哌嗪高效降解菌PIPA-6的分離篩選及降解特性

過俊俊,姚雯清,樓麗麗,雷興華,張 昕

哌嗪高效降解菌PIPA-6的分離篩選及降解特性

過俊俊,姚雯清,樓麗麗,雷興華,張 昕*

(浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 杭州 311300)

從制藥廠周邊土壤分離獲得一株哌嗪高效降解菌株P(guān)IPA-6,其能在以哌嗪為唯一能量來源的無機培養(yǎng)基中生長,30h對100mg/L的哌嗪降解率達100%.形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA基因序列同源性分析表明,菌株為嗜煙堿類節(jié)桿菌().菌株P(guān)IPA-6具有廣泛的溫度(10～40℃)和pH(5～10)適應(yīng)范圍、優(yōu)良的鈉鹽耐受性(50g/L)和極強的哌嗪抗性(300mg/L),其最佳降解條件為溫度35 ℃,pH, 8.體系中額外添加有機碳能提高菌株的降解效率.降解效應(yīng)的模擬試驗結(jié)果表明,菌株P(guān)IPA-6能在50L模擬罐中穩(wěn)定發(fā)揮降解作用,制藥廢水中化學(xué)需氧量 (COD)和銨態(tài)氮含量顯著降低(< 0.05),哌嗪降解率在30d達98%.宏基因組測序證實該菌株能在水體中穩(wěn)定定殖,改變了污水中的微生物群落結(jié)構(gòu).本研究中所獲菌株充實了哌嗪降解菌種資源庫,實驗結(jié)果為菌株的實際開發(fā)應(yīng)用提供了初步理論依據(jù).

哌嗪；降解；嗜煙堿類節(jié)桿菌；降解特性

哌嗪是一種無色透明針狀或葉狀結(jié)晶的有機雜環(huán)胺,其作為生產(chǎn)喹喏酮類抗菌藥物的重要中間體[1-4],具有一定的殺菌、殺蟲和除草活性[5-6],同時也大量被應(yīng)用于橡膠合成、阻燃劑生產(chǎn)以及精細化工[7-8].由于其巨大的市場潛力,哌嗪生產(chǎn)廠商大量涌現(xiàn).據(jù)不完全統(tǒng)計,目前中國哌嗪產(chǎn)能已經(jīng)在每年5000t以上,在全球占比約1/7[9].然而哌嗪制品生產(chǎn)后并不能完全回收,其殘留的部分會隨廢水排放.含哌嗪及其衍生物的廢水屬于高氮低碳型有機胺廢水,通常高鹽、高堿,因不利于微生物生長而難以被生物降解,一旦流入環(huán)境易造成殘留[10],哌嗪作為一種含氮雜環(huán)化合物常在環(huán)境中被高頻次檢出[11].毒理學(xué)研究表明,哌嗪的長期低劑量攝入會對人類的神經(jīng)和肝臟產(chǎn)生毒副作用,如致幻、興奮和精神抑制[12-14];長期暴露在含有哌嗪的環(huán)境中還有致癌的風(fēng)險,嚴(yán)重危害人類健康[15].因此采用有效手段嚴(yán)格控制富含哌嗪污水的排放、從源頭控制哌嗪的污染擴散,是保障生態(tài)環(huán)境和生命安全的關(guān)鍵所在.

目前,富含哌嗪污水的理化處理主要采用化學(xué)氧化和催化氧化工藝,其缺點是成本高,且具有二次污染的風(fēng)險[16].利用微生物的降解作用去除污水中殘留有毒有機污染物因其效率高、效果好、操作簡便以及價格低廉一直是污水處理的有效手段[17].然而利用微生物降解環(huán)境中殘留的哌嗪卻一直面臨菌種資源難以獲得且實際應(yīng)用效果不佳的問題.曾有學(xué)者分離獲得30個菌株,能在脫氮情況下降解哌嗪的衍生物吡咯烷和哌啶,卻沒有一株能夠降解哌嗪[18].有研究分離獲得一株能以哌嗪為唯一碳源和氮源進行生長的細菌spTOH,降解效率較高,但其實際應(yīng)用卻受到溫度的限制.當(dāng)溫度低于20℃時,哌嗪的降解能力大幅下降[19].因此,急需從環(huán)境中篩選環(huán)境適應(yīng)性好、抗逆性強、降解性能穩(wěn)定的降解菌株用于哌嗪廢水的處理,以達到凈化水體的目的.

本研究從制藥廠周邊土壤中分離獲得適應(yīng)性好、能以哌嗪為唯一能源的高效降解菌株,明確菌株的最佳降解條件并進入模擬測試,驗證了菌株的實際應(yīng)用效果.實驗結(jié)果對于充實哌嗪降解微生物菌種資源,豐富哌嗪污水處理的理論和實踐體系都具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與主要試劑

NKKM培養(yǎng)基(g/L):NaCl 1.0,KH2PO40.5, K2HPO41.5,MgSO4˙7H2O 0.2(pH 7.0),含無水哌嗪100mg/L,用于哌嗪降解菌株的富集、篩選和降解特性研究.LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10(pH 7.0),用于菌株形態(tài)觀察和生理生化指標(biāo)測定.對甲基苯磺酰氯儲備液用于哌嗪衍生和含量檢測.菌株的分子鑒定及污水中全菌體DNA提取所需試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 哌嗪降解菌的富集與篩選 采集浙江上虞某制藥廠周邊污水流經(jīng)地面以下10～15cm處土壤.稱取5g新鮮土樣加入100mL NKKM培養(yǎng)基中, 30℃、160r/min搖床震蕩培養(yǎng),3d后每天從富集培養(yǎng)基中取懸液1mL,采用稀釋平板法于固體富集培養(yǎng)基上分離菌株.選擇長勢良好且傳代穩(wěn)定的菌株純化后用于后續(xù)實驗.

1.2.2 菌株的降解效果測定 菌株的培養(yǎng)在三角瓶中進行.在200mL哌嗪終濃度為100mg/L的NKKM培養(yǎng)基中接種10%(/)新鮮培養(yǎng)至OD600為1.8的降解菌菌懸液.接種后將三角瓶置于30℃, 160r/min條件下生長,每6h取樣菌液測定哌嗪的含量.哌嗪含量的檢測采用高效液相色譜法(HPLC).具體方法為:取5mL待測液體置于試管,加入100μL 0.1mol/L NaOH溶液、1mL對甲基苯磺酰氯儲備液,加蓋試管塞后放入50℃水浴鍋中反應(yīng)10min,取出冷卻后加入5mL二氯甲烷,充分震蕩萃取后取有機相進行液相色譜檢測.液相色譜檢測條件:XB-C18柱(4.6mm×200mm,5μm);流動相為甲醇:水(60:40);流速0.8mL/min;進樣量:20μL;室溫;檢測波長: 240nm.鑒于預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)哌嗪極難降解,30d內(nèi)其自降率￡5%.本實驗中不另外設(shè)置未添加菌株的哌嗪溶液作為對照.菌株對哌嗪的降解率以初始哌嗪濃度的降低為據(jù)計算,計算公式如下:

降解率(%)=(0-C)/0′100%

式中:0為哌嗪初始濃度;C為哌嗪降解時間的濃度.

1.2.3 菌株的鑒定 采用電鏡進行菌體的形態(tài)學(xué)觀察;菌株的生理生化測定參照東秀珠方法進行[20];菌株的16S rDNA測序分析參照周賡方法進行[21].測序所得序列在NCBI上進行blast比對,利用MEGA-7軟件采用最大相似法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.4 菌株的生長特性 按照1%(v/v)接種量將菌株接種至LB培養(yǎng)基中,30℃、160r/min搖床震蕩培養(yǎng),定期取菌液測定OD600,繪制菌株的生長曲線,明確菌株的對數(shù)生長期,確定后續(xù)取樣時間.以同樣接種、培養(yǎng)和取樣方法測定降解菌株在不同溫度(10～40℃)、初始pH值(pH 5～11)、氯化鈉濃度(0～50g/L)、通氣量(0～2L/min)和添加不同碳源、氮源情況下的生長情況.本實驗所有處理設(shè)置3個平行,碳源和氮源測試中以無額外添加的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)體系為參比對照(CK).

1.2.5 菌株降解的環(huán)境適應(yīng)范圍 按照1.2.4方法測定在不同溫度、初始pH值、碳源、氮源、金屬離子(1mmol/L)情況下,菌株P(guān)IPA-6對哌嗪的降解適應(yīng)范圍,每個處理設(shè)置3個平行.

1.2.6 菌株降解效應(yīng)的模擬試驗 模擬活性污泥法廢水處理技術(shù),在50L大罐中利用菌株P(guān)IPA-6對哌嗪的降解效應(yīng)以及水凈化能力進行中試試驗.取制藥廠新鮮廢水,先用純凈水做2倍稀釋(改善其高鹽和高堿的特性),然后將降解菌株按10%(/)接入廢水中,室溫下(25℃～30℃)30d時間內(nèi)連續(xù)觀察罐中活性污泥和水質(zhì)的顏色、形態(tài)變化,定期取水樣對水質(zhì)的COD以及哌嗪含量等指標(biāo)按國標(biāo)進行測定.

1.2.7 污水水體中微生物群落結(jié)構(gòu)分析 收集1.2.6試驗中處理30d后的水樣(CS),采用試劑盒法提取全菌體DNA,委托北京諾禾致源科技股份有限公司對菌株的16S rDNA V4區(qū)進行擴增子測序分析[22].試驗以初始廢水(YS)為參比,分別設(shè)置3個平行,比較廢水經(jīng)菌株處理前后的微生物群落結(jié)構(gòu)變化.

1.3 數(shù)據(jù)的處理

實驗所得數(shù)據(jù)均利用SPSS 16.0 軟件進行方差分析,在0.05水平(<0.05)確認(rèn)差異顯著性.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離篩選和鑒定

富集培養(yǎng)基在10d后明顯變渾濁,吸取懸液經(jīng)多次稀釋分離和平板劃線后,最終篩選出一株能在以哌嗪為唯一碳源和氮源的固體富集培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長的菌株,命名為PIPA-6.

菌株P(guān)IPA-6在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后形成圓形、表面微隆起、有光澤、挑起略有粘連的灰白色菌落.電鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)IPA-6細胞呈不規(guī)則短桿狀,存在球桿變化,不形成芽孢,如圖1-(a).染色試驗及生理生化測定結(jié)果表明:菌株為革蘭氏陽性細菌;菌株抗酸性染色、氧化酶試驗、VP試驗、甲基紅試驗均呈陰性,接觸酶試驗陽性;能還原硝酸鹽;能水解酪素、明膠和淀粉;能利用葡萄糖、蔗糖和蛋白胨.菌株的16S rDNA測序結(jié)果表明菌株P(guān)IPA-6與s的相似性最高,達到100%,在進化樹上聚為一枝(圖1-(b)),表明二者親緣關(guān)系最近.綜合以上表型,所獲菌株最終被鑒定為.起初吸引眼球是因為其對尼古丁優(yōu)良的降解作用,很多學(xué)者圍繞該菌株展開了一系列相關(guān)研究[23-24],然而對哌嗪的降解作用本文報道尚屬首例.屬細菌具有強大的代謝酶體系,能分解環(huán)境中多種有毒有機物殘留,如農(nóng)藥撲海因[25]、阿特拉津[26]、異丙胺[27],抗生素磺胺甲嘧啶[28-29]以及致癌物多環(huán)芳烴[30]等.鑒于其多元降解活性,該屬細菌在未來的環(huán)境污染修復(fù)中具有廣闊的挖掘和利用空間.

圖1 降解菌PIPA-6的形態(tài)與系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株P(guān)IPA-6的生長特性

2.2.1 菌株的生長曲線與降解能力 在LB培養(yǎng)基中接種6h后,菌株P(guān)IPA-6開始進入對數(shù)生長期,細胞數(shù)目迅速增加,至24h時達到峰值并隨即緩慢減少.降解菌株的細胞生長與菌株對哌嗪的降解能力呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性.隨著時間的推移,當(dāng)體系中細胞數(shù)量大量增加后,哌嗪的殘留明顯減少,降解率也顯著提高.24h內(nèi)菌株對100mg/L的哌嗪降解率達到84.64%,30h 時哌嗪降解率已達100%(圖2).綜合考慮菌體的生長速度和懸液中的細菌含量,在后續(xù)的實驗中選擇培養(yǎng)24h作為時間節(jié)點取樣和測定各項實驗指標(biāo).

圖2 菌株P(guān)IPA-6的生長曲線和降解能力

2.2.2 各種理化因子對菌株生長的影響 環(huán)境中的理化因子是影響菌株生長的重要因素.實驗結(jié)果表明,菌株P(guān)IPA-6能耐一定的酸度,在pH 5～10范圍內(nèi)均可生長.菌株對堿性環(huán)境有良好的適應(yīng)性, pH值在7～9之間時,菌體生長量顯著高于其他處理,最適生長pH值為8(圖3(a)).降解菌對NaCl具有極強的耐受性,在供試的0～50g/L濃度范圍內(nèi)均有明顯生長能力,生長最佳濃度為30g/L(圖3(b)).菌株擁有優(yōu)良的耐鹽性,能有助于其在高鹽廢水中發(fā)揮作用.菌株P(guān)IPA-6有廣譜的溫度適應(yīng)范圍,在10～40℃均能生長,最適生長溫度為30℃(圖3(c)).菌株幾乎不能利用無機碳源(碳酸氫鈉、碳酸氫鉀)和氮源(硝酸鉀、氯化銨),但是在體系中添加有機碳源,如葡萄糖和蔗糖,氮源,如蛋白胨則能大大促進降解菌PIPA-6的細胞生長(圖3(d),3(e)).菌株的良好生長需要氧氣的參與.在通氣量在0.2～1L/min范圍時,通氣量和菌株生長呈現(xiàn)正相關(guān),但差異并不顯著.當(dāng)通氣量過高時(2L/min),導(dǎo)致其生長受到輕微抑制,而靜置培養(yǎng)則因為溶液中溶氧量有限,導(dǎo)致菌體細胞生長不良(圖3(f)).

2.3 菌株降解的環(huán)境適應(yīng)范圍

溫度是影響菌株降解哌嗪的重要環(huán)境因素,在本實驗中菌株P(guān)IPA-6能在較寬的溫度范圍(15～40℃)內(nèi)發(fā)揮降解作用,最高降解率出現(xiàn)在35℃,略高于利于細胞增殖的30℃.其主要原因可能是降解酶的最適溫度高于菌株生長的最適溫度.目前一些已有的降解菌株之所以未能成功應(yīng)用的一個原因之一就是低溫時降解活力差,本研究獲得的菌株在20℃時,24h對100mg/L的哌嗪降解率達到72.31%,15℃仍能發(fā)揮降解作用(圖4(a)).相較于其他已發(fā)現(xiàn)降解菌株,PIPA-6具有更好的溫度適應(yīng)性,有更廣泛的溫度工作范圍.

菌株在初始pH值在7～9時均有較好的哌嗪去除率,在過酸(pH￡6)或過堿(pH311)條件下,降解作用受到明顯抑制(圖4(b)),這可能與菌株在上述情況下長勢較差有關(guān).菌株能夠耐受高濃度的哌嗪,在300mg/L的濃度下仍然顯示出較強的降解能力.在接種菌株P(guān)IPA-6 48h后,哌嗪的殘留已難以檢出(圖4(c)).但值得注意的是,哌嗪濃度越高,需要降解的時間也越長.在降解體系中添加氯化銨與硝酸鉀不能促進菌株對哌嗪的降解(圖4(d)),推測其原因可能是哌嗪本身即為有機雜環(huán)胺,能為降解菌生長提供氮源,而其他含氮化合物的存在則會形成競爭抑制.相反,在體系中添加葡萄糖和蔗糖均能促進哌嗪的降解(圖4(e)),其原因可能是增加的碳源改善了原本體系中的營養(yǎng)狀態(tài),優(yōu)化了碳氮比.此外,有毒害作用的重金屬離子的存在會影響菌株的降解性能,如Co2+和Cd2+(圖4(f)).

2.4 菌株降解效應(yīng)的模擬試驗

圖5 廢水中COD、哌嗪和氨氮含量變化

活性污泥是廢水凈化的核心要件.利用50L大罐制成廢水凈化模擬裝置.模擬實驗的連續(xù)觀察表明,外源添加降解菌對體系中的活性污泥無不良影響.在30d時間范圍內(nèi)活性污泥外觀形態(tài)正常,體積有擴大趨勢.供試廢水經(jīng)連續(xù)處理后水體顏色由棕黃色變淡且有澄清跡象,水質(zhì)大大改善,水體中COD、哌嗪以及氨氮含量均顯著降低(<0.05)(圖5).其中COD由最初的38375mg/L降為1050mg/L,氨氮含量從148.21mg/L減少為41mg/L,而哌嗪則由最初的32.1mg/L降至0.7mg/L,降解率達98%.模擬實驗證實降解菌PIPA-6能發(fā)揮哌嗪降解作用,降解效果顯著.

2.5 污水水體中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

對測序污水樣品的OTUs聚類,并對OTUs的代表序列進行物種注釋及豐度分析發(fā)現(xiàn),污水處理前和處理后水中占絕對優(yōu)勢的細菌都屬于變形菌門(Proteobacteria),這與已報道的污水活性污泥中微生物的種類分布規(guī)律一致[31-32].然而接種菌株P(guān)IPA-6改變了微生物的群落結(jié)構(gòu),原先水體中占絕對優(yōu)勢的g-變形菌綱細菌被a-變形菌綱細菌所取代(圖6(a)).同時,30d后水體中出現(xiàn)了大量放線菌綱細菌(Actinobacteria),與未處理的污水相比差異顯著(<0.05)(圖6(b)).基于本文中分離獲得的菌株P(guān)IPA-6隸屬于放線菌門放線菌綱,本研究中污水體系放線菌綱細菌豐度的顯著增加可能為降解菌株在污水處理體系中的成功定殖所致,這為后續(xù)發(fā)揮降解作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ).

a) 綱水平上的物種相對豐度; b) 處理與對照組間綱水平上差異顯著(<0.05)的物種(Actinobacteria)分析,條形表示組間豐度差異顯著的物種在每組中的均值(means);c)細菌種群間互作圖譜,節(jié)點代表微生物類群,點間連線表示物種間有互作關(guān)系;d)處理與對照組代謝差異分析;YS:未加菌原始水樣;CS:接菌30d后水樣

對水體中各菌群的互作分析發(fā)現(xiàn),污水降解體系中變形菌綱(Proteobacteria)與放線菌綱(Actinobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidetes)、厚壁菌綱(Firmicute)和酸桿菌綱(Acidobacteria)細菌之間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖6(c)),這暗示著這些菌群之間存在復(fù)雜的互作,而哌嗪等水體中其他化合物的分解可能是多個菌群協(xié)同代謝的結(jié)果.由于外源添加降解菌改變了污水中的微生物群落結(jié)構(gòu),這使得處理水與原始污水的代謝途徑也不盡相同.從圖6(d)可以看出盡管在2種水體中都進行著相當(dāng)規(guī)模的化能異養(yǎng)代謝(Chemoheterotrophy),但有菌株添加的水體還進行高比例的硝酸鹽還原(Nitrate reduction)和脫氮反應(yīng)(Denitrification).而未處理的水體中則更多的進行鐵呼吸(iron respiration)、厭氧發(fā)酵(fermentation)、碳氫化合物的降解(hydrocarbon degradation)以及原生動物的寄生和共生等.由此推測,廢水中高濃度的氨氮以及哌嗪的分解與微生物介導(dǎo)的硝酸鹽還原(Nitrate reduction)和脫氮反應(yīng)密切相關(guān).

3 結(jié)論

3.1 篩選獲得能以哌嗪為唯一碳源和氮源的高效哌嗪降解菌PIPA-6. 菌株P(guān)IPA-6有廣泛的溫度(10～40℃)和pH(5～10)適應(yīng)范圍、優(yōu)良的鈉鹽耐受性(50g/L)和極強的哌嗪抗性(300mg/L),尤其具有耐低溫(15℃)、高鹽(50g/L NaCl)、高堿(pH 10)的獨特降解優(yōu)勢.

3.2 將菌株P(guān)IPA-6引入廢水處理模擬裝置后,制藥廢水的化學(xué)需氧量 (COD)和水體中銨態(tài)氮含量顯著降低,哌嗪降解率在30d時間內(nèi)達98%,證實菌株能穩(wěn)定發(fā)揮降解哌嗪、凈化水體的實際作用,具有良好的開發(fā)應(yīng)用潛力.菌株P(guān)IPA-6能夠在水體中定殖,其對哌嗪的去除和污水凈化的一個原因可能與菌株優(yōu)化水體中微生物群落結(jié)構(gòu)、改變其代謝途徑有關(guān).

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感謝杭州秀川科技生物有限公司在模擬罐裝置設(shè)計和污水參數(shù)測定過程中給予的建議和指導(dǎo).

Isolation and screening of piperazine degrading bacterium PIPA-6 and its degradation characteristics.

GUO Jun-jun, YAO Wen-qin, LOU Li-li, LEI Xin-hua, ZHANG Xin*

(College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, China)., 2021,41(9)：4360～4366

Piperazine-degrading strain PIPA-6was isolated from the soil around a pharmaceutical plant in this study, the strain could grow in medium with piperazine as the sole energy source, and the degradation rate for 100mg/L of piperazine reached 100% within 30h. Strain PIPA-6 was finally identified asbased on the analysis of morphological observation, physiological and biochemical tests, as well as 16s rDNA sequencing. Strain PIPA-6 could grow in a wide range of temperatures (10～40℃) and pH (5～10), with excellent sodium salt tolerance (50g/L) and high piperazine resistance (300mg/L). The optimum degradation was achieved at 35℃, pH,8. The degradation efficiency of the strain could be significantly improved by adding organic carbons.Simulation experiments showed that strain PIPA-6played a vital role in piperazine degradation in 50L simulation tank, the parameter of chemical oxygen demand(COD) and the content of ammonium nitrogen in pharmaceutical wastewater were significantly reduced(< 0.05).Degradation rate of strain PIPA-6 for piperazine was up to 98% in 30d. Metagenomics analysis confirmed that the strain could successfully colonize in the wastewater and shape new microbial community structure compared with the initial one. The strain obtained in this study enriched the resource of the piperazine-degrading strains, and the experimental results provided a preliminary theoretical basis for the development and practical application of the strain.

piperazine；degradation；；degradation characteristics

X172,X703.5

A

1000-6923(2021)09-4360-07

過俊俊(1999-),男,安徽毫州人,本科生,主要從事環(huán)境微生物研究.發(fā)表論文1篇.

2021-02-01

國家自然科學(xué)基金資助項目(31970093;31670110)

* 責(zé)任作者, 副教授, zhangxins@126.com