沈廣勝, 沈興家,*, 張 龍, 趙巧玲,*, 高夢杰, 唐順明,黃靜怡, 陳艷花, 蔣 濤, 朱 娟, 王梅仙

(1. 江蘇科技大學生物技術學院, 江蘇省蠶桑生物學與生物技術重點實驗室, 江蘇鎮(zhèn)江 212018; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點實驗室, 江蘇鎮(zhèn)江 212018; 3. 中國農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學與技術學院, 北京 100193)

太空誘變育種是指將生物體種質材料搭載在返回式衛(wèi)星、高空氣球和飛船等飛行器中，利用太空環(huán)境的特殊綜合因素(高真空、微重力、地球磁場和高能帶電粒子輻射等)，提高遺傳物質發(fā)生改變的概率，使其后代發(fā)生表觀性狀的變異，經(jīng)地面選育進而培育新品種的方法(李謹?shù)? 2015)。經(jīng)過航天誘變，許多物種的后代中產(chǎn)生了可以穩(wěn)定遺傳的變異，這些變異有利有弊，生產(chǎn)上運用有利變異選育了許多優(yōu)良品種。1992年，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所使用水稻干種子搭載衛(wèi)星選育出了優(yōu)良品種“贛早秈47號”(李金國等, 2001)。1996年，中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所將“豫芝4號”搭載我國發(fā)射的第17顆返回式衛(wèi)星，選育出了高產(chǎn)、抗病并且適應性廣的優(yōu)質品種“航芝1號”(張秀榮等, 2003)。王曦茁等(2014)通過航天誘變篩選出了對松褐天牛Monochamusalternatus具有高毒力的球孢白僵菌Beauveriabassiana菌株。大動物航天育種在我國基本處于空白狀態(tài)，研究內(nèi)容集中在太空環(huán)境對動物生理和性狀的影響上(錢荷英和徐安英, 2006)。

家蠶Bombyxmori是具有經(jīng)濟價值的鱗翅目(Lepidoptera)模式昆蟲之一，關于家蠶的空間搭載實驗早在20世紀90年代就已開始。1990年10月，史之禎等進行了家蠶解除滯育卵的空間搭載實驗，首次證實了家蠶胚胎能夠在太空中正常發(fā)育并且孵化(史之禎等, 1995)。1992年底，中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所利用俄羅斯發(fā)射的返回式衛(wèi)星再次證實家蠶能夠在太空中完成吐絲結繭、化蛹化蛾、受精交配、產(chǎn)卵孵化等重要生命行為，并且在回收材料中發(fā)現(xiàn)了鰲蝦蛹、過剩斑紋和3眠蠶等變異體，經(jīng)過繼代培養(yǎng)，這些變異可以穩(wěn)定遺傳給后代(莊大桓等, 1995)。廣東省農(nóng)業(yè)科學院利用我國第20顆返回式衛(wèi)星搭載家蠶卵，經(jīng)過系統(tǒng)選育，得到了生命力強, 繭絲質優(yōu)良, 繁育系數(shù)高的“航誘7號”(吳福泉等, 2008)。然而，對這些家蠶變異體的研究仍然停留在表觀性狀的觀測和突變體的篩選上，對于這些突變發(fā)生的內(nèi)在機理尚不清楚。

2016年10月17日跟隨“神舟十一號”飛船進入天宮二號空間實驗室的6條“秋豐×白玉”雜交后代家蠶幼蟲，11月18日隨分離的“神舟十一號”飛船返回地球，由中國農(nóng)業(yè)大學張龍教授團隊接收，獲得一顆存活雌蛹，該雌蛹羽化后與地面家蠶“白玉”品系雄蛾(江蘇科技大學提供)交配制種，記為F1。2017年春季一部分F1在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點實驗室常規(guī)新鮮桑葉飼養(yǎng)，將F1同胞交配后得到26蛾F2蠶種；7月飼養(yǎng)F2，部分蛾區(qū)發(fā)現(xiàn)特小形蠶繭，連續(xù)7代同胞交配分離出小繭突變體品系sc，同時，正常雌雄個體交配純合，建立飛天蠶(space silkworm)正常繭品系TG。采用SSR分子標記技術將該突變體的突變基因定位在家蠶第3連鎖群上，定位區(qū)間內(nèi)包含33個候選基因，通過該研究期望揭示家蠶小繭突變體突變的分子機制，同時為家蠶大繭形品種的培育提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試蠶品系

實驗用的飛天蠶正常繭蠶品系TG和飛天蠶小繭突變系sc，由江蘇科技大學與中國農(nóng)業(yè)大學張龍教授組合作，從天宮二號空間實驗室返回的“秋豐×白玉”雌蠶(♀)與地面“白玉”雄蠶(♂)雜交后再經(jīng)過連續(xù)7代同胞交配純合而來。用于雜交和測交的品系“白玉”和大繭形品系0223V1，均由中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所(江蘇科技大學)培育和提供。

1.2 sc和TG的表型分析

分別飼養(yǎng)3個蛾區(qū)的TG和sc，為排除環(huán)境誤差，所有材料均在自然光照、25℃、相對濕度控制在80%左右條件下喂食新鮮桑葉。每個蛾區(qū)隨機挑選25頭個體，測量它們在5齡第7天幼蟲時的體重、體長和體寬以及蛹期的全繭重、繭層重和繭層率(繭層重/全繭重)，分別取平均值。數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 7 軟件進行處理，結果以平均值±標準差(SD)表示，TG和sc之間的差異采用t檢驗進行多重比較。

1.3 sc的遺傳分析

利用0223V1♂與sc♀雜交得到F1，觀察F1的表型。F1同胞交配得到F2，統(tǒng)計F2群體中大繭形與小繭形的家蠶個體數(shù)量。根據(jù)雌性家蠶減數(shù)分裂染色體不交換的特點，用0223V1♂和sc♀作為親本，組配F1代及BC1回交群體，即(sc♀×0223V1♂)♀×sc♂和sc♀×(sc♀×0223V1♂)♂，分別記為BC1F和BC1M。BC1F群體用作連鎖分析(Miaoetal., 2005)，BC1M群體中的小繭突變體用作定位分析(Miaoetal., 2005)，同時統(tǒng)計BC1回交群體中大繭形和小繭形個體的數(shù)量，計算分離比。分離比=F2或者BC1群體中的大繭形個體數(shù)目/F2或者BC1群體中的小繭形個體數(shù)目。

1.4 多態(tài)性SSR標記的篩選

以sc♀(親本P1)，0223V1♂(親本P2)及其后代F1為材料，使用動物基因組快速提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]，提取基因組DNA，-20℃凍存?zhèn)溆?。根?jù)已構建的家蠶SSR標記連鎖圖(Miaoetal., 2005)，在每個連鎖群上隨機挑選10個SSR引物，篩選與家蠶基因sc連鎖的SSR標記(表1)，以親本P1、P2以及F1基因組為模板進行PCR擴增，如果某一SSR標記在P1和P2之間分別只有一條差異擴增帶，而在F1代個體中有兩條擴增帶，且其中一條擴增帶與P1相同，另一條擴增帶與P2相同，則此標記為多態(tài)性SSR分子標記。

表1 篩選到的與sc基因連鎖的SSR標記Table 1 Selected SSR markers linked to the sc gene

PCR擴增反應體系(10 μL): 2×Flash Hot Start MasterMix (Dye) 5 μL (北京康為世紀生物科技有限公司), ddH2O 3.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, DNA模板0.5 μL。PCR擴增反應程序: 94℃預變性5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 10 s, 30個循環(huán); 72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 家蠶sc基因的連鎖分析

以1.4節(jié)篩選出的多態(tài)性SSR分子標記為引物，對BC1F進行基因型分析，由于家蠶雌性染色體完全連鎖，BC1F群體中分離出大繭形和小繭形的個體，如果其中所有小繭形個體的PCR擴增條帶與P1相同，所有大繭形個體的PCR擴增條帶與F1相同，那么就認為該SSR分子標記與繭形基因連鎖，即繭形相關基因分布在該SSR標記所在的連鎖群上。而用其他連鎖群的多態(tài)性分子標記對BC1F群體的正常繭和小繭個體的PCR擴增條帶則無此規(guī)律。

1.6 家蠶sc基因的精細定位

基于1.5節(jié)篩選出的家蠶基因組連鎖群，使用SSRHunter1.3尋找新的多態(tài)性SSR標記，根據(jù)圖位克隆的原理，將BC1M群體中出現(xiàn)與F1條帶一致的小繭形個體視為交換個體，并將分析結果記錄到Excel中，進行目的基因與多態(tài)性SSR標記間的遺傳距離檢測，將突變基因定位到兩個分子標記之間，并將定位區(qū)間內(nèi)的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，以得到基因的預測功能。使用作圖軟件MapDraw v2.1繪制遺傳連鎖圖譜。

2 結果

2.1 sc和TG的表型

我們觀察了sc和TG在上蔟前的幼蟲形態(tài)(圖1)，其顯著特征是突變體幼蟲體長較短，胸部狹窄。在5齡第7天幼蟲時，TG的體長為5.213±0.011 cm，體寬為1.191±0.032 cm，體重為3.493±0.235 g。sc的體長為4.347±0.023 cm，是TG體長的83%(P≤0.0001)；體寬為0.718±0.026 cm，是TG體寬的60%(P≤0.0001)；體重為1.729±0.116 g，是TG體重的50%(P≤0.001)。 蠶繭調查情況顯示，TG的全繭重為1.423±0.033 g，繭層重為0.29±0.002 g。sc的全繭重為0.784±0.083 g，是TG全繭重的55%(P≤0.001)；sc的繭層重為0.161±0.021 g，是TG繭層重的55%(P≤0.001)。TG和sc的繭層率相似，TG的繭層率為20.37%±0.351%，sc的繭層率為20.43%±0.603%(圖2)。以上結果說明sc具有短而瘦的體形特征，并且最終結小繭。

圖1 飛天蠶小繭突變體sc(左)和正常繭品系TG(右)的5齡第7天幼蟲表型Fig. 1 Phenotypes of the day-7 5th instar larvae of the small cocoon mutant sc (left) andthe normal cocoon strain TG (right) of space silkworm (Bombyx mori)

圖2 飛天蠶正常繭品系TG和小繭突變體sc的5齡第7天幼蟲(A, B, C)及蛹(D, E, F)表型測量結果Fig. 2 Phenotypic measurement results of the day-7 5th instar larvae (A, B, C) and pupae (D, E, F) of the normalcocoon strain TG and the small cocoon mutant sc of space silkworm (Bombyx mori)A: 體長Body length; B: 體寬Body width; C: 體重Body weight; D: 全繭重Cocoon weight (CW); E: 繭層重Cocoon shell weight (CSW); F: 繭層率Cocoon shell ratio (CSR). 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n=3)。Data in the figure are mean±SD (n=3). ***P≤0.001; ****P≤0.0001(t檢驗t-test).

2.2 sc的遺傳分析

大繭形親本0223V1♂與突變體sc♀雜交F1代個體均表現(xiàn)為大繭形。F1代自交得到的F2代出現(xiàn)性狀分離，有大繭形和小繭形兩種表型，其分離比為3∶1；以sc作為回交親本，用F1代與其進行回交，后代出現(xiàn)了大繭形和小繭形兩種表型，分離比為1∶1(表2)，表明該小繭表型為隱性性狀。根據(jù)孟德爾遺傳定律，小繭性狀由一對隱性基因控制，且在常染色體上，命名為sc。

表2 飛天蠶小繭突變體sc和正常大繭形品系0223V1雜交各世代的性狀分離Table 2 Character segregation among various hybrid generations of the small cocoon mutant sc of spacesilkworm (Bombyx mori) and the normal large cocoon strain 0223V1 of the silkworm

2.3 家蠶sc基因的連鎖分析

根據(jù)SSR標記連鎖圖在家蠶基因組連鎖群中設計SSR引物，以sc♀(親本P1), 0223V1♂(親本P2)及其后代F1的基因組為模板進行PCR擴增。通過對PCR產(chǎn)物帶型的分析，找出在親本及F1中具有多態(tài)性的標記，結果在第3連鎖群上找到了3個SSR多態(tài)性標記(S2924-6, S2930-459和S2930-334)(表1)。然后使用這3個標記對BC1F的正常繭個體和小繭個體進行PCR產(chǎn)物帶型分析。由于這3個標記的電泳圖譜類似，故而選擇S2930-334的擴增產(chǎn)物電泳圖譜(圖3)進行說明。從圖3中可以看出，BC1F個體中10個大繭形個體的帶型與F1的帶型一致，同時10個小繭形個體中的帶型與sc的帶型一致，表明sc的突變基因與第3連鎖群上的標記S2930-334連鎖，即突變基因sc位于第3連鎖群上。

圖3 家蠶基因組第3連鎖群的多態(tài)性SSR標記S2930-334在BC1F群體中的PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig. 3 Electrophoresis map of the PCR products of polymorphic SSR marker S2930-334of linkage group-3 of the Bombyx mori genome in BC1F population1: sc♀; 2: F1(sc♀×0223V1♂); 3: 0223V1♂; 4-13: BC1F群體中的大繭個體Individuals showing big cocoons in BC1F population; 14-23: BC1F群體中的小繭個體Individuals showing small cocoons in BC1F population.

2.4 家蠶sc基因的精細定位

在家蠶基因組第3連鎖群上設計SSR引物，篩選出新的多態(tài)性分子標記，最終選出9個SSR分子標記(表3)。通過這9個SSR分子標記對BC1M群體中的624個小繭形個體進行檢測，并統(tǒng)計每個標記的交換個體數(shù)目，以此計算遺傳交換率，繪制出關于sc基因的連鎖圖(圖4)。突變基因sc位于S2930-459和S2930-288之間，遺傳距離為5.1 cM，距離突變基因最近的兩個標記S2930-363和S2930-289之間的物理距離為684 kb。根據(jù)Silkworm Genome Informatics Database網(wǎng)站(http:∥sgid.popgenetics.net/)提供的基因注釋信息，定位區(qū)間內(nèi)共包含33個候選基因(KWMTBOMOD1363-1395)。

圖4 飛天蠶小繭突變體基因sc與多態(tài)性SSR標記之間的遺傳連鎖圖Fig. 4 Genetic linkage map between the sc gene ofspace silkworm (Bombyx mori) andpolymorphic SSR markers

表3 家蠶基因組連鎖群精細定位SSR分子標記引物Table 3 Fine mapping primers of SSR markers of the linkage groups of Bombyx mori

2.5 家蠶sc突變體的候選基因及其預測功能

通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中的比對，得到了定位區(qū)間內(nèi)候選基因及其預測功能(表4)，其中，KWMTBOMOD1363到KWMTBOMOD1384位于標記S2930-363和S2930-334之間，KWMTBOMOD1385到KWMTBOMOD1393位于標記S2930-334和S2930-305之間，KWMTBOMOD1394和KWMTBOMOD1395位于標記S2930-305和S2930-289之間。 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因注釋，KWMTBOMOD1364, KWMTBOMOD1366, KWMTBOMOD1377, KWMTBOMOD1378, KWMTBOMOD1388, KWMTBOMOD1390和KWMTBOMOD1391功能未知；而KWMTBOMOD1365, KWMTBOMOD1367, KWMTBOMOD1368, KWMTBOMOD1372, KWMTBOMOD1374, KWMTBOMOD1375, KWMTBOMOD1381, KWMTBOMOD1387, KWMTBOMOD1392和KWMTBOMOD1393功能與家蠶的生長發(fā)育無直接關聯(lián)。

表4 家蠶sc突變體的33個候選基因及其預測功能Table 4 The predicted functions of the 33 candidate genes in sc mutant of Bombyx mori

另一些基因的功能可能與家蠶的生長發(fā)育有關，如KWMTBOMOD1363在中胚層細胞分配到特定組織的生理活動中發(fā)揮重要作用，包括體中胚層、心臟、內(nèi)臟中胚層、脂肪體和中胚層神經(jīng)膠質(Wongetal., 2008)；KWMTBOMOD1369和KWMTBOMOD1370的功能與幾丁質相關，可能參與家蠶眠期新表皮的形成(Tangetal., 2010)；KWMTBOMOD1371和KWMTBOMOD1373與家蠶體內(nèi)視黃醇的合成代謝有關，視黃醇有促進生長發(fā)育，增加抵抗力的作用(Sharifetal., 2020)；KWMTBOMOD1376主要功能與家蠶的先天免疫有關(Lietal., 2021)；KWMTBOMOD1382與細胞中營養(yǎng)物質、無機離子和藥物的吸收和運輸有關(Sunetal., 2017)；在哺乳動物中，KWMTBOMOD1383和KWMTBOMOD1384的同源基因與組織器官發(fā)育以及腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(崔雅璐等, 2018)；KWMTBOMOD1385在有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級聯(lián)反應中發(fā)揮重要作用(Nakagamietal., 2004)。在哺乳動物中，KWMTBOMOD1389, KWMTBOMOD1394和KWMTBOMOD1395的同源基因與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(Yanagawaetal., 2011)；KWMTBOMOD1379, KWMTBOMOD1380和KWMTBOMOD1386與家蠶體內(nèi)的能量代謝和神經(jīng)發(fā)育有關，推測這3個基因是家蠶sc突變體的候選基因。

續(xù)表4 Table 4 continued

3 討論

本研究將目的基因sc初步定位在SSR標記S2930-363和S2930-289之間(圖4)，定位區(qū)間內(nèi)包含33個候選基因(表4)。目前，精細定位遇到一些困難，S2930-334和S2930-305在BC1M群體內(nèi)未出現(xiàn)交換個體。原因之一可能是定位區(qū)間內(nèi)存在多個調控基因，影響了精確定位的結果，吳美娜等(2020)在淡紅卵突變體rep的定位研究中發(fā)現(xiàn)rep除了受控于目的基因rep-1外，還受到該連鎖群上紅卵突變體突變基因MFS基因的影響，因此，推測突變體sc的性狀可能由定位區(qū)間內(nèi)的多個基因協(xié)調控制。其次，郭軍等在空間誘變條件下意大利蜜蜂Apismelliferaligustica和卡尼鄂拉蜂Apismelliferacarnica后代的波動性不對稱研究中，發(fā)現(xiàn)連續(xù)自交和空間誘變會導致蜜蜂后代的波動性不對稱增加(Sheridan and Pomiankowski, 1997; 郭軍和羅其花, 2009)，而突變體sc在飼養(yǎng)過程中的確出現(xiàn)了發(fā)育不齊的情況，這給選育sc純合系帶來了困難。今后將繼續(xù)培養(yǎng)sc純合系，并組配更大的作圖群體，進行進一步的精細定位。

目前，已發(fā)現(xiàn)的矮小蠶突變體有：矮小蠶Df(幼蟲發(fā)育遲緩，有隱性致死作用，連鎖群不明)、辻田小蠶Df-t(γ射線照射而得，純合體胚胎期致死，突變基因定位在20號連鎖群11.0 cM座位)、K矮小蠶dw-k(幼蟲體型小，發(fā)育遲緩，突變基因定位在11號連鎖群0.0 cM座位)、致死矮小蠶dw(1齡幼蟲第3天起發(fā)育緩慢，不能就眠，呈油蠶狀，幼蟲期純合致死，連鎖群不明)、矮小不眠蠶nm-d(幼蟲1齡不能就眠，在第10日死亡，突變基因定位在9號連鎖群，但其座位不明)等(呂鴻聲, 1991)。代方銀等(2009)發(fā)現(xiàn)了一種新的體形突變體——短體蠶Sq，并將其定位在家蠶第14連鎖群。sc的突變基因不同于已發(fā)現(xiàn)的矮小蠶突變基因。根據(jù)前人的研究發(fā)現(xiàn)一些參與生長調控基因的信息，通過比較分析初步篩選出3個候選基因KWMTBOMOD1379, KWMTBOMOD1380和KWMTBOMOD1386。KWMTBOMOD1379和KWMTBOMOD1380在NCBI數(shù)據(jù)庫中的注釋信息為家蠶線粒體中的丙酮酸脫氫酶復合體(pyruvate dehydrogenase complex, PDC)中的乙酰轉移酶成分，PDC催化丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，參與三羧酸循環(huán)，決定著生物體內(nèi)營養(yǎng)成分的分配(Naitoetal., 1998)，該基因的缺陷會導致代謝障礙，組織受損(崔玉娟和劉曉晴, 2007)，果蠅致死突變體之一即為PDC功能缺失的突變體(Spradlingetal., 1999)。KWMTBOMOD1386在NCBI數(shù)據(jù)庫中標注為家蠶神經(jīng)肽前體蛋白K5[B.moriputative neuropeptide precursor protein(K5), BmK5]，它存在于家蠶大腦和額神經(jīng)節(jié)特定細胞的細胞質中，可能參與了幾種神經(jīng)肽的合成(Mitsumasuetal., 2009)。Deng等(2014)利用RNAi技術降低家蠶神經(jīng)肽F受體(neuropeptide F receptor, NPFR)表達量之后，發(fā)現(xiàn)家蠶食桑量減少，體重顯著下降。王平陽等發(fā)現(xiàn)紫色類鶉斑突變體的突變基因為BmOrk，該神經(jīng)肽的突變同時導致了突變體發(fā)育不齊，食桑量少等性狀(Wangetal., 2019)。后續(xù)將克隆這些候選基因，并設計RNAi實驗以驗證基因功能，來闡明小繭突變的分子機制。

本研究中，sc作為一種新的矮小蠶突變體，具有體形短而瘦的顯著表型特征，并且性狀可以穩(wěn)定遺傳。生物體的體型控制是一個復雜的過程，科研工作者在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、煙草天蛾Manducasexta和家蠶等昆蟲的研究中，發(fā)現(xiàn)激素和營養(yǎng)信號通路中的許多基因參與了體型大小的調控(Mirth and Riddiford, 2007; Nijhout, 2015)。張忠杰等利用基因編輯技術敲除家蠶保幼激素關鍵代謝酶基因BmJHE后，家蠶幼蟲發(fā)育時間延遲，使得家蠶體型變大(Zhangetal., 2017)。我們用保幼激素處理5齡幼蟲，未能拯救突變體回復，初步排除JH合成通路基因突變的可能性。今后將對TG和sc進行轉錄組測序，分析導致sc性狀形成的各種通路中的基因差異。