李靜靜

摘要：目的：探討2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸樣本采集對提取、擴增步驟的具體影響。方法：選取10只陰性咽拭子保存在含有新冠病毒的樣本中，將其按照1：2、1：10的的稀釋方式進行稀釋，后在稀釋樣本中加入新型冠狀病毒培養(yǎng)液，進行觀察檢測。選取三種不同的提取方式和體系針對核酸提取試劑及A-E 5 種模板上樣量和檢測靈敏度不同的擴增試劑分別進行提取和擴增。結(jié)果：選擇同一種模擬混合樣本檢測試劑和核酸的影響作用并不大，混采能夠提升拭子樣本的準確性。結(jié)論：核酸混采對檢測結(jié)果有一定的影響作用，取樣檢測增加的同時對于檢測試劑的添加也應當隨之進行，能夠幫助提升檢測的準確度，降低感染風險的存在。

關(guān)鍵詞：新型冠狀病毒核酸檢測;混采;結(jié)果影響

2020年初爆發(fā)的新型冠狀病毒（2019-nCoV）給全球帶來了不可估計的遭難，是一場全球性的集體性爆發(fā)的災情，世界衛(wèi)生組織（WHO）將將新冠肺炎疫情認定為構(gòu)成國際公共衛(wèi)生緊急事件。據(jù)新冠疫情爆發(fā)至今，世界累計死亡人數(shù)已經(jīng)超過400萬，現(xiàn)存確診人數(shù)已經(jīng)超過2400萬以上，給世界公共衛(wèi)生帶來的危害和損失是無法估計的。面對此次巨大的確認和感染人數(shù)，快速的進行檢測和確診是當前唯一一個能夠快速緩解傳染速度的一個重要措施，而核酸檢測在檢測和預防的過程中起到的作用非常之大，在確定傳染源、切斷傳播途徑和保護易感人群方面發(fā)揮了重要作用。

但是由于新型冠狀病毒的傳染速度極快，容易感染的人數(shù)可能在一天之內(nèi)快速蔓延，因此，需要提升檢測速度和檢測質(zhì)量，幫助快速查找感染人群，進行幾種隔離治療。對此，我國衛(wèi)生健康委于2020年8月出臺了“新冠病毒核酸10合1混采檢測技術(shù)規(guī)范” ，指將采集自10人的10支拭子集合于1個采集管中進行核酸檢測的方法進行檢測實驗。并且在我國多個高風險地區(qū)已經(jīng)使用該方式對高危人員進行實際篩查和檢測。在一些歐美和中東國家實驗也取得了相應的成效。新型冠狀病毒核酸混采能夠幫助快速的提升檢測的速度，加快醫(yī)務人員的工作效率，但是檢測結(jié)果的影響還有待考察。

為有效判斷和檢測新型冠狀病毒對檢測結(jié)果的影響，本實驗將會采取10只陰性咽拭子保存在含有新冠病毒的樣本，按照1：2、1：10的的稀釋方式進行稀釋，后在稀釋樣本中加入新型冠狀病毒培養(yǎng)液，進行觀察檢測的方式進行檢測，探討不同檢測系統(tǒng)核算靈敏度的影響作用。

一、材料與方法

1.1材料

1.1.1滅活病毒培養(yǎng)液：新型冠狀病毒（2019-nCoV）培養(yǎng)液，由我市某科學研究院提供，該培養(yǎng)液已經(jīng)經(jīng)過 65 ℃ 熱滅活 30 min 處理， 儲存于-20 ℃，-20 ℃溫度下的2019-nCoV可以用于長期保存。

1.1.2試劑：檢測實驗所采用的核酸提取方式主要是A、B、C種試劑進行，5 種 2019-nCoV核酸檢測試劑。

1.1.3儀器：檢測儀器選擇美國 企業(yè)生產(chǎn)的 QX200 數(shù)字 PCR 儀、Pre?NAT Ⅱ自動核酸純化儀、擴增儀ABI 7500、國產(chǎn)SLAN熒光定量PCR儀、DNA濃度測定儀為 Merinton微量分光光度計SMA6000，這些儀器的使用能夠準確、靈敏的優(yōu)化檢測結(jié)果，簡便工作流程，同時檢測數(shù)量也能同時進行高達96個樣品檢測。

二、方法

2.1滅活病毒培養(yǎng)液定量檢測：選擇自動核酸純化儀對病毒進行處理，使用中國疾病預防控制中心發(fā)布的針對2019?nCoV基因組 N 和 ORF1ab 區(qū)域的引物和探針進行數(shù)字 PCR。熱循環(huán)條件如下：50 ℃60 min; 95℃10 min;94 ℃30 s循環(huán)40次，58 ℃ 45 s，98 ℃ 10 min。

2.2混采對檢測結(jié)果的影響論證：在以上所使用的儀器當中加入滅活病毒，為了使得檢測的結(jié)果更具對比性，需要添加10份健康實驗者的咽拭子樣本進行對比，將其放入采集管當中，均勻搖晃使其混合，以此來獲得樣本。再將滅活病毒進行1：2和1：10的比例進行混合，以此獲得被檢測樣本。根據(jù)規(guī)定的定量結(jié)果將得到的滅活病毒進行稀釋，再用提取劑對其進行樣本提取，提取的結(jié)果進行三次以上的實驗論證，最終得出結(jié)論。

2.3混采對擴增影響的驗證：在實驗采集管中加入6mlVTM，再添加10份健康實驗者的咽拭子樣本進行充分融合，以此作為陰性拭子的檢測樣本。將滅活病毒培養(yǎng)液使用 VTM 稀釋至終濃度為5000 和 1000 拷貝/ml。使用核酸試劑盒分別提取核酸和病毒核酸，使其變成等量體積。針對不同試劑盒當中的試劑檢測混合物進行混合，比較混采樣本中不同數(shù)量拭子的核酸對檢測試劑所產(chǎn)生的影響，以上步驟可以重復3次以上，使得檢驗的結(jié)果更加準確。

2.4改進提取方法提高混采樣本檢測靈敏度的驗證：按照模擬混采樣本制備的流程圖進行混合溶液稀釋進行處理，提取產(chǎn)物等體積混合與擴增，核酸檢測試劑盒中的樣本檢測同樣需要檢測3次，檢測混采樣本的準確度。

三、統(tǒng)計學分析

采用 Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理 ， 采用 SPSS20.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料以 xˉ ± s 表示。最終統(tǒng)計學結(jié)果顯示， P<0.05 有統(tǒng)計學意義。

四、結(jié)果

一、混采對檢測結(jié)果的影響

1.不同提取試劑的提取效率比較：稀釋濃度為5000 和 1000 拷貝/ml的滅活病毒培養(yǎng)液選取不同的試劑對其進行混采和提取，根據(jù)檢測的數(shù)值得出試劑A的檢測結(jié)果明顯高出B和C的檢測結(jié)果。

2.混采對提取效率的影響：通過檢測的10份健康實驗者的咽拭子和新冠病毒核酸混采的樣本提取得知，混采對提取效率有一定的影響，會抑制試劑對病毒核酸的提取效率。

二、混采對擴增的影響

1.混采樣本中人基因組 DNA濃度的檢測：檢測所使用的陰性拭子中核酸濃度會隨著提取試劑有一定的變化，基因組DNA濃度為核酸濃度的十分之一左右。

2.混采樣本中人基因組DNA對A、B試劑擴增結(jié)果的影響：將試劑與核酸混合時，并和核酸的濃度會隨著拭子核酸的濃度增加而增加，不同組別之間拭子組間比較差異無統(tǒng)計學意義。由此可以得出混采樣本中人基因組DNA對試劑擴增無影響。表1為A、B試劑不同濃度擴增結(jié)果Ct值分析

討論

當前針對核酸檢測主要是采取兩種方式，一種是直接將采集的拭子成分充分融合到同一個檢測試管當中，這種檢測方式屬于混采模式，另外一種檢測方式是針對不同的被檢測者，進行單份檢測，再將多份樣本進行混合， 即混檢模式。這兩種檢測方式的最終目的都是幫助提升檢測的效率，并且得出的結(jié)果都是較為準確的。但是第二種混檢方式在實際操作過程中，會受到檢測樣本數(shù)量的增多而降低檢測的準確度。因此，當前醫(yī)學檢測公認的最具檢測有效度的檢測方式為混采模式，不僅保證了檢測的準確性同時還能提升檢測的效率。

參考文獻

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