尤一 馬怡晗 段小群

摘要：目的 ?本研究旨在通過建立HFF-1細胞水平的皮膚衰老模型，進一步從分子水平探究谷凝皙（Growgx）酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物抗衰老的具體機制。方法 ?使用UVA輻射儀照射HFF-1細胞建立細胞衰老模型;通過MTT法檢測不同濃度Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物對UVA輻照后HFF-1細胞存活率的影響;通過使用流式細胞術檢測Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物對HFF-1細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的表達影響，以及通過Western Blot檢測Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物對抗衰老的相關蛋白的表達影響。結(jié)果 ?輻照劑量為10.8 J/cm2 的UVA可以導致HFF-1細胞的存活率顯著被抑制（P< 0.05），而Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物可以顯著抑制輻照劑量為10.8 J/cm2的UVA導致的HFF-1細胞存活率的降低。另外，Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物以劑量依賴方式清除細胞衰老模型中ROS的含量（P< 0.05），并且還能上調(diào)I型膠原（Collagen I）和下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）的蛋白表達（P< 0.05）。結(jié)論Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物能夠通過抑制細胞內(nèi)ROS的過表達，以及影響皮膚衰老相關蛋白的表達來抗皮膚衰老。

關鍵詞：皮膚衰老;谷凝皙（Growgx）酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物;活性氧;I型膠原;基質(zhì)金屬蛋白酶1

項目來源：廣西自然科學基金面上項目（2018GXNSFAA138098）

引言

皮膚是人體最大的器官，保護我們的內(nèi)部器官免受外部世界的影響。皮膚由表皮、真皮和皮下組織組成，在皮膚老化過程中，真皮層的變化最為明顯。皮膚老化包括內(nèi)在老化和外在老化，其中皮膚的內(nèi)在老化是隨年齡的增長而發(fā)生，表現(xiàn)為皮膚干燥、變薄、細紋、瘙癢。而外在老化則由紫外輻射引起，特征是深皺紋、皮膚松弛和色素過度沉著，導致皮膚過早衰老。人類表皮生長因子（Human epidermal growth factor， hEGF）在皮膚修復、再生及抗衰老中起著重要作用。然而hEGF分子量大且具有很強的親水性，導致皮膚滲透和細胞吸收不夠理想，顯著限制了其功效。谷凝皙（Growgx）酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物是一種類hEGF功能的小分子混合物，其分子量小、皮膚滲透性較好、可以有效修復皮膚衰老，在臨床上有巨大的開發(fā)前景。本實驗旨在探究Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物對皮膚衰老的修復作用及機制。

1 ?材料與方法

1.1主要材料與試劑

Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物由桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司提供;Collagen Ⅰ抗體、MMP-1抗體和β-actin抗體購自Bio-world公司;MTT試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;活性氧檢測試劑盒購自北京拜爾迪生物技術有限公司。UVA輻照儀購自Sigma公司;Western blotting系統(tǒng)購自美國伯樂公司;光學讀數(shù)分析天平購自北京賽多利斯天平有限公司;流式細胞儀購自Beckman Coulter公司;低溫高速離心機購自eppendorf公司;酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司;UVA輻照儀SS-01購自上海希格瑪高技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人皮膚成纖維細胞（HFF-1細胞）購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。HFF-1細胞在含有10%胎牛血清、1%丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中于37°C和5% CO2下培養(yǎng)，然后取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞存活率檢測

將HFF-1細胞（5×103/well）鋪于96孔板，待融合度達到80%后，用無血清培養(yǎng)基、不同濃度（5， 10， 20 μg/mL）的Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物于37℃，5% CO2下培養(yǎng)24 h，然后將培養(yǎng)基吸去，PBS溫和清洗細胞兩次后，每孔中加入200 μL的PBS將單層細胞覆蓋。隨后使用UVA輻照儀SS-01放于細胞板上方，輻照劑量為10.8 J/cm2，然后除去PBS，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），使用酶標儀檢測細胞的存活率。

1.4 細胞內(nèi)ROS水平檢測

將HFF-1細胞均勻鋪于6孔板中，待細胞貼壁融合至80%后，用無血清培養(yǎng)基、不同濃度（5， 10， 20 μg/mL）的Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物于37℃，5% CO2下培養(yǎng)24 h。然后使用UVA輻照儀SS-01按照1.1方法對HFF-1細胞進行UVA光老化誘導。建模結(jié)束后，除去PBS，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，按照活性氧檢測試劑盒的說明書，向每孔中加入5 μmol/L探針，于37℃條件下孵育30 min，期間每隔5 min輕輕混勻一下，使探針與細胞充分作用。隨后，用預冷的PBS沖洗2次，每次5 min，以除去未進入細胞內(nèi)的探針。收集細胞，采用流式細胞儀對探針含量進行檢測（激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm）。

1.5 Western blotting檢測Collagen I和MMP-1的蛋白表達

將HFF-1細胞均勻鋪于6孔板中，待細胞貼壁融合至80%時，用無血清培養(yǎng)基、不同濃度的Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物（5， 10， 20 μg/mL）于37℃，5% CO2下培養(yǎng)24 h。使用UVA輻照儀SS-01按照1.1方法，進行UVA誘導。建模結(jié)束后，除去PBS，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細胞，并使用裂解緩沖液（RIPA裂解緩沖液補充有1%苯甲磺酰氟）裂解細胞，然后將裂解好的細胞在4°C下以12，000 rpm離心10 min，收集上清液。根據(jù)目的蛋白的分子量，取等量的蛋白樣品用10%電泳膠分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，然后將膜放置在含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1.5 h。封閉后，將膜與一抗在4℃下孵育過夜。第二天，使用TBST緩沖液沖洗3次后，膜與二抗于室溫下孵育2 h。蛋白條帶圖像由全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)捕獲，并通過Quantity One軟件量化蛋白質(zhì)條帶的強度。

1.6 數(shù)據(jù)分析處理

使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software， Inc.， La Jolla， CA， USA）軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)表示為至少3次獨立實驗的算術平均值±平均值標準誤差（Standard error of mean， S.E.M.）。使用單向方差分析和Tukey事后檢驗來評估兩組數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計學差異。P值小于0.05 （P< 0.05）表明有差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物通過提高細胞衰老模型中細胞存活率抗皮膚衰老

為了研究Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物對細胞衰老模型中細胞存活率的影響，我們使用MTT法檢測細胞存活率。如圖1所示，與空白對照組相比，在劑量為10.8 J/cm2的UVA照射下可以導致HFF-1細胞的存活率顯著降低（p< 0.01），其存活率為對照組的78.84%。而Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物作用下能夠顯著提高UVA誘導的細胞衰老模型中細胞的存活率，其中隨著濃度的升高，依次為對照組的92.26%、97.18%和99.92%，其中濃度為20 μg/mL的Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物提高細胞存活率的能力最強（p< 0.01），幾乎可以阻止UVA誘導細胞的死亡。說明Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物具有抑制UVA誘導的皮膚成纖維細胞死亡的作用。

2.2 Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物通過抑制細胞衰老模型中ROS的表達水平抗皮膚衰老

為了研究Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物對細胞衰老模型中ROS表達含量的影響，我們使用流式細胞儀檢測細胞中的ROS含量。如圖2所示，在沒有UVA照射的情況下ROS表達含量為1343.75，而在劑量為10.8 J/cm2的UVA照射下會顯著升高細胞內(nèi)ROS的表達含量（p< 0.01），其ROS含量為2294.25。與此同時，在Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物的作用下能夠顯著降低細胞內(nèi)ROS的表達含量，其隨著濃度的升高，依次降低ROS含量至1906.75、1716.25和1296，其中濃度為20μg/ml的Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物降低作用最強（p< 0.01），可以恢復ROS至正常水平。以上說明Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物可以降低皮膚成纖維細胞中ROS的表達含量從而抗皮膚的衰老。

2.3Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物能夠上調(diào)Collagen I和下調(diào)MMP-1的蛋白表達抗皮膚衰老

為了研究Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物對細胞衰老模型中Collagen I和MMP-1蛋白表達的影響，我們使用Western blotting檢測細胞中的Collagen I和MMP-1表達水平。結(jié)果如圖3所示，正常情況下Collagen I和MMP-1的蛋白水平分別為1.11和0.97，在劑量為10.8 J/cm2的UVA照射后，Collagen I表達含量顯著降低至0.80（p< 0.05）、MMP-1的表達顯著升高至1.44（p< 0.01），而Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物可以逆轉(zhuǎn)Collagen I表達下調(diào)和MMP-1表達上調(diào)的作用，其隨著濃度的升高，依次顯著升高Collagen I表達水平至1.05、1.04和1.07，降低MMP-1表達水平至1.09、0.82和0.80，且濃度為20 μg/mL時，即可將Collagen-1和MMP-1表達含量恢復與正常水平相一致（p< 0.01）。說明Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物通過上調(diào)Collagen I和下調(diào)MMP-1的蛋白表達抗皮膚衰老。

3 ?討論

皮膚老化是指皮膚功能衰老性損傷，導致皮膚對機體的防護能力、調(diào)節(jié)能力等減退，不能適應內(nèi)外環(huán)境的變化，以及出現(xiàn)顏色、色澤、形態(tài)、質(zhì)感等外觀整體狀況的改變。皮膚老化是由多種因素引起的，包括體內(nèi)激素失衡和體外環(huán)境過度刺激，其中紫外線輻射主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，紫外線（UVA和UVB）的輻照下可以導致皮膚發(fā)生老化。然而有趣的是，丹參提取物可以抑制UVB輻射誘導細胞老化。兒茶素可以抑制TNF-α誘導的皮膚衰老。另外，芹菜素可抑制UVA介導HaCaT細胞的衰老。一致的，在本研究中發(fā)現(xiàn)Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物可以抑制UVA介導體外皮膚衰老。

綜上所述，Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物能夠抑制UVA輻射引起體外皮膚衰老。由此可以推測Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物可以作為抑制光老化的活性物質(zhì)。本研究僅能說明Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物通過調(diào)節(jié)ROS、MMP-1和Collagen I的表達抑制皮膚衰老，尚不清楚ROS、MMP-1、Collagen I三者之間的具體聯(lián)系以及Growgx酵母發(fā)酵產(chǎn)物提取物可能的其他作用靶點。

參考文獻

[1] Ansary TM， Hossain MR， Kamiya K， et al. Inflammatory Molecules Associated with Ultraviolet Radiation-Mediated Skin Aging[J]. Int J Mol Sci. 2021; 22（8）：3974.

[2]. Shin JW， Kwon SH， Choi JY， et al. Molecular Mechanisms of Dermal Aging and Antiaging Approaches[J]. Int J Mol Sci. 2019; 20（9）：2126.

[3] Zhang S， Duan E. Fighting against Skin Aging： The Way from Bench to Bedside[J]. Cell Transplant. 2018; 27（5）：729-738.

[4] Wang L， Kim HS， Oh JY， et al. Protective effect of diphlorethohydroxycarmalol isolated from Ishige okamurae against UVB-induced damage in vitro in human dermal fibroblasts and in vivo in zebrafish[J]. Food Chem Toxicol. 2020; 136：110963.

[5] Chen J， Li H， Chen J. Human epidermal growth factor coupled to different structural classes of cell penetrating peptides： A comparative study[J]. Int J Biol Macromol. 2017; 105（Pt 1）：336-345.

[6] Huang CY， Lin YT， Kuo HC， et al. Compounds isolated from Eriobotrya deflexa leaves protect against ultraviolet radiation B-induced photoaging in human fibroblasts[J]. J Photochem Photobiol. 2017; 175：244–253.

[7] Xiao X， Huang M， Fan C， et al. DUOX2 participates in skin aging induced by UVB in HSF2 cells by activating NF-κB signaling[J]. Exp Ther Med. 2021; 21（2）：157.

[8] Kim EJ， Kim YK， Kim MK， et al. UV-induced inhibition of adipokine production in subcutaneous fat aggravates dermal matrix degradation in human skin[J]. Sci Rep. 2016; 6：25616.

[9] Lee YH， Seo EK， Lee ST. Skullcapflavone II Inhibits Degradation of Type I Collagen by Suppressing MMP-1 Transcription in Human Skin Fibroblasts[J]. Int J Mol Sci. 2019; 20（11）：2734.

[10] Sun Z， Park SY， Hwang E， et al. Salvianolic Acid B Protects Normal Human Dermal Fibroblasts Against Ultraviolet B Irradiation-Induced Photoaging Through Mitogen-Activated Protein Kinase and Activator Protein-1 Pathways[J]. Photochem Photobiol. 2015; 91（4）：879-86.

[11] Lee S， Yu JS， Phung HM， et al. Potential Anti-Skin Aging Effect of （-）-Catechin Isolated from the Root Bark of Ulmus davidiana var. japonica in Tumor Necrosis Factor-α-Stimulated Normal Human Dermal Fibroblasts[J]. Antioxidants （Basel）. 2020; 9（10）：981.

[12] Kim DH， Auh JH， Oh J， et al. Propolis Suppresses UV-Induced Photoaging in Human Skin through Directly Targeting Phosphoinositide 3-Kinase[J]. Nutrients. 2020; 12（12）：3790.