焦文鵬 郭秀娟 焦文靜 馬鳴 張金艷

肝癌是全球范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤，最新數(shù)據(jù)顯示，2018年全球新發(fā)肝癌病例1 033 701 例，居惡性腫瘤發(fā)病率第7 位；死亡病例782 685 例，死亡率居惡性腫瘤第2 位[1]。我國癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示肝癌是我國常見惡性腫瘤，其死亡率和發(fā)病率均高于世界平均水平，是我國的第二大惡性腫瘤死亡原因[2]。且大多數(shù)肝癌發(fā)生于乙型或丙型肝炎病毒感染或酒精濫用等潛在肝病患者，加大早期診斷的難度，同時(shí)肝癌患者的預(yù)后較差，其3年生存率低于20%[3]。同時(shí)肝癌的的發(fā)病機(jī)制尚未明確，缺乏針對性治療方法，因此尋找特異性的早期診斷和治療的腫瘤標(biāo)志物對于肝癌的早期診斷、治療和改善肝癌患者的預(yù)后尤為重要。

MicroRNA（miRNA）是控制基因表達(dá)和癌癥發(fā)展的內(nèi)源性小型非編碼RNA，可以靶向結(jié)合蛋白編碼基因而影響靶基因的穩(wěn)定性或在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)[4-7]。尤其是在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[8-10]。多項(xiàng)研究表明miR-221 在宮頸癌[11-12]、喉癌[13]、前列腺癌[14-15]和胃癌[16]中異常表達(dá)，發(fā)揮著重要的作用。而miR-221 在肝癌中的研究較少，本研究利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus database，GEO）[17]公共數(shù)據(jù)庫的肝癌大樣本數(shù)據(jù)和臨床樣本驗(yàn)證的方式分析miR-221 在肝癌織中的表達(dá)水平及其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，進(jìn)一步分析miR-221 在肝癌患者診斷及臨床預(yù)后方面的價(jià)值。利用生物信息學(xué)的手段分析了miR-221 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，以期為肝癌患者的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的選擇和芯片數(shù)據(jù)的差異性分析

本次研究所用到的公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集是來自基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫GEO 中的GSE10694 和GSE108724兩個(gè)芯片數(shù)據(jù)集，且芯片數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理。R 軟件中Limma 包[18]用于數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化以及癌組織和正常組織的差異性分析。利用Targetscan、miRWalk和miRTarBase 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miR-221 的靶基因預(yù)測，利用韋恩圖取交集，對所得的靶基因利用Clusterprofile 包進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）與京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2 臨床樣本信息

本次實(shí)驗(yàn)所用臨床樣本均收集于2016年1月至2018年12月間河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院手術(shù)切除的74 例肝癌患者，所有患者術(shù)前均未接受過放射治療和化療。此外，分別收集了25 例肝癌患者和正常人的血漿樣本，用于評估m(xù)iR-221 在血漿中的表達(dá)水平。同時(shí)收集患者原發(fā)灶組織及距腫瘤原發(fā)灶邊緣>5 cm 的癌旁非腫瘤組織，且獲得患者知情同意以及本次研究通過河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞及主要試劑

人肝癌細(xì)胞系HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院保留并傳代培養(yǎng)。重組質(zhì)粒及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和MTS 試劑均購自美國Promega公司，胰蛋白酶和TRIzol 試劑購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清購自美國BI 公司，RPMI 1 640 培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司。兔抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）與波形蛋白（vimentin）及GAPDH 單克隆抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG）購自美國KPL 公司，電化學(xué)發(fā)光試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 RNA 提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測肝癌組織和血漿中miR-221 的表達(dá) 按TRIzol 試劑說明書提供的操作流程，采用苯酚-氯仿抽提法分別提取肝癌及癌旁組織中總RNA。用紫外分光光度計(jì)檢測各組織中總RNA 的濃度和純度，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以評估RNA 的完整性。將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測。miR-221 的正義鏈：5'-GGGAAGCTACTAAGTCTGC-3';反義鏈：5'- GTGCGTGTCGTGGAGTCG -3'。U6 為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證時(shí)的內(nèi)參，其正義鏈序列為：5'-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3，反義鏈序列為5'-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3'。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR 法檢測miR-221 在肝癌組織及癌旁正常組織和血漿中的表達(dá)水平，反應(yīng)條件為95℃，30 s 預(yù)變性，95℃，12 s，62℃，30 s，72℃延伸40 s，共40 個(gè)循環(huán)。以每個(gè)熒光信號達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)作為Ct 值，U6 作為miR-221 的內(nèi)參，ΔCt=Ct（miR-221）-Ct（U6），miR-221 的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.4.2 miR-221 與肝癌患者預(yù)后相關(guān)性的分析及其在診斷肝癌患者方面的能力 用R 軟件中的pROC[19]包進(jìn)行的受試者工作特征（ROC）曲線分析，以探索miR-221 區(qū)分肝癌患者與健康個(gè)體的敏感性和特異性。Kaplan-Meier plotter （http://kmplot.com/）[20]是一個(gè)在線數(shù)據(jù)庫，包含了多基因大樣本的預(yù)后分析。為了分析miR-221 的表達(dá)水平與肝癌患者生存時(shí)間之間的相關(guān)性，本研究將肝癌患者分為miR-221 高表達(dá)組和miR-221 低表達(dá)組，利用K-M 生存曲線分析了miR-221 表達(dá)水平與肝癌患者的總生存時(shí)間（overall survival，OS）以及無病生存時(shí)間(disease-free Survival，DFS）之間的相關(guān)性。

1.4.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞接種于6 孔板中，接種密度以過夜培養(yǎng)后細(xì)胞融合度為70%～80% 為標(biāo)準(zhǔn)。按照Lipofectamine2000說明書提供的操作流程，以無血清DMEM培養(yǎng)液配制轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒工作液，分別向HepG2和MHCC97H 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染兩種miR-221inhibitor 及陰性對照（NC 組）。轉(zhuǎn)染6 h 后更換為含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，收集HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞，提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4.4 MTS法檢測低表達(dá)miR-221 對HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染后的HepG2和MHCC97H 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后常規(guī)消化并重懸于培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度，分別接種于96 孔培養(yǎng)板中（1×103個(gè)/孔），每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。分別于細(xì)胞貼壁生長后0、24、48、72 和96 h 時(shí)在每孔加入20 μL MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm處檢測各孔的OD 值，表示細(xì)胞的增殖水平。

1.4.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后常規(guī)消化并重懸于培養(yǎng)液 中，調(diào)整細(xì)胞密度分別接種于6 孔板（5×103個(gè)/孔），常規(guī)培養(yǎng)1 周。用4%多聚甲醛溶液固定30 min 后，0.1% 結(jié)晶紫染色30 min，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)（>50 個(gè)細(xì)胞計(jì)為1 個(gè)克隆），并計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.6 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染后的HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后常規(guī)消化并重懸于培養(yǎng)液 中，調(diào) 整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液 以100 μL/孔接種于Transwell 小室的上室中，下室中加入750 μL/孔完全培養(yǎng)液。將細(xì)胞懸液接種于基質(zhì)膠包被的Transwell小室上室。將接種細(xì)胞后的Transwell 小室置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，用4%多聚甲醛溶液固定，并進(jìn)行結(jié)晶紫染色。棉簽擦去上室面殘余細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量，以此反映細(xì)胞的侵襲能力。

1.4.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測低表達(dá)miR-221對EMT 標(biāo)志物mRNA 水平的影響 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測低表達(dá)miR-221 后HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 及vimentin mRNA 的表達(dá)情況。E-cadherin 的正義鏈：5'-CGAG AGCTACACGTTCACGG-3';反義鏈：5'- GGCCTTT TGACTGTAATCACACC-3'。N-cadherin 的正義鏈：5'-CAACTTGCCAGAAAACTCCAGG-3';反義鏈：5'-ATGAAACCGGGCTATCTGCTC-3'。Vimentin 的正義鏈：5'-CGCCTGCAGGATGAGATTCAG-3';反義鏈：5'- TCAGGGAGGAAAAGTTTGGAAA-3'。

1.4.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測低表達(dá)miR-221 對EMT 標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平的影響 按照蛋白提取試劑盒操作流程抽提細(xì)胞總蛋白。按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE 分離蛋白，以80 V 為起始電壓進(jìn)行電泳，分離膠電壓至120 V，電泳約90 min。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，取出后放入含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫孵育1 h，加入稀釋后的一抗 [兔抗人E-cadherin、N-cadherin、vimentin 及GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體（體積稀釋比例分別為1∶2 000、1∶6 000、1∶2 000 和1∶10 000）]，在搖床上4℃孵育過夜；用TBST 清洗膜3 次，每次5 min；加入稀釋的二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶100 000）]，室溫孵育1 h 后，用TBST 清洗膜3 次，每次5 min；在PVDF 膜上滴加電化學(xué)發(fā)光劑，曝光，顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 和R 3.6.2 軟件對所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次，計(jì)量資料以xˉ ±s表示。MiR-221 在肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織和血漿中的表達(dá)差異及其與臨床病理資料間的關(guān)系均采用秩和檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)和近似t檢驗(yàn)，且均為雙側(cè)檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。

2 結(jié)果

2.1 miR-221 在GEO 數(shù)據(jù)集中的表達(dá)水平

本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載獲得GSE10694和GSE108724 兩個(gè)數(shù)據(jù)集，利用R 和Graphpad 軟件分析發(fā)現(xiàn)，miR-221 在肝癌患者腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織。MiR-221 在GSE10694 和GSE108724 兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的相對表達(dá)量分別為：13.58±0.11vs. 12.05±0.09（P<0.001圖1A，1B）和7.42±0.43vs.3.25±0.83（P<0.001 圖1C，1D）。

圖1 miR-221 在GEO 數(shù)據(jù)集中的表達(dá)水平

2.2 miR-221 在肝癌患者腫瘤組織和血漿中的表達(dá)及其表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性

本研究經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測結(jié)果顯示，miR-221 在肝癌患者腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于對應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其相對表達(dá)量分別為：5.51±0.11vs. 4.05±0.09（P<0.001，圖2A）。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，在25 例肝癌患者血漿中miR-221 的相對表達(dá)水平顯著高于正常健康人群，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其相對表達(dá)量分別為：4.04±0.20vs. 2.54±0.16（P<0.001，圖2B）。

圖2 miR-221 在肝癌組織和血漿中的表達(dá)水平

進(jìn)一步分析miR-221 的表達(dá)水平與74 例肝癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，miR-221 的表達(dá)水平與肝癌患者的TNM 分期和腫瘤大小顯著相關(guān)（P<0.05，表1）。

表1 miR-221 的表達(dá)水平與74 例肝癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性

2.3 miR-221 在肝癌患者中的診斷及預(yù)后價(jià)值

利用74 例肝癌患者組織中miR-221 的表達(dá)量分析其在診斷肝癌患者方面的價(jià)值，ROC 分析結(jié)果顯示曲線下面積為0.967（圖3A），說明miR-221 具有較強(qiáng)的診斷價(jià)值。進(jìn)一步利用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫分析了miR-221 的表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示低miR-221 表達(dá)組的肝癌患者的總生存時(shí)間（圖3B）和無病生存時(shí)間（圖3C）均顯著長于高miR-221 表達(dá)組的肝癌患者。

圖3 miR-221 在肝癌診斷方面的價(jià)值及其表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性

2.4 miR-221 靶基因的富集分析

對所獲得的miR-221 的包括軸形成抑制因子2（the Axin-related protein 2，AXIN2）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 10，MAPK10）、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1（endothelin converting enzyme 1，ECE1）等基因在內(nèi)的456 個(gè)靶基因進(jìn)行GO 和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，miR-221 主要參與的生物過程包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育細(xì)胞生長、肌醇脂質(zhì)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞對肽激素刺激的反應(yīng)以及磷脂酰肌醇3-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控等（圖4A）。而所參與的信號通路主要為p53 信號通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路、ErbB 信號通路、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)、mTOR 信號通路、cGMP-PKG 信號通路、PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路（圖4B）。此結(jié)果可表明miR-221 在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

圖4 miR-221 靶基因的功能富集分析

2.5 沉默miR-221 的表達(dá)顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力

MTS 分析結(jié)果顯示，與空白對照組相比，48、72和96 h miR-221 inhibitor 轉(zhuǎn)染組HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞的OD 值顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖5A）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默miR-221 的表達(dá)后，HepG2 和MHCC97H 的細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯減少（P<0.01，圖5B）。Transwell 小室分析結(jié)果顯示，敲低miR-221 可顯著抑制HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞的侵襲能力（P<0.01，圖5C）。

2.6 沉默miR-221 對EMT 過程相關(guān)分子表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析結(jié)果顯示，敲低miR-221 后，肝癌HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞的E-cadherin mRNA 表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01），N-cadherin 和vimentin mRNA 的表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）（圖6A，B）。蛋白質(zhì)印記法分析結(jié)果顯示（圖5C），下調(diào)miR-221 表達(dá)后，肝癌HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞中E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01），而N-cadherin 和vimentin 蛋白的表達(dá)水平明顯降低（P<0.01）（圖6C）。此結(jié)果表明miR-221 可能通過調(diào)控肝癌細(xì)胞的EMT 進(jìn)程而影響肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

圖5 低表達(dá)miR-221 對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

圖6 分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（A 和B）和蛋白質(zhì)印跡法（C）檢測miR-221 低表達(dá)后對HepG2 和MHCC97H 細(xì)胞中EMT 標(biāo)志物Ecadherin、N-cadherin 和vimentin mRNA 和蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一，盡管近年來診療手段的快速發(fā)展，使得肝癌的診斷和治療效果顯著，但3年生存率僅為18%，因此尋找特異性的腫瘤標(biāo)志物對于肝細(xì)胞癌的治療尤為迫切。越來愈多的研究表明miR-221 在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Dong 等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-221-3p 在肝癌組織和細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，且與肝癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，且通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移而促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。Shanmugapriya 等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-221 在宮頸癌HeLa 細(xì)胞系中高表達(dá)，且過表達(dá)miR-221 可顯著促進(jìn)HeLa 細(xì)胞的增殖能力，并減少癌細(xì)胞的凋亡。zhang 等[12]通過微陣列的基因表達(dá)譜及RT-qPCR 驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)miR-221 在宮頸癌組織和細(xì)胞中明顯高表達(dá)，且通過上調(diào)MAPK10 的表達(dá)來抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移以及血管生成。Shi 等[13]分析發(fā)現(xiàn)miR-221 在喉癌組織中表達(dá)顯著升高，且通過PI3K/AKT 信號通路顯著抑制喉癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞的凋亡。有研究[22]發(fā)現(xiàn)miR-221 在復(fù)發(fā)性乳頭狀甲狀腺癌中的表達(dá)水平顯著高于非復(fù)發(fā)性乳頭狀甲狀腺癌，且與初始手術(shù)時(shí)的腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征顯著相關(guān)。同樣Wang 等[23]通過生物信息學(xué)手段分析發(fā)現(xiàn)miR-221在乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，且通過ErbB 信號通路而在乳頭狀甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，認(rèn)為miR-221 可以作為乳頭狀甲狀腺癌診斷和治療的潛在靶標(biāo)。Neagu[24]分析發(fā)現(xiàn)miR-221 在皮膚癌中異常高表達(dá)，且在皮膚癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。而Krebs 等[14]的研究發(fā)現(xiàn)miR-221 在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，抑制前列腺癌的增殖和誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-221 主要通過調(diào)節(jié)致癌基因SOCS3 和PIK3R1 的表達(dá)使前列腺癌細(xì)胞對酪氨酸激酶抑制劑敏感性增加。而Krebs 研究[15]發(fā)現(xiàn)miR-221 在前列腺癌組織中顯著高表達(dá)，且與高危前列腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，且靶向VEGFR2 而發(fā)揮著致癌基因的作用。

有研究[25]發(fā)現(xiàn)miR-221 在乳腺癌組織中低表達(dá)，且主要作為長非編碼RNA 生長停滯特異性5（GAS5）的海綿體而抑制Wnt /β-catenin 途徑的激活，進(jìn)而在阿霉素的耐藥性中發(fā)揮作用。Li 等[26]研究發(fā)現(xiàn)miR-221 在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，且與乳腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。Jiang 等[16]發(fā)現(xiàn)miR-221-5p 在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)顯著降低。miR-221-5p 的高表達(dá)降低了胃癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性，并抑制了胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。此外，機(jī)制研究miR-221-5p 的表達(dá)水平升高通過靶向DDR1 來提高胃癌細(xì)胞對順鉑的化學(xué)敏感性，并抑制GC 細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和EMT 進(jìn)程。本研究通過分析GEO 數(shù)據(jù)庫中的大樣本樣本發(fā)現(xiàn)miR-221 在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，進(jìn)一步利用臨床患者的腫瘤組織和血漿樣本同樣發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織和血漿中顯著高表達(dá)，且與肝癌患者的腫瘤大小、TNM分期和不良預(yù)后顯著相關(guān)。靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)軸形成抑制因子2（AXIN2）、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK10)、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1（ECE1）等基因可能是miR-221 的關(guān)鍵靶基因，而AXIN2[21]以及MAPK10[12]已經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過，本研究將在接下來的研究中實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ECE1 是否是miR-221 的下游關(guān)鍵靶基因。功能富集分析發(fā)現(xiàn)miR-221 主要參與p53 信號通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路、ErbB 信號通路、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)、mTOR信號通路、cGMP-PKG 信號通路、PI3K-Akt 信號通路和MAPK 信號通路以及細(xì)胞生長等而在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，且PI3K-Akt 信號通路所富集的靶基因最多。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miR-221主要通過調(diào)控EMT 進(jìn)程相關(guān)分子的表達(dá)水平變化而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。今后，本課題組將會進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)miR-221 在肝癌中的具體作用機(jī)制，以期為肝癌的診斷和靶向治療提供更多的依據(jù)。