楊倩，劉建梅，丁潔，陳麗紅

1. 南京財經大學食品科學與工程學院，南京 210023 2. 江蘇雅信昆成檢測科技有限公司，南京 210034 3. 南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 210023

雙酚A(bisphenol A, BPA)廣泛用于食品包裝材料、奶瓶、水杯以及其他數(shù)百種日用品的制造過程[1]。作為一種典型的內分泌干擾物，全球許多國家和地區(qū)都出臺了法律法規(guī)限制雙酚A的使用。為了應對管控措施和市場需求，一些結構與BPA類似、可耐受較高溫度的化合物被開發(fā)用來替代BPA，這些化合物具有2個羥苯基結構，在羥苯基和碳橋具有不同的取代基，統(tǒng)稱為雙酚A類似物，其中，雙酚F(bisphenol F, BPF)在食品和環(huán)境樣品中均是僅次于BPA的檢出量最大的雙酚A類似物[2-3]。BPF(系統(tǒng)名4,4二羥基二苯基甲烷，英文名為4,4’-dihydroxydiphenylmethane)和BPA的結構式如圖1所示。對日本、韓國和中國采集的河水和海水中，BPF在幾個采樣點的濃度甚至超過1 000 ng·L-1，而在日本東京的Tamagawa河水中，BPF濃度高達2 850 ng·L-1，已經超過了歐盟規(guī)定BPA對水生生物的預測無效應濃度(1 500 ng·L-1)[4]。隨著BPF使用量的逐年增加，其污染情況可能會日益嚴重。

圖1 雙酚A(BPA)和雙酚F(BPF)的分子結構圖Fig. 1 Chemical structures for bisphenol A (BPA) and bisphenol F (BPF)

由于BPF的結構與BPA類似，預計可能對生物系統(tǒng)產生同樣的毒性效應。一些體內外實驗結果表明，BPF具有與BPA相似的雌激素效應。Kitamura等[5]采用MCF-7細胞的熒光素酶報告基因法檢測發(fā)現(xiàn)，BPF的雌激素活性與BPA處于同一數(shù)量級。在H295類固醇生成試驗中，BPF能夠引起孕激素和雌激素水平的升高，以及雄激素水平的下降[6]。對斑馬魚模式生物的研究發(fā)現(xiàn)，對斑馬魚進行60 d的BPF長期暴露能夠導致斑馬魚性激素水平紊亂，性別比例向雌魚偏離[7]。Ullah等[8]的研究表明，BPF具有抗雄激素效應，能夠導致氧化應激損傷，進而影響大鼠的生殖功能。化合物的內分泌干擾效應會對生物體正常的內分泌活動產生干擾。生物體的內分泌系統(tǒng)主要由下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸、下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸和下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸分別控制，這些系統(tǒng)通過調節(jié)激素的合成、分泌、貯存、轉運和代謝過程來調控內分泌系統(tǒng)，每個內分泌軸與其他內分泌軸相互作用，以協(xié)調身體機能[9]。內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)進入生物體內后導致的HPT、HPG和HPA軸的改變，可能會對整個生物體的發(fā)育和繁殖機能產生影響。一些研究表明，HPT、HPG和HPA軸間具有交互作用，例如性激素能夠通過應激反應，直接或間接調節(jié)HPA軸的功能，影響腎上腺皮質激素、糖皮質激素和促皮質醇釋放激素(CRH)等的合成和釋放[10-13]，而CRH又是連接HPT和HPA軸的關鍵蛋白之一，并且在魚類中，CRH比促甲狀腺激素釋放激素(thyrotropin-releasing hormone, TRH)能夠更有效地調節(jié)HPT軸的功能[12,14]。此外，HPT和HPG軸間也具有交互作用，甲狀腺激素水平可能在正常生殖、性類固醇水平和相關酶的基因表達中發(fā)揮關鍵作用[12-16]，例如，Zhu等[17]發(fā)現(xiàn)甲狀腺素(thyroxine, T4)可以促進鯰魚卵泡的生長，而噻蟲嗪降低了稀有鮈鯽體內的T4水平，同時抑制了性腺的發(fā)育[18]。

斑馬魚(Daniorerio)的基因與人類基因相似度達到87%，在關鍵性的蛋白靶點區(qū)域相似性接近100%，另外，斑馬魚內分泌系統(tǒng)分子性質和激素信號通路與其他脊椎動物類似，因此，斑馬魚可以作為模式生物用于內分泌干擾的機理研究[19-20]。目前針對BPF的研究多集中在雌激素效應方面，缺少BPF對HPT、HPG和HPA軸的影響及其交互作用研究。因此本文以斑馬魚為研究模型，通過對HPT、HPG和HPA軸激素以及相關基因表達水平的測定，研究BPF對胚胎和仔魚期斑馬魚內分泌系統(tǒng)的影響及作用機制，以期為BPF潛在的健康風險評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

雙酚F，CAS號620-92-8，純度>98%，購于美國J&K公司；用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)處理過并經高溫高壓滅菌的超純水(DEPC水)，購于中國上海杰瑞生物工程有限公司；雌二醇酶聯(lián)免疫試劑盒、睪酮酶聯(lián)免疫試劑盒、糖皮質激素酶聯(lián)免疫試劑盒、三碘甲狀腺原氨酸酶聯(lián)免疫試劑盒及四碘甲狀腺原氨酸酶聯(lián)免疫試劑盒(96T)，購于中國武漢艾博伊科技有限公司；RNA Later，化學純，購于美國賽默飛世爾科技公司；Trizol試劑購于美國英杰生命技術有限公司；ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒(200次)，購于東洋紡(上海)生物科技有限公司；Sso fast EvaGreen Supermix購于美國伯樂公司；甲醇、乙醇、乙腈均為色譜純，購于德國Merck公司；水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設備

顯微鏡(DM2500型，德國Leica)、冷凍離心機(2-16PK型，美國Sigma公司)、生態(tài)培養(yǎng)箱(CLIMACELL型，德國MMM公司)、高效液相色譜串聯(lián)質譜儀(LC-Agilent Technologies 1290 Infinity，MS-AB SCIEX QTRAP 4500)、熒光定量PCR儀(CFX96TMOptics型，美國Bio-Rad公司)、酶標儀(Infinite M200型，瑞士TECAN公司)、核酸蛋白分析儀(DU800SERIES型，美國Sigma公司)、多功能水質參數(shù)測定儀(HQ40d型，美國HACH公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(INNOVA?43型，中國鄭州南北儀器設備有限公司)、旋轉蒸發(fā)儀(R-210型、B-491型、V-850型，瑞士BUCHI公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 斑馬魚馴化和胚胎收集

四月齡野生成年斑馬魚(AB型)購于中國科學院武漢水生生物研究所，并在實驗室斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖并繁殖了3代以上。系統(tǒng)運行期間，光照/黑暗周期設定為16 h∶8 h(光照∶黑暗)，維持溫度在26 ℃±1 ℃，每天定時投喂豐年蝦2次。

前1天晚上將3條雌性斑馬魚和3條雄性斑馬魚放置于每個孵化盒中，孵化盒中間用自帶的隔板將雌雄魚隔開，防止提前產卵。孵化盒底部具有篩板，可以將成魚與缸底隔開，防止成魚吞食魚卵。第2天早上開燈時將隔板抽出，讓雌魚和雄魚在光照刺激下交配產卵。1 h后收集孵化盒底部的胚胎，用清水清洗2遍，在體式顯微鏡下觀察，去除死卵和未受精的卵，收集質量高的胚胎，置于26 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中待用。在斑馬魚胚胎受精后2～4 h并處于囊胚期時進行暴露實驗。

1.3.2 暴露實驗

使用前將BPF用二甲基亞砜(DMSO)配制成10 000 mg·L-1的貯備液，儲存于4 ℃，實驗中所用相應濃度的暴露液用斑馬魚養(yǎng)殖水稀釋，保證暴露液中的DMSO含量不超過溶液體積的0.01%(V/V)。

根據(jù)BPF對水環(huán)境的污染狀況，以及BPF對斑馬魚成魚及胚胎的96 h半數(shù)致死效應濃度(LC50)(分別為9.51 mg·L-1和7.5 mg·L-1)[21]，取其1/10作為最高濃度組來研究BPF潛在的毒性效應，濃度分別設置為1、10、100和1 000 μg·L-1，同時設置空白對照組，暴露容器為1 000 mL小燒杯，加入500 mL暴露溶液，每個濃度設置3個平行，每個平行隨機放置200粒發(fā)育正常且處于囊胚期的受精卵，用保鮮膜覆蓋在燒杯口處以防止溶液揮發(fā)。暴露144 h期間，所有的小燒杯置于生態(tài)培養(yǎng)箱中，設置生態(tài)培養(yǎng)箱溫度為26 ℃，光照周期為16 h∶8 h(光照∶黑暗)，光照強度50 lux。每日及時清除死亡胚胎，以免污染到其他胚胎或仔魚。試驗期間每24 h更換暴露溶液，并清洗容器。在暴露的不同階段，隨機選取20條魚，在顯微鏡下觀察(×20倍)，統(tǒng)計畸形發(fā)育情況并拍照。

1.3.3 暴露溶液中BPF的化學分析

為了確定暴露溶液中BPF的實際濃度，采用液相色譜串聯(lián)質譜儀對各個暴露組進行分析。由于每天更換暴露液，因此所有暴露組都只在暴露第1天溶液配制好后(0 h)和換水前(24 h)這2個時間點收集，以表征暴露溶液在試驗期間的變化情況。

水樣的處理和凈化方法、液相色譜條件和質譜條件見Yang等[7]的研究。

1.3.4 激素水平分析

暴露結束后，在每個平行中隨機挑選出100條仔魚置于-80 ℃保存，用于激素水平的測定。激素測定的具體的方法為：將仔魚稱重，加入4倍體積預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)，緩沖液中加入1 μg·L-1蛋白酶抑制劑。用勻漿器將斑馬魚仔魚進行全組織充分勻漿后，12 000×g，4 ℃離心20 min，收集上清液并分裝，置于-80 ℃保存直至采用酶聯(lián)免疫吸附法進行17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)、睪酮(testosterone, T)、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine, T3)、T4和類固醇皮質醇(cortisol, C)這5種激素的測定。使用魚類E2、T、T3、T4和C試劑盒(中國武漢艾博伊科技有限公司)進行分析時，嚴格按照試劑盒的說明書進行操作，用酶標儀進行測定。

1.3.5 基因轉錄水平分析

在暴露至受精后144 h，每個平行隨機挑選取20條仔魚，置于RNAlater中，保存于-20 ℃冰箱，用于基因轉錄水平的分析。采用Trizol試劑，嚴格按照說明書的要求提取總RNA，獲得的RNA溶液分裝后置于-80 ℃冰箱待用，以瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA的質量。用核酸蛋白測定儀測定RNA樣品在260 nm的吸光值，計算總RNA的濃度。同時根據(jù)總RNA的A260/A280的比值來確定總RNA的純度。采用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒對所提取的RNA進行反轉錄，合成cDNA。所合成的cDNA樣品保存于-20 ℃，進行熒光定量PCR時，作為模板直接或稀釋后添加。

實時熒光定量PCR反應在BIO-RAD公司的CFX96TMOptics儀器上進行，根據(jù)SYBR Green PCR kit說明書操作。實驗中所采用的目標基因和管家基因相關引物信息如表1所示。引物信息根據(jù)引物設計標準，用Primer Premier 5.0軟件設計。

表1 下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸、下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸和下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸相關基因的引物序列信息Table 1 Primers for genes related to hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis, hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

由于所測定的不同激素濃度水平差別較大、單位不同，因此ELISA的數(shù)據(jù)采用相對于空白對照組的變化倍數(shù)來表示。激素水平的改變倍數(shù)為BPF處理組相對于空白對照組改變的倍數(shù)；實時熒光定量PCR的調控倍數(shù)是以管家基因β-actin作為內參基因，以空白對照組進行標準化，采用2-△△CT方法計算所得[22]。采用IBM SPSS 9進行統(tǒng)計學分析。基因轉錄水平在暴露組和空白對照組之間的差異性運用單因素方差分析。當P<0.05表示暴露組與對照組之間具有顯著性差異。

2 結果(Results)

2.1 暴露溶液中BPF的實際濃度分析

在暴露期間，空白對照中的BPF濃度低于檢出限；BPF在試驗開始時(0 h)和換水前(24 h)的實測濃度均無較大差異，并且所有實測濃度都非常接近所設置的名義濃度(表2)，這說明BPF在胚胎暴露實驗中濃度保持相對穩(wěn)定。為了方便敘述，所有暴露濃度均以所設置的名義濃度來表示。

表2 暴露過程中BPF的名義濃度和實測濃度Table 2 The nominal and measured concentrations of BPF

2.2 BPF對斑馬魚早期胚胎發(fā)育的影響

BPF暴露對斑馬魚胚胎的孵化率、存活率和畸形率的影響如表3所示。與空白對照組相比，100 μg·L-1和1 000 μg·L-1BPF暴露顯著降低了胚胎的孵化率和存活率，而1 000 μg·L-1的BPF暴露使斑馬魚胚胎/仔魚的畸形率顯著升高。BPF導致的斑馬魚發(fā)育異常情況主要包括發(fā)育延遲、卵凝結、心包水腫和脊柱彎曲等情況(圖2)。之前的研究報道表明，多種雙酚A類化合物，如BPA、BPAF、四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)和四氯雙酚A(tetrachlorobisphenol A, TCBPA)，均會對斑馬魚胚胎/仔魚產生類似的發(fā)育損傷[23-25]。

圖2 BPF暴露下斑馬魚胚胎/仔魚在不同發(fā)育階段的發(fā)育損傷注：所有圖片均放大20倍；(a)正常發(fā)育胚胎(空白對照組，受精后48 h)；(b)正常發(fā)育胚胎(空白對照組，受精后96 h)；(c)正常 發(fā)育胚胎(空白對照組，受精后120 h)；(d)心包水腫胚胎(10 μg·L-1 BPF，受精后48 h)；(e)脊柱彎曲仔魚(100 μg·L-1 BPF， 受精后96 h)；(f)心包水腫仔魚(100 μg·L-1 BPF，受精后120 h)；(g)心包水腫胚胎(1 000 μg·L-1 BPF，受精后48 h)； (h)心包水腫仔魚(1 000 μg·L-1 BPF，受精后96 h)；(i)脊柱彎曲仔魚(1 000 μg·L-1 BPF，受精后120 h)。Fig. 2 Developmental toxicity of BPF on zebrafish embryos/larvae during the exposure periodNote: All images are shown at ×20; (a) Normal development of embryos (control group, 48 hpf); (b) Normal development of larvae (control group, 96 hpf); (c) Normal development of larvae (control group, 120 hpf); (d) Edematous development of embryos (10 μg·L-1 BPF, 48 hpf); (e) Larvae with a malformed trunk (100 μg·L-1 BPF, 96 hpf); (f) Edematous development of larvae (100 μg·L-1 BPF, 120 hpf); (g) Edematous development of embryos (1 000 μg·L-1 BPF, 48 hpf); (h) Edematous development of larvae (1 000 μg·L-1 BPF, 96 hpf); (i) Larvae with a malformed trunk (1 000 μg·L-1 BPF, 120 hpf).

表3 BPF暴露144 h對斑馬魚孵化率、存活率和畸形率的影響Table 3 Hatching rates, survival rates and malformation rates of zebrafish after BPF exposure for 144 h

2.3 BPF暴露對激素水平的影響

斑馬魚胚胎/仔魚暴露于不同濃度的BPF中至受精后144 h，對甲狀腺激素、性激素和腎上腺糖皮質激素的影響如圖3所示。其中，100 μg·L-1和1 000 μg·L-1的BPF導致T4水平分別為對照組的0.68倍和0.43倍，呈顯著降低趨勢；而T3的水平顯著升高，分別是對照組的1.46倍和1.78倍。10、100和1 000 μg·L-1的BPF暴露組的性激素E2水平分別為對照組的1.37倍、1.57倍和1.82倍，顯著高于對照組；而T的水平分別為對照組的0.71倍、0.62倍和0.51倍，呈顯著降低的趨勢；在100 μg·L-1和1 000 μg·L-1濃度下，C水平也顯著性降低，分別為對照組的0.68倍和0.57倍。

圖3 BPF暴露對斑馬魚胚胎/仔魚的HPT、HPG和 HPA軸相關激素水平的影響注：T4表示甲狀腺素，T3表示三碘甲狀腺原氨酸，E2表示17β- 雌二醇，T表示睪酮，C表示類固醇皮質醇；結果以3次重復的平均 值±SD表示，*表示暴露組與對照組之間具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 3 Effects of BPF on hormone levels of HPT, HPG and HPA axes in zebrafish embryos/larvaeNote: T4 stands for thyroxine; T3 stands for triiodothyronine; E2 stands for 17β-estradiol; T stands for testosterone, C stands for cortisol; the results are shown as mean±SD of three replicates; asterisk indicates significant difference from control (P<0.05).

2.4 BPF暴露對斑馬魚胚胎/仔魚HPT、HPG和HPA軸相關基因表達的影響

魚類的甲狀腺激素、性激素和皮質醇激素主要是通過內分泌系統(tǒng)HPT、HPG和HPA軸控制的，通過內分泌軸上一系列基因的調節(jié)來維持激素的合成和平衡，而激素水平通過正、負反饋調節(jié)內分泌軸上各部分的功能，從而完成整個生長發(fā)育和繁殖過程。因此通過檢測HPT、HPG和HPA軸上的基因表達水平，可以進一步揭示BPF的內分泌干擾效應及其作用機制。

與空白對照組相比，BPF所有處理組(1、10、100和1 000 μg·L-1)分別導致HPT軸thrα和trhr1基因表達水平的顯著上調(分別上調1.61倍、1.78倍、1.99倍、1.93倍和1.65倍、2.76倍、2.20倍、1.66倍)；10 μg·L-1以上濃度組的BPF使trh的表達水平顯著降低，分別為空白對照組的0.35倍、0.32倍和0.09倍；在100 μg·L-1和1 000 μg·L-1BPF暴露下，tshβ的表達水平顯著上調至1.83倍和1.87倍，tshr顯著上調至2.26倍和4.29倍，dio1顯著上調至1.45倍和2.07倍，dio2的基因表達水平顯著性上調至2.48倍和2.79倍，而nis的轉錄水平顯著性下調至對照組的0.52倍和0.37倍(圖4(a))。

與空白對照組相比，暴露于10 μg·L-1以上濃度的BPF時，HPG軸基因cyp19a1b、fshβ、fshr和lhβ的水平顯著性上調，其中在10 μg·L-1時，分別上升至對照組的2.62倍、1.79倍、1.56倍和1.52倍；100 μg·L-1和1 000 μg·L-1濃度暴露后，erα的基因表達水平分別上升至1.37倍和1.64倍、gnrh2上調至1.87倍和1.56倍、gnrh3上升至1.52倍和1.83倍、cyp11a上升至1.92倍和1.62倍、cyp19a1a上升至1.66倍和1.88倍、lhr的基因表達水平上調至1.48倍和1.68倍；而cyp17的表達水平分別下調至0.72倍和0.52倍；只有1 000 μg·L-1的BPF暴露使gnrhr2的表達水平顯著性升高(為空白對照組的1.79倍)，17βhsd的表達水平顯著下調(為空白對照組的0.65倍)(圖4(b))。

BPF暴露后，4個濃度組(1、10、100和1 000 μg·L-1)均使HPA軸crh和mc2r的基因表達水平顯著上調(分別上調1.98倍、2.86倍、4.71倍、6.92倍和1.71倍、1.85倍、1.56倍、2.14倍)；10 μg·L-1以上濃度的BPF導致pomc基因表達水平分別上調2.04倍、2.38倍和1.96倍，與對照組具有顯著性差異；100 μg·L-1和1 000 μg·L-1濃度組顯著提高了mr的表達水平，分別為空白對照組的1.85倍和2.83倍(圖4(c))。

圖4 BPF暴露對斑馬魚胚胎/仔魚HPT、HPG和HPA軸相關基因表達水平的影響注：(a) HPT軸；(b) HPG軸；(c) HPA軸；結果以3次重復的平均值±SD表示，*表示暴露組與對照組之間具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 4 Gene expression of the HPT, HPG and HPA axes in zebrafish embryos/larvae exposed to BPFNote: (a) HPT axis; (b) HPG axis; (c) HPA axis; the results are shown as mean±SD of three replicates; asterisk indicates significant difference from control (P<0.05).

3 討論(Discussion)

BPF對斑馬魚HPT、HPG和HPA軸的影響及其交互作用如圖5和圖6所示。魚類甲狀腺濾泡主要分泌甲狀腺激素T4以及少量的T3。T4與血液中的運載蛋白結合后，脫去一個碘原子，轉化為T3。在魚類的早期生命階段，甲狀腺系統(tǒng)在其正常的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的調控作用。一些化合物能夠通過干擾甲狀腺激素的合成、轉運和代謝等過程，引起甲狀腺激素水平的紊亂，進而影響生物體的生長、發(fā)育和繁殖等生理過程。本研究中，BPF對斑馬魚胚胎暴露至受精后144 h，低濃度組并未對甲狀腺激素產生影響，但是2個高濃度組均使仔魚體內T3水平顯著升高，T4水平顯著降低，說明BPF能影響斑馬魚甲狀腺激素的水平，具有甲狀腺系統(tǒng)內分泌干擾效應。

圖5 BPF暴露對斑馬魚HPT、HPG和HPA軸的影響注：(a)HPT軸；(b)HPG軸；(c)HPA軸；TSH表示促甲狀腺激素，TPO表示甲狀腺過氧化物酶，F(xiàn)SH表示促卵泡激素， LH表示促黃體激素，ACTH表示促腎上腺皮質激素，HDL表示高密度脂蛋白，LDL表示低密度脂蛋白。Fig. 5 Proposed toxicity pathways along HPT, HPG and HPA axes for zebrafish exposed to BPFNote: (a) HPT axis; (b) HPG axis; (c) HPA axis; TSH stands for thyroid stimulating hormone; TPO stands for thyroid peroxidase; FSH stands for follicle-stimulating hormone; LH stands for luteinizing hormone; ACTH stands for adrenocorticotropic hormone; HDL stands for high density lipoprotein; LDL stands for low density lipoprotein.

性激素包括雌激素和雄激素，可以促進性器官和第二性征的發(fā)育，并維持其功能。雌二醇是硬骨魚體內含量最高的雌激素，而睪酮是含量最高也是最重要的雄激素，測定魚類體內性激素水平的變化情況可以用來篩選環(huán)境內分泌干擾物[26]。在本研究中，暴露于10、100和1 000 μg·L-1的BPF均導致仔魚體內睪酮水平的顯著性下調，以及雌二醇水平的顯著性上調。當雄激素水平降低，雌激素水平升高時，魚類雄性特征的發(fā)育和維持將會受到影響，因此BPF對斑馬魚胚胎/仔魚都具有一定的雌激素效應。

研究發(fā)現(xiàn)，當魚類長時間暴露于環(huán)境中污染物時，將導致HPA軸受損，腎間腺“疲憊”，皮質醇水平降低[27]。本研究中，100 μg·L-1和1 000 μg·L-1的BPF導致類固醇皮質醇水平的降低，與其他學者的研究結果一致。

甲狀腺激素水平受HPT軸的調控，內分泌干擾物可以通過作用于HPT軸，干擾HPT軸作用位點，破壞甲狀腺激素平衡，從而對生長發(fā)育造成一系列的危害。TRH和促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone, TSH)的分泌在魚類HPT軸上的調節(jié)作用會因為循環(huán)系統(tǒng)中的甲狀腺激素水平發(fā)生變化而變化，因此可以通過檢測促甲狀腺激素tshβ基因轉錄水平的變化來評估環(huán)境化合物是否會引起甲狀腺功能紊亂，進而闡明化合物擾亂甲狀腺功能的作用機制。已有的研究報道證明，在魚類中T3和T4能夠通過負反饋機制調節(jié)tshβ的基因表達[27-32]。在本研究中，BPF暴露后，tshβ和受體tshr的轉錄水平均顯著性提高，可能是由于T4水平的降低而引起的反饋調節(jié)機制所導致的。在BPF暴露后的仔魚中，trh基因的表達受到了抑制，與tshβ基因上調的變化相反，可能的原因是促甲狀腺激素釋放激素除了能夠調控甲狀腺軸外，還可以促進垂體分泌α-促黑激素[33]，以及調控攝食等[34]。因此，本文BPF使trh基因的轉錄水平下調，可能并不只是其對HPT軸的影響所致。鈉/碘轉運體蛋白(Na+/I-symporter, NIS)將碘從血液中運輸?shù)郊谞钕贋V泡細胞，是甲狀腺激素合成的第一步[35]。甲狀腺球蛋白(thyroglobulin, Tg)是甲狀腺激素的前體蛋白，被甲狀腺用于合成甲狀腺激素T3和T4[36]。因此nis和tg基因轉錄水平的變化可能對甲狀腺激素的濃度有影響。脫碘酶(DIO)的主要功能是將T4轉換成T3。斑馬魚體內有2種類型的脫碘酶，DIO1和DIO2。BPF對斑馬魚胚胎/仔魚暴露144 h后，nis基因的表達水平顯著性下調，可能導致T4的合成受阻，而dio1和dio2的表達水平均顯著升高，導致T4向T3的轉化速率加快，這可能是T4水平下降、而T3水平升高的原因。有研究將脫碘酶基因表達水平的高低作為評價甲狀腺干擾的標志物[37]，這進一步證明了BPF對斑馬魚胚胎/仔魚具有甲狀腺激素干擾效應。甲狀腺激素通過與受體結合起作用。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)T3濃度水平的升高會引起甲狀腺激素受體基因表達的上調，并影響到甲狀腺軸上其他基因的轉錄水平。BPF暴露誘導了thrα表達水平的上調，thrβ基因轉錄水平卻均未發(fā)生明顯的變化。Thrα和thrβ結構的異常可能會導致甲狀腺激素不能與受體結合和激活相應的受體后的級聯(lián)反應的發(fā)生，已有的一些研究也報道了斑馬魚仔魚經化學品暴露后thrα和thrβ的變化不一致的現(xiàn)象[28-29]，因此推測thrα和thrβ可能作用于不同的功能區(qū)，對甲狀腺激素的生理功能具有不同的作用。

性激素的水平主要受HPG的調控，通過HPG軸上一系列基因的調節(jié)來維持性激素的合成和平衡，從而完成整個生殖過程。斑馬魚胚胎暴露于BPF之后，導致斑馬魚下丘腦和垂體中gnrh和gnrhr、促性腺激素fshβ、lhβ以及受體fshr和lhr基因表達水平顯著性提高，這可能會促進類固醇激素的合成和分泌。促卵泡激素(follicle stimulating hormone, FSH)、促黃體激素(luteinizing hormone, LH)的濃度與甲狀腺激素的濃度呈負相關[12]，本文觀察到的促性腺激素及其受體的基因表達水平升高也可能是由降低的T4水平引起的，以促進類固醇激素的生成。P450是將雄激素催化轉化為雌激素的關鍵限速酶，對性激素的平衡起到至關重要的作用。CYP17在類固醇激素合成過程中，可以將孕酮催化轉化為17-羥孕酮，然后進一步催化轉化為雄烯二酮，接著在17β-HSD的催化下轉化為高生物活性的睪酮[38-39]。BPF對斑馬魚胚胎/仔魚暴露144 h能誘導cyp19a1a和cyp19a1b基因表達水平的上調，致使睪酮向雌二醇的轉化速率加快，從而導致斑馬魚體內的睪酮水平的下降及雌二醇水平的升高。而cyp17、17βhsd和3βhsd轉錄水平的降低，將會抑制孕酮向雄激素的轉化，并將進一步導致雄激素水平的降低。雌激素的信號通路是由雌激素受體介導的，在本文的研究中，暴露于BPF導致了雌激素受體erα基因轉錄水平的顯著上調，而對er2β沒有顯著的影響。體外實驗發(fā)現(xiàn)，BPF可以與雌激素受體結合，表現(xiàn)出類雌激素效應[40-41]，因此，我們推測BPF通過與erα結合而發(fā)揮雌激素效應的。一些研究表明，HPT軸和HPG軸間具有交互作用，甲狀腺激素水平可能會影響生殖、性激素水平和相關酶的基因表達。在本研究中，我們觀察到BPF對HPT的激素水平和相關基因的表達水平都產生了影響，而HPG軸也受到了直接或間接的影響。Roy等[42]的研究表明，GnRH能夠促進T4的分泌，在本研究中，我們觀察到T4的水平降低，而gnrh的表達水平升高，可能是gnrh的反饋調節(jié)機制導致的，以促進T4的分泌，調節(jié)激素的平衡。

斑馬魚HPA軸的能夠調節(jié)外界壓力引起的生理生化反應，皮質醇通過與其受體結合調節(jié)外界壓力引起的生理生化反應，從而調節(jié)和維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定[43]。有研究表明，HPA軸和HPG軸間具有交互作用，E2會影響促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)和促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotrophin releasing hormone, CRH)的合成，從而影響類固醇皮質醇的分泌和合成[12]。本研究中crh、crhr、pomc、mr和mc2r表達水平的上調可能與E2濃度的升高相關。而cyp17和3βhsd基因表達水平的下調可能直接導致了類固醇皮質醇水平的降低。此外，一些研究表明，HPT軸和HPA軸也具有交互作用，CRH既可以參與HPA軸的調控，也可以參與HPT軸和HPG軸的調控[14]。下丘腦分泌的CRH可以刺激垂體分泌TSH，而當甲狀腺激素分泌過多時，甲狀腺激素又會通過反饋調節(jié)來刺激下丘腦與垂體，抑制下丘腦分泌的CRH與垂體分泌的TSH，從而減少甲狀腺激素的分泌[12]。本研究中觀察到的crh基因的上調能夠促進CRH濃度的升高，進而刺激TSH的分泌，達到調節(jié)甲狀腺激素平衡的作用。

綜上所述，BPF暴露造成了斑馬魚仔魚體內激素水平的紊亂，說明BPF對斑馬魚胚胎具有內分泌干擾效用。通過對斑馬魚HPT、HPG和HPA軸基因表達水平的分析發(fā)現(xiàn)，BPF對3條內分泌軸的基因和激素間存在交互影響作用(圖6)。

圖6 BPF暴露對斑馬魚HPT、HPG和HPA軸間交互作用影響的示意圖注：CRH表示促腎上腺皮質激素釋放激素，GnRH表示促性腺激素釋放激素，TRH表示促甲狀腺激素釋放激素， FSH表示促卵泡激素，TH表示促黃體激素。Fig. 6 Schematic representation of interaction between the HPT, HPA and HPG axes after exposure to BPFNote: CRH stands for corticotropin-releasing hormone; GnRH stands for gonadotropin-releasing hormone; TRH stands for thyrotropic hormone releasing hormone; FSH stands for follicle-stimulating hormone; LH stands for luteinizing hormone.