1]。IBD發(fā)病機(jī)制是多因素的,包括腸上皮屏障破壞、免疫應(yīng)答紊亂、腸道菌群變化等[2],但具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚。在治療IBD過程中服用的藥物會(huì)引起多種副作用[3]。因此,研究IBD發(fā)病機(jī)制并探索降低治療副作用的方法至關(guān)重要。

益生菌是緩解IBD的有效途徑。益生菌可通過改善腸道屏障、降低腸道pH、調(diào)節(jié)腸道菌落組成等方式緩解結(jié)腸炎癥狀[4]。益生菌攝入可調(diào)整腸道菌群多樣性,改善結(jié)腸炎引發(fā)的生態(tài)失調(diào)[5-6]。但高劑量攝入益生菌會(huì)加重小鼠結(jié)腸炎[7]。益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響的機(jī)理尚不清楚。結(jié)腸炎發(fā)病過程中,腸道受到外來物或致病菌刺激,導(dǎo)致腸道屏障、炎癥水平等發(fā)生顯著改變?？股赝ㄟ^干擾腸道菌群,改變腸道敏感性,降低腸道菌群復(fù)雜性,達(dá)到治療疾病的目的,但抗生素的攝入會(huì)干擾腸道菌群定殖能力,與益生菌聯(lián)合服用可能導(dǎo)致復(fù)雜的相互作用,改變腸道代謝及免疫[8-9]。

前期研究表明,植物乳桿菌AR113可以較好地緩解葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀,通過調(diào)節(jié)TLR4-NF-κB途徑降低腸道炎癥水平,改善腸道菌群組成,維持腸道屏障完整性[10]。本文考察青霉素干預(yù)及青霉素與植物乳桿菌AR113聯(lián)合處理對(duì)小鼠結(jié)腸炎的影響,為解析植物乳桿菌AR113緩解結(jié)腸炎奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6 J小鼠,SPF級(jí),日齡28～35 d,由上海杰斯捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(中國(guó)上海)提供,許可證號(hào)：SCXK(滬)2013—0006。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

植物乳桿菌AR113篩選自四川泡菜,保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),菌種保藏號(hào)：No.13909。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑

葡聚糖硫酸鈉(MW：36 000～50 000),MP Biomedicals；便隱血試劑盒,貝索企業(yè)；5-氨基水楊酸,源葉生物；青霉素G鈉鹽、Trizol,生工生物；髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒,南京建成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒,南京諾唯贊;qPCR SYBR Green Master Mix,翊圣生物；引物由華大基因合成。

1.4 主要儀器設(shè)備

RM 2016病理切片機(jī),德國(guó)Leica；JK-6組織攤烤片機(jī),武漢俊杰；E100顯微鏡,尼康；550D數(shù)碼單反相機(jī),佳能；L500低速離心機(jī),湖南湘儀；Nano Drop 2 000分光光度計(jì),Thermo Scientific；S1000梯度PCR儀,美國(guó)伯樂Bio-rad；LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,羅氏制藥。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及處理

雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，每籠8只，飼養(yǎng)溫度(22 ± 2)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，循環(huán)12 h光照/黑暗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用3% DSS造模。48只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常組(Control)、模型組(DSS)、陽(yáng)性對(duì)照組(DSS+5-ASA)、AR113組(DSS+AR113)、青霉素干預(yù)組(DSS+Pen)、青霉素與AR113聯(lián)合組(DSS+Pen+AR113)(青霉素干預(yù)后灌胃植物乳桿菌AR113)。

小鼠適應(yīng)1周后，青霉素干預(yù)組、青霉素與AR113聯(lián)合組自由飲用1 g/L的青霉素鈉鹽水溶液3周，其余各組飲用無菌水3周。隨后所有實(shí)驗(yàn)組自由飲用無菌水3 d后，小鼠自由飲用3% DSS水溶液造模7 d，造模第5天開始到第14天，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃5-氨基水楊酸(5 g/L)，AR113組、青霉素與AR113聯(lián)合組灌胃植物乳桿菌AR113(1×109CFU/mL)，其余各組灌胃無菌水。本研究遵循動(dòng)物試驗(yàn)委員會(huì)所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)為倫審-KYSB-2016-97。實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示：

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Experimental protocols

2.2 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)的測(cè)定

DAI評(píng)分基于 MURTHY 評(píng)分系統(tǒng)[11]。DAI 包括3個(gè)部分：體重變化、便血情況和糞便性狀。選用便隱血試劑盒測(cè)糞便中的潛血。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示：

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Disease activity index scoring standards

2.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，H&E)染色及阿利新藍(lán)染色

采用阿利新藍(lán)將結(jié)腸黏液層的黏蛋白染成藍(lán)色,評(píng)估結(jié)腸黏蛋白變化[12]。H&E 對(duì)結(jié)腸染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)估[13]。根據(jù)炎癥、隱窩損傷程度、黏膜損傷和病變范圍對(duì)H&E染色照片進(jìn)行組織損傷評(píng)分。組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示：

表2 組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Histological score standards

2.4 MPO測(cè)定

根據(jù)南京建成MPO試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

2.5 結(jié)腸組織mRNA表達(dá)量測(cè)定

Trizol法提取結(jié)腸組織總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。根據(jù)qPCR SYBR Green Master Mix使用說明對(duì)腸道相關(guān)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。所涉及的引物序列如表3所示,以β-actin作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表3 引物序列Table 3 Primer sequence

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 小鼠DAI與體重變化

DAI表征小鼠結(jié)腸炎發(fā)展?fàn)顩r。研究結(jié)果顯示(圖2),隨著DSS攝入,模型組小鼠體重逐漸降低,AR113組與陽(yáng)性對(duì)照組能夠顯著減緩小鼠體重降低。但青霉素干預(yù)組與聯(lián)合處理組在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)體重?zé)o顯著降低,變化趨勢(shì)與正常組小鼠一致(圖2-a)。與模型組小鼠相比,AR113組能夠顯著降低結(jié)腸組織DAI評(píng)分,而青霉素干預(yù)組以及聯(lián)合處理組DAI評(píng)分變化無顯著差異,顯著低于模型組以及AR113組,變化趨勢(shì)與正常組接近(圖2-b),這與體重監(jiān)測(cè)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組小鼠體重與DAI存在顯著差異(圖2-c、d)。

a-實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)小鼠體重變化；b-實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)小鼠DAI變化；c-實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠體重差異；d-實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠DAI差異圖2 青霉素與植物乳桿菌AR113對(duì)小鼠體重及疾病活動(dòng)指數(shù)的影響Fig.2 Effects of penicillin and Lactobacillus plantarum AR113 on body weight and disease activity index of mice

3.2 青霉素及植物乳桿菌AR113對(duì)腸道活性及結(jié)腸長(zhǎng)度影響

MPO是只存在于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的顆粒血紅素酶。中性粒細(xì)胞是急性炎癥的標(biāo)志,當(dāng)病原體侵入時(shí),中性粒細(xì)胞將病原體吞噬,保證機(jī)體的正常運(yùn)行[14]。故檢測(cè)結(jié)腸中MPO活性表征小鼠結(jié)腸炎癥程度。研究結(jié)果表明,模型組小鼠MPO活性顯著升高,AR113組MPO活性最低；青霉素干預(yù)組與聯(lián)合處理組也能夠顯著降低MPO活性,可使其恢復(fù)到正常組水平且兩組間無顯著差異(圖3-a)。結(jié)腸長(zhǎng)度變化可表征小鼠炎癥程度。模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著降低,與MPO結(jié)果相一致,青霉素干預(yù)組以及聯(lián)合處理組得到有效緩解,結(jié)腸長(zhǎng)度恢復(fù)到正常水平(圖3-b)。

a-小鼠結(jié)腸MPO活性；b-結(jié)腸長(zhǎng)度圖3 青霉素與植物乳桿菌AR113對(duì)小鼠結(jié)腸MPO 活性及結(jié)腸長(zhǎng)度的影響Fig.3 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on MPO activity and colon length in mouse colon

3.3 結(jié)腸組織H&E染色及組織損傷評(píng)分

小鼠攝入DSS后引起結(jié)腸組織發(fā)生炎癥反應(yīng),如圖4-a所示。模型組結(jié)腸上皮組織結(jié)構(gòu)破壞,中性粒細(xì)胞數(shù)量增多,出現(xiàn)隱窩消失。灌胃AR113后,小鼠結(jié)腸上皮組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)良好,顯著減少中性粒細(xì)胞數(shù)量,與DIN等[15]研究結(jié)果一致。青霉素干預(yù)組以及聯(lián)合處理組小鼠結(jié)腸組織同樣得到良好恢復(fù)。組織評(píng)分顯示(圖4-b),模型組組織損傷評(píng)分顯著高于對(duì)照組,灌胃AR113后組織損傷程度降低,而經(jīng)過青霉素以及聯(lián)合治療后,小鼠結(jié)腸組織損傷程度最低,且兩者無顯著差異。

a-結(jié)腸HE染色圖;b-結(jié)腸組織損傷評(píng)分 1-正常組；2-模型組；3-陽(yáng)性對(duì)照；4-AR113組；5-青霉素干預(yù)； 6-青霉素與AR113聯(lián)合圖4 青霉素與植物乳桿菌AR113對(duì)小鼠結(jié)腸組織的影響Fig.4 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on mouse colon tissue

3.4 青霉素及植物乳桿菌AR113對(duì)腸道上皮黏液層影響

腸道上皮黏液層對(duì)腸道組織具有保護(hù)作用,是一個(gè)由黏液蛋白組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。其中黏蛋白MUC2是由腸道上皮組織杯狀細(xì)胞分泌,用于保護(hù)腸道及維持腸道穩(wěn)態(tài)[16]。阿利新藍(lán)可與MUC2結(jié)合,表征腸道上皮黏蛋白含量[17]。由圖5-a可知,由于模型組結(jié)腸上皮組織結(jié)構(gòu)被破壞,大量杯狀細(xì)胞損傷,導(dǎo)致黏蛋白分泌量明顯減少,與H&E染色與組織損傷評(píng)分結(jié)果一致。灌胃AR113后,結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)恢復(fù),黏蛋白MUC2含量明顯增加；與模型組相比,青霉素干預(yù)組與聯(lián)合處理組黏蛋白MUC2含量也出現(xiàn)增加,但是含量低于AR113組。qPCR結(jié)果顯示(圖5-b),灌胃AR113黏蛋白合成基因MUC2表達(dá)量顯著上升,且表達(dá)量在各組中最高,黏蛋白含量顯著增加。青霉素干預(yù)組以及聯(lián)合處理組經(jīng)過治療后,黏蛋白合成基因MUC2表達(dá)量恢復(fù)到正常水平,且兩組間無顯著差異?？股靥幚砗?服用植物乳桿菌AR113不會(huì)干擾腸道上皮細(xì)胞黏液層恢復(fù),但抗生素會(huì)降低黏液層的恢復(fù)效果。

a-結(jié)腸阿利新藍(lán)染色;b-結(jié)腸MUC2蛋白相對(duì)表達(dá)水平 1-正常組；2-模型組；3-陽(yáng)性對(duì)照；4-AR113組；5-青霉素干預(yù)； 6-青霉素與AR113聯(lián)合圖5 青霉素與植物乳桿菌AR113對(duì)小鼠結(jié)腸黏液層的影響Fig.5 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on mucus layer of mouse colon

3.5 青霉素及植物乳桿菌AR113對(duì)結(jié)腸炎癥因子水平影響

機(jī)體正常狀態(tài)下,免疫系統(tǒng)維持穩(wěn)態(tài)。當(dāng)機(jī)體受到外界干擾時(shí),免疫細(xì)胞受刺激,釋放炎癥因子作為信號(hào)分子,刺激相關(guān)細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體免疫,使機(jī)體恢復(fù)正常狀態(tài)[18-19]。如圖6所示,DSS造模后,模型組小鼠結(jié)腸組織損傷,促炎因子TNF-α、IL-6表達(dá)顯著增加(圖6-a、b),抑炎因子IL-10表達(dá)量有一定降低(圖6-c),但不顯著。灌胃AR113后,小鼠促炎因子TNF-α、IL-6表達(dá)顯著降低(圖6-a、b),抑炎因子IL-10表達(dá)顯著升高(圖6-c)。青霉素干預(yù)組以及聯(lián)合處理組治療后,炎癥因子變化趨勢(shì)無顯著差異,兩組均能夠顯著降低TNF-α基因表達(dá)量(圖6-a),且表達(dá)水平顯著低于AR113組,但是抑炎因子IL-10表達(dá)水平顯著低于AR113組(圖6-c)。利用無菌小鼠進(jìn)行DSS造模,小鼠無明顯結(jié)腸炎癥狀,而正常小鼠則出現(xiàn)嚴(yán)重結(jié)腸炎癥狀,說明腸道菌群可能介導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎發(fā)病[20]。SOVRAN等[21]研究表明,抗生素可顯著影響真菌對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠腸炎模型的治療效果。分析腸道菌群顯示,真菌治療效果受腸桿菌影響。萬古霉素處理小鼠后,殺滅腸道中的腸桿菌,造成小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)不敏感,降低結(jié)腸炎發(fā)病率。因此,青霉素?cái)z入可能通過有效降低促炎菌群,從而抑制促炎因子的表達(dá),降低炎癥水平[22]。

a-TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)水平；b-IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平； c-IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)水平圖6 青霉素與植物乳桿菌AR113對(duì)小鼠結(jié)腸炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of penicillin and L.plantarum AR113 on the expression of inflammatory factors in the colon of mice

4 結(jié)論

益生菌與抗生素常用于炎癥性腸病緩解治療,兩者治療腸炎作用機(jī)制有所差異。植物乳桿菌AR113可以有效緩解小鼠結(jié)腸炎癥,恢復(fù)損傷的杯狀細(xì)胞,增加黏蛋白MUC2分泌,同時(shí)顯著提升小鼠結(jié)腸抑炎因子IL-10表達(dá),激活腸道免疫系統(tǒng)。青霉素干預(yù)組與聯(lián)合處理組小鼠結(jié)腸癥狀以及大部分指標(biāo)并無明顯差異,均能夠有效降低結(jié)腸促炎因子TNF-α表達(dá),恢復(fù)腸道黏液層。青霉素干預(yù)處理在一定程度上鈍化DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎敏感性。但與灌胃AR113相比,青霉素處理會(huì)降低杯狀細(xì)胞恢復(fù),影響?zhàn)さ鞍譓UC2分泌,并降低結(jié)腸抑炎因子表達(dá)。益生菌攝入能夠有效恢復(fù)結(jié)腸炎癥狀,在一定程度上能夠替代抗生素對(duì)結(jié)腸炎的治療。