引發(fā)對自然老化甜菜種子活力及幼苗生理特性的影響

荊文旭, 魏 磊, 萬 雪, 石鑫鑫, 郭 明, 邢旭明, 史樹德

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特 010019)

amylase activity

種子活力是衡量種子品質(zhì)的重要指標(biāo)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中受諸多因素影響，種子貯藏時自然發(fā)生的老化便是其中之一。隨著自然老化時間的延長，種子活力及抗逆性會出現(xiàn)不同程度的下降[1]，因此如何解決自然老化后種子活力下降的問題至關(guān)重要。種子自然老化后，可通過人工輔助修復(fù)對其內(nèi)部進行一系列結(jié)構(gòu)和功能的有效恢復(fù)，從而達到提高種子活力的目的[2]，由Heydecker等[3]首先提出的種子引發(fā)技術(shù)是有效方式之一。該方法利用引發(fā)劑對細(xì)胞膜系統(tǒng)、內(nèi)含物含量、酶活性及代謝產(chǎn)生影響而提高種子活力及其抗逆性。在此階段植物細(xì)胞膜、細(xì)胞器和DNA都能得到充分修復(fù)，呼吸酶類得到充分活化[4]。引發(fā)處理后的種子播種后，會迅速越過萌動階段，達到提高種子活力的目的。

甜菜(BetavulgarisL.)是內(nèi)蒙古地區(qū)特色經(jīng)濟作物之一，在內(nèi)蒙古區(qū)域經(jīng)濟結(jié)構(gòu)優(yōu)化調(diào)整以及中東部冷涼地區(qū)農(nóng)民脫貧致富中占有重要地位[5]。但當(dāng)前甜菜生產(chǎn)上種子嚴(yán)重依賴進口，且不耐貯藏，一般進口種子第二、三年萌發(fā)緩慢且抗逆性弱，種子活力較當(dāng)年下降30%～50%，常給企業(yè)和農(nóng)戶帶來較大的損失，不利于甜菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。種子引發(fā)技術(shù)可以不同程度提高作物和牧草[6]等種子活力、出苗整齊度、幼苗健壯程度以及植株抗逆性，但對于自然老化甜菜種子活力提高的方法研究則未見報道。

本試驗以自然老化的甜菜種子為研究材料，研究經(jīng)不同引發(fā)劑的不同處理后種子活力和幼苗生理指標(biāo)的變化，以期篩選出提高老化甜菜種子活力的最佳引發(fā)劑種類及其處理濃度，為甜菜種質(zhì)資源保存、老化種子的再次利用及老化修復(fù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

以自然條件下保存12年的法飼一號甜菜為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1引發(fā)處理

用不同引發(fā)劑處理老化甜菜種子，每種引發(fā)劑設(shè)置不同濃度，將室溫條件下浸種24 h后的老化甜菜種子，用蒸餾水沖洗數(shù)次后放置烘箱內(nèi)30 ℃烘干至原始重量備用。引發(fā)劑種類分別為H2O(T)、H2O2(H)、PEG-6000(P)、殼聚糖(CH)、CaCl2(Ca)、GA3(G)、AsA(A)，以未經(jīng)任何處理的自然老化甜菜種子為對照(ck),引發(fā)劑濃度與時間設(shè)置如表1所示。

表1 不同引發(fā)劑處理方式

1.2.2發(fā)芽指標(biāo)測定

將處理后的甜菜種子每30粒均勻擺放已提前放置好2層充分濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，3次重復(fù)，培養(yǎng)皿在人工氣候培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)至第7天時結(jié)束，注意培養(yǎng)皿中水分，防止因為水分過多或過少影響種子發(fā)芽。每隔24 h記錄發(fā)芽的種子數(shù)，結(jié)束培養(yǎng)時計算每個培養(yǎng)皿發(fā)芽幼苗的平均長度，計算種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，計算公式如下：

發(fā)芽勢(%)=(第3天正常發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100%[7]；

發(fā)芽率(%)=(第7天正常發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100%[8]；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中：Gt為當(dāng)天發(fā)芽數(shù)；Dt為發(fā)芽日數(shù)[8]；

活力指數(shù)=S×GI[8]，式中：S為幼苗平均長度(mm)；GI為發(fā)芽指數(shù)；

平均發(fā)芽天數(shù)=∑(D×n)/∑n，式中:D為從種子置床起算的天數(shù)；n為相應(yīng)各天的發(fā)芽粒數(shù)。

1.2.3生理指標(biāo)測定

生理指標(biāo)測定分兩部分，一是將處理好的甜菜種子每9粒放置培養(yǎng)缽(d=10 cm)培養(yǎng)，基質(zhì)為甜菜育苗專用營養(yǎng)土，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)至第7天進行生理指標(biāo)的測定。相對電導(dǎo)率采用電解質(zhì)外滲量法[9]測定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[9]測定；可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[9]測定；超氧陰離子(O2·-)含量使用索萊寶試劑盒測定。二是結(jié)合種子活力指標(biāo)篩選出來每個試劑最佳處理，將其浸種過的種子放置培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件同發(fā)芽指標(biāo)測定相同，在萌發(fā)的第2天、第3天、第6天采用DNS法[9]進行測定α-淀粉酶活力、β-淀粉酶活力。

1.3 統(tǒng)計分析

用Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)處理和制圖，采用SPSS 23.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引發(fā)劑對老化甜菜種子活力的影響

由表2可知，引發(fā)劑種類及其濃度的不同，對老化甜菜種子的萌發(fā)指標(biāo)均有不同程度的影響。4種濃度的殼聚糖和GA3均能顯著(p<0.05)提高老化甜菜種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)，同時降低其平均發(fā)芽天數(shù)。純水處理中，以浸種12 h引發(fā)效果最好，發(fā)芽率較ck增加了100%；化學(xué)試劑處理中，分別以0.6% H2O2、25% PEG-6000、1.0%殼聚糖、1.5% CaCl2、250 mg·L-1GA3、100 mg·L-1AsA引發(fā)效果最好，發(fā)芽率較ck分別增加了130.06%、80.02%、520.07%、160.04%、330.06%、119.98%。平均發(fā)芽天數(shù)除H2O2和純水處理較ck無明顯下降外，其他各個處理的平均發(fā)芽天數(shù)均較ck顯著(p<0.05)減少。

表2 不同引發(fā)劑對老化甜菜種子活力的影響

由表3可知，將每種試劑最優(yōu)處理方式比較后發(fā)現(xiàn)，引發(fā)效果最好的處理是1.0%殼聚糖，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力指數(shù)較ck提高了916.19%、520.07%、877.27%，平均發(fā)芽天數(shù)減少了1.39 d，表明該處理可以顯著(p<0.05)提高種子活力，幼苗生長勢較強。其次是250 mg·L-1GA3，在顯著(p<0.05)提高種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)的同時，也顯著(p<0.05)減少平均發(fā)芽天數(shù)。

表3 各試劑最優(yōu)處理對老化甜菜種子活力的影響

2.2 不同引發(fā)劑對甜菜生理指標(biāo)的影響

2.2.1不同引發(fā)劑對甜菜幼苗MDA含量、相對電導(dǎo)率、O2·-含量的影響

由表4可知，未引發(fā)處理直接播種的老化甜菜種子(ck)MDA含量、O2·-含量及其電導(dǎo)率值均為最大值，經(jīng)不同引發(fā)處理后的老化甜菜種子均得到了不同程度的下降，說明引發(fā)對幼苗細(xì)胞膜系統(tǒng)有一定的修復(fù)作用。在不同時間純水處理中，以浸種12 h引發(fā)處理效果最好，在不同的化學(xué)試劑處理中，分別以0.6% H2O2、25% PEG-6000、1.0%殼聚糖、1.5% CaCl2、250 mg·L-1GA3、100 mg·L-1AsA對細(xì)胞膜系統(tǒng)起到的修復(fù)效果最好。

表4 不同引發(fā)劑對甜菜幼苗MDA含量、相對電導(dǎo)率、O2·-含量的影響

由表5可知，每種試劑最優(yōu)處理對比發(fā)現(xiàn)，各個最優(yōu)處理較ck都起到了顯著(p<0.05)的引發(fā)效果，其中效果最好的是1.0%殼聚糖溶液，MDA含量較ck下降了75.10%，O2·-含量較ck下降了42.29%，電導(dǎo)率較ck下降了46.12%，其次是250 mg·L-1GA3，MDA含量較ck下降了69.95%，O2·-含量較ck下降了38.17%，電導(dǎo)率較ck下降了45.99%。電導(dǎo)率降低表明細(xì)胞膜系統(tǒng)傷害得到修復(fù)或提高了膜系統(tǒng)完整性。

表5 各試劑最優(yōu)處理對甜菜幼苗MDA含量、相對電導(dǎo)率、O2·-含量的影響

2.2.2不同引發(fā)劑對甜菜幼苗可溶性蛋白含量的影響

由圖1可知，經(jīng)不同引發(fā)處理后的幼苗可溶性蛋白含量較ck都有不同程度提高，且處理不同所呈現(xiàn)的效果也不同。其中，以250 mg·L-1GA3處理后可溶性蛋白含量最高，為16.43 mg·g-1，較ck增加了115.90%；其次是1.0%殼聚糖可溶性蛋白含量為14.54 mg·g-1，較ck增加了91.06%。可溶性蛋白質(zhì)含量的提高，表明種子經(jīng)過引發(fā)后，幼苗體內(nèi)參與各種代謝的酶類增加和滲透調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用，幼苗生長潛力和抗逆性增強。

2.2.3不同引發(fā)劑對老化甜菜種子淀粉酶活力的影響

由圖2可知，α-淀粉酶活力總體呈上升的趨勢，經(jīng)不同引發(fā)劑處理后的α-淀粉酶活力較ck都有不同程度的提高，其中以250 mg·L-1GA3處理的活力最高，第6天酶活力較ck增加了155.37%，其次是1.0%殼聚糖，第6天α-淀粉酶活力較ck增加了115.30%，25% PEG-6000和12 h水浸種處理雖然對α-淀粉酶活力有提高的作用，但無論是增高幅度及酶活力大小都不如其他幾個處理顯著(p<0.05)。

由圖3可知，隨著萌發(fā)時間的增加，β-淀粉酶活力整體呈上升的趨勢，在第6天時，各處理酶活力均達到最大值。經(jīng)引發(fā)劑處理后的β-淀粉酶活力均高于ck，第6天12 h純水處理后的β-淀粉酶活力雖然顯著(p<0.05)高于其他處理，但與第2天及第3天的酶活力綜合分析后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)250 mg·L-1GA3處理后的活力最高，從第2天起活力均高于其他處理，其次是1.0%殼聚糖處理后的種子酶活力，這一結(jié)果與α-淀粉酶活力的變化趨勢相同，說明這兩個處理對于老化甜菜種子淀粉酶活力的提高起到了良好的促進作用。其他處理如100 mg·L-1AsA以及1.5% CaCl2對種子的淀粉酶活力的作用雖不如上述二者顯著(p<0.05)但也能使其活力得到較為明顯的提高。該實驗結(jié)果表明，不同引發(fā)劑和濃度的處理，在提高促進種子萌發(fā)的淀粉酶活力方面差異顯著，可指導(dǎo)開發(fā)生產(chǎn)上應(yīng)用的自然老化甜菜種子引發(fā)技術(shù)，并且2種淀粉酶活力可作為種子是否被有效引發(fā)的指標(biāo)。

3 討 論

甜菜種子收獲后隨著貯藏時間的增加會出現(xiàn)種子老化，帶來的影響反映在種子活力及后續(xù)的生理生化特征中[10]。沙紅等[11]研究表明，人工加速老化的甜菜種子經(jīng)不同處理引發(fā)后，種子活力能得到不同程度的提高，說明引發(fā)對人工老化甜菜種子能夠起到一定的修復(fù)作用。本試驗結(jié)果表明，自然老化甜菜種子經(jīng)不同引發(fā)劑處理后，同樣可以提高種子活力及其抗逆性。

3.1 甜菜種子自然老化的生理機制

在種子貯藏過程中，活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的產(chǎn)生是導(dǎo)致種子老化的主要原因，其中O2·-是ROS中起主要作用的物質(zhì)。在種子萌發(fā)過程中，O2·-含量的增加會導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化從而產(chǎn)生MDA，最終造成細(xì)胞膜透性增大，使相對電導(dǎo)率上升[12]。本研究表明，通過引發(fā)可以在一定程度上減少O2·-的產(chǎn)生，從而使MDA含量和相對電導(dǎo)率下降，最終使甜菜幼苗抗逆性增加。不同引發(fā)處理中，殼聚糖和GA3對O2·-含量、MDA含量及相對電導(dǎo)率降低效果顯著(表4)，對細(xì)胞膜透性能起到一定的修復(fù)作用。

可溶性蛋白可以通過維持細(xì)胞膨脹或滲透平衡穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，可溶性蛋白的增加對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護作用，提高植物的抗逆性[12]。郭坤元等[13]研究表明，以低濃度外源硒作為引發(fā)劑可在一定程度上提高黃精種子可溶性蛋白的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，以GA3作為引發(fā)劑處理后的幼苗可溶性蛋白含量明顯高于其他處理(圖1)，原因可能是外源GA3能緩解細(xì)胞中過氧化作用造成的溶酶體破壞，降低了貯藏物質(zhì)的降解速度[14]。其次殼聚糖處理也能明顯提高可溶性蛋白含量(圖1)，一定程度上緩解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解，進而提高抗逆性。

α-淀粉酶與β-淀粉酶是種子貯藏過程中重要的淀粉水解酶，能促進麥芽糖的產(chǎn)生，從而為種子的萌發(fā)提供能量[15]。二者對種子萌發(fā)過程能量的供給起著重要的調(diào)節(jié)作用。本試驗通過對各試劑中最優(yōu)處理的淀粉酶活性進行測定發(fā)現(xiàn)，GA3處理后α-淀粉酶活性明顯高于對照(圖2)，β-淀粉酶活性低于12 h水處理但高于其他試劑處理(圖3)，說明GA3能誘導(dǎo)植物體內(nèi)某些水解酶的產(chǎn)生，促進淀粉水解，從而為種子萌發(fā)提供能源物質(zhì)[16]。但是12 h水處理β-淀粉酶顯著高于其他處理，這需要后續(xù)進行更深入的研究分析。其次是殼聚糖處理后，α-淀粉酶及β-淀粉酶活性較ck均顯著上升(p<0.05)。

3.2 種子響應(yīng)引發(fā)處理的機制存在物種間差異

殼聚糖作為種子引發(fā)劑有廣泛的應(yīng)用[17]，可以為種子萌發(fā)過程中提供外界物質(zhì)進入種子內(nèi)部的介質(zhì)與通道，從而為提高出苗率、抗逆性、增產(chǎn)等打下良好基礎(chǔ)。孟顯麗等[18]研究表明，殼聚糖對黃豆、紅小豆、豇豆、小麥種子萌芽和幼苗均有一定的促生長作用。本試驗研究結(jié)果與孟顯麗結(jié)果大致相同，隨著殼聚糖濃度的增加，引發(fā)效果呈先上升后下降的趨勢，1.0%殼聚糖溶液明顯提高自然老化甜菜種子活力及相關(guān)蛋白酶活性，修復(fù)膜系統(tǒng)損傷，增強幼苗抗逆性，減少老化對種子造成的損傷。

GA3具有解除休眠、促進種子萌發(fā)的作用，能促進植物莖、葉的生長[19]，微量GA3作為引發(fā)劑有提高種子活力的作用[20]。丁憶然等[21]研究表明，適宜濃度的GA3溶液對人工老化的小麥種子活力及抗逆性有一定的修復(fù)作用。本研究結(jié)果與其結(jié)果大致相同，不同濃度的GA3溶液，對老化甜菜種子引發(fā)效果也不同。與ck相比，可溶性蛋白含量與淀粉酶的含量在所有處理中最高，這可能與GA3能誘導(dǎo)植物體內(nèi)水解酶產(chǎn)生有關(guān)系。相關(guān)研究表明GA3對α-淀粉酶有明顯的提高作用[22]。

此外，本試驗使用的不同植物生長調(diào)節(jié)劑或化學(xué)試劑在其他種類作物上有顯著作用[23-28]，用其處理自然老化甜菜種子后，結(jié)果不盡相同。表明不同引發(fā)劑作用機理以及不同作物種子對引發(fā)的響應(yīng)過程存在差異，還需要進一步深入分析，為引發(fā)劑在實踐中更加精準(zhǔn)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗研究了不同試劑的不同濃度以及不同時間純水浸種引發(fā)處理對自然老化甜菜種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，探討了不同處理與老化種子的萌發(fā)動態(tài)及生理特性的關(guān)系，結(jié)果表明，引發(fā)處理可在一定程度上修復(fù)自然老化甜菜種子的種子活力，同時提高其抗逆性。不同試劑對自然老化甜菜種子的提高效果不相同。以下處理為各試劑最優(yōu)處理：12 h純水引發(fā)、0.6% H2O2、25% PEG-6000、1.0%殼聚糖、1.5% CaCl2、250 mg·L-1GA3、100 mg·L-1AsA。綜合種子活力與幼苗生理生化特性能發(fā)現(xiàn)，在本試驗中1.0%殼聚糖溶液對老化甜菜種子來說，是效果最好的引發(fā)劑及引發(fā)濃度；其次，250 mg·L-1GA3對于老化甜菜種子活力修復(fù)也起到了明顯的效果。為甜菜種子加工和生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。