生物傳感器檢測(cè)食物過(guò)敏原的研究進(jìn)展

葉 茂，李 欣，武 涌，陳紅兵，高金燕，文學(xué)方

（1.南昌大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西南昌 330047；3.南昌大學(xué)，中德聯(lián)合研究院，江西南昌 330047；4.江西省科學(xué)院，應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

食物過(guò)敏是由于機(jī)體攝入某些特定食物蛋白引發(fā)的不良免疫反應(yīng)，臨床上屬于變態(tài)反應(yīng)[1?2]。它影響全世界5%的成人和8%的兒童。食物過(guò)敏原通常是水溶性或鹽溶性糖蛋白。目前，已有來(lái)自123個(gè)物種的358個(gè)蛋白被鑒定為食物過(guò)敏原[3]，根據(jù)過(guò)敏原的一級(jí)結(jié)構(gòu)、交叉反應(yīng)性和相似的生物學(xué)功能分為不同的家族，表1列出了部分重要的植物源性和動(dòng)物源性的過(guò)敏原家族。攝入過(guò)敏原較短的時(shí)間內(nèi)，患者會(huì)出現(xiàn)明顯的過(guò)敏癥狀，如皮膚紅疹、呼吸困難、消化不良、腹痛等，也可能出現(xiàn)嚴(yán)重的全身性過(guò)敏反應(yīng)[4?5]，但至今仍沒(méi)有對(duì)食物過(guò)敏有效的治療手段[6]，唯一的辦法就是采取一定的措施使過(guò)敏患者避免攝入含有過(guò)敏原的食物。2012年，我國(guó)實(shí)施《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》（GB7718-2011），鼓勵(lì)企業(yè)自愿標(biāo)示過(guò)敏原成分以保護(hù)消費(fèi)者，但由于制造商對(duì)過(guò)敏原標(biāo)簽法意識(shí)缺乏，食物中出現(xiàn)未標(biāo)注的過(guò)敏原成分的情況仍時(shí)有發(fā)生，這對(duì)過(guò)敏患者來(lái)說(shuō)是一個(gè)巨大的隱患，也是形成進(jìn)出口貿(mào)易壁壘的原因之一[7]，故開(kāi)發(fā)快速、靈敏、可重現(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法對(duì)食物過(guò)敏的預(yù)防和控制具備重大意義[5?6]。

生物傳感器作為一類(lèi)新興的檢測(cè)方法，具有快速、高靈敏度、高度自動(dòng)化、實(shí)時(shí)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛用于農(nóng)藥殘留、病原微生物以及食物過(guò)敏原等方面的檢測(cè)[8–10]。它主要通過(guò)生物識(shí)別元件對(duì)食物中的過(guò)敏原識(shí)別并產(chǎn)生響應(yīng)，再由換能器轉(zhuǎn)化為可定量的光電信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。本文從原理、優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用等方面對(duì)國(guó)內(nèi)外用于檢測(cè)食物過(guò)敏原的生物傳感器方法進(jìn)行了闡述和總結(jié)，并進(jìn)一步指出目前生物傳感器在食物過(guò)敏原檢測(cè)方面存在的不足之處以及今后的發(fā)展方向，為食物過(guò)敏原快速檢測(cè)方法的建立提供參考。

1 食物過(guò)敏原檢測(cè)方法

食物過(guò)敏原傳統(tǒng)/標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法主要分為以下三類(lèi)：分子生物學(xué)檢測(cè)方法，這類(lèi)方法通過(guò)對(duì)過(guò)敏食物特異性DNA進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)[11–13]，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等。由于DNA在熱處理和高壓下保持較長(zhǎng)時(shí)間的完整性，所以該方法比較穩(wěn)定、自動(dòng)化程度高，但不能檢測(cè)特定的過(guò)敏原蛋白，只能瞄準(zhǔn)其表達(dá)的特征DNA片段，DNA含量與蛋白含量沒(méi)有量效關(guān)系，且蛋白才是主要導(dǎo)致過(guò)敏的“元兇”，所以PCR技術(shù)適合檢測(cè)核酸含量高的樣品，如花生、堅(jiān)果、大豆、魚(yú)和甲殼等[13?15]；免疫學(xué)檢測(cè)方法，該類(lèi)方法基于抗原抗體之間的特異性結(jié)合，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫印跡等，其中ELISA法是應(yīng)用范圍最廣的檢測(cè)方法[16–18]，其具備特異性強(qiáng)、靈敏度高、適合大批量樣本檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但由于食品加工方法、人員操作和實(shí)驗(yàn)試劑的影響，ELISA容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果、可重復(fù)性差；色譜學(xué)檢測(cè)方法，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrograph，LC-MS/MS）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等[19–22]，其中LC-MS/MS法是我國(guó)于2019年實(shí)施的推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 38163-2019中規(guī)定的方法，可對(duì)牛奶、雞蛋、大豆等食品中的部分過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)。該法通過(guò)對(duì)過(guò)敏原的特征肽段進(jìn)行鑒定來(lái)明確識(shí)別過(guò)敏原，但不適用于實(shí)時(shí)分析且設(shè)備的高昂成本可能會(huì)限制其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。以上三類(lèi)方法已經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，具有一定的優(yōu)越性，同時(shí)也存在局限性，如需專(zhuān)業(yè)人士操作、難以現(xiàn)場(chǎng)化常規(guī)化檢測(cè)等，而生物傳感器作為一類(lèi)近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的方法，具有響應(yīng)快速、高度自動(dòng)化、部分傳感器支持現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已成為熱點(diǎn)研究的領(lǐng)域，在食物過(guò)敏原快速檢測(cè)上十分具有潛力。

表 1 常見(jiàn)的食物過(guò)敏原及其家族[5]Table 1 Examples of major class food allergens[5]

2 生物傳感器的原理及其應(yīng)用

生物傳感器由生物識(shí)別元件、換能器和光電信號(hào)放大裝置等部分組成（圖1）。生物識(shí)別元件是精確捕獲目標(biāo)物質(zhì)的關(guān)鍵，不同的生物分子（如抗體、細(xì)胞等）和仿生分子（如適配體）都可用作過(guò)敏原的生物識(shí)別元件（圖2）。當(dāng)生物識(shí)別元件與待測(cè)樣品相互作用產(chǎn)生化學(xué)信號(hào)，換能器將其轉(zhuǎn)換為可定量檢測(cè)的光電信號(hào)，再經(jīng)過(guò)分析系統(tǒng)進(jìn)行放大，從而對(duì)待測(cè)物定性及定量分析[22?24]。其中，換能器是生物傳感器至關(guān)重要的組成部分，也是20世紀(jì)90年代以來(lái)許多團(tuán)隊(duì)想要突破和創(chuàng)新的地方[25]。本文根據(jù)換能器的種類(lèi)，將生物傳感器分為光學(xué)生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器及壓電免疫生物傳感器進(jìn)行介紹，并在表2中總結(jié)了不同類(lèi)型的生物傳感器的基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)，表3列舉了用于檢測(cè)牛乳過(guò)敏原β-乳球蛋白的光學(xué)生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器的研究實(shí)例，可以更加清晰直觀地比較各類(lèi)傳感器的差異。

圖 1 生物傳感器工作原理Fig.1 Working principle of biosensor

圖 2 生物識(shí)別元件與受體結(jié)合示意圖Fig.2 Schematic diagram of the binding of biological recognition element and receptor

2.1 光學(xué)生物傳感器

光學(xué)生物傳感器通過(guò)識(shí)別待測(cè)物與生物受體相互作用后對(duì)光學(xué)結(jié)構(gòu)表面的有效折射率、熒光或者顏色等的變化實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的檢測(cè)[39–41]，依據(jù)檢測(cè)信號(hào)的不同分為以下三類(lèi)：共振增強(qiáng)吸收（resonance enhanced absorption，REA）、熒光、表面等離子共振（surfaceplasmon resonance，SPR）[28?29]。表4中列舉了基于REA、熒光、SPR光學(xué)傳感器的基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)。這三類(lèi)傳感器都具備響應(yīng)速度快、無(wú)需標(biāo)識(shí)且光學(xué)元件抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但REA生物傳感器制作工藝復(fù)雜，熒光生物傳感器雖靈敏度高但不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，SPR生物傳感器檢測(cè)限相對(duì)較低。此外，大多數(shù)光學(xué)傳感器的檢測(cè)都需要二次再檢測(cè)。

2.1.1 基于REA的光學(xué)生物傳感器 當(dāng)抗原與金簇抗體在免疫芯片的光學(xué)透明距離層的表面上結(jié)合時(shí)，金納米粒子沉積在反射鏡上方的光學(xué)近場(chǎng)中，產(chǎn)生了共振增強(qiáng)吸收現(xiàn)象，通過(guò)光學(xué)傳感器可觀察到強(qiáng)烈的顏色效應(yīng)[42]。REA生物傳感器與納米金屬探針聯(lián)用可以得到更強(qiáng)的REA信號(hào)，其具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)損傷分析等優(yōu)點(diǎn)，但僅有極少的貴金屬粗糙面才具有共振增強(qiáng)現(xiàn)象，且其制作工藝復(fù)雜難以標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性較差。Hohensinner等[29]研制了一種基于REA的新型光學(xué)生物傳感器，用金簇標(biāo)記的抗β-乳球蛋白抗體與過(guò)敏原結(jié)合，建立了在奶粉中檢測(cè)β-乳球蛋白的方法。Maier等[42]將過(guò)敏原涂覆在芯片上，去捕獲金納米粒子標(biāo)記的抗體，實(shí)現(xiàn)了卵清蛋白和卵類(lèi)粘蛋白的檢測(cè)，檢測(cè)限（limit of detection，LOD）為1 ng/mL。隨后，其又研制了一款基于REA的光學(xué)生物傳感器去檢測(cè)經(jīng)熱處理后的β-乳球蛋白的致敏性，結(jié)果顯示β-乳球蛋白和抗體結(jié)合能力在95 ℃處理20 min和90 ℃處理60 min后仍未喪失，但抗原性降低[30]。

2.1.2 基于熒光的光學(xué)生物傳感器 通過(guò)熒光信號(hào)分子與待測(cè)物結(jié)合時(shí)，熒光團(tuán)內(nèi)在的光物理特性被激活，進(jìn)而釋放出熒光信號(hào)，根據(jù)熒光強(qiáng)度的變化對(duì)待測(cè)物中的過(guò)敏原含量進(jìn)行檢測(cè)[43]，其具有分析時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但熒光信號(hào)分子的熒光壽命以秒為單位，并且需要特定的儲(chǔ)存條件，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Jiang等[44]開(kāi)發(fā)了以大鼠肥大細(xì)胞（RBL-2H3）為傳感介質(zhì)的熒光傳感器，來(lái)鑒定和檢測(cè)魚(yú)類(lèi)過(guò)敏原小清蛋白（parvalbumin，PV）。通過(guò)高效的脂質(zhì)介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染程序，將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）質(zhì)粒導(dǎo)入肥大細(xì)胞中以獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的RBL-2H3肥大細(xì)胞株，再使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察RBL-2H3細(xì)胞受過(guò)敏原刺激后的熒光強(qiáng)度變化。該法的線(xiàn)性范圍為1~100 ng/mL，LOD為0.35 ng/mL。álvarez等[32]用鏈霉親和素包裹的量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）標(biāo)記二抗來(lái)放大信號(hào)，并通過(guò)熒光傳感器檢測(cè)β-乳球蛋白，LOD為33.7 ng/mL。Chen等[45]使用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選出了乳鐵蛋白的兩個(gè)裂解適配體，將它們的結(jié)構(gòu)優(yōu)化成一種新型的雙結(jié)合位點(diǎn)分裂適配體，再將二價(jià)適配體分別與信號(hào)分子異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）和納米粒子Ag10連接，最后基于熒光偏振法（fluorescence polarization，F(xiàn)P）的光學(xué)傳感器檢測(cè)奶粉中乳鐵蛋白。通過(guò)使用了適配體和Ag10，大大提升了傳感器的靈敏度，比傳統(tǒng)的光學(xué)傳感器高3個(gè)數(shù)量級(jí)，LOD為0.02 ng/mL。隨后，Shi等[35]也將一種新型的熒光納米材料碳點(diǎn)（carbon dots）與適配體相結(jié)合，成功建立了低致敏配方乳制品中β-乳球蛋白的檢測(cè)方法，該方法的LOD為0.037 ng/mL。最近，Phadke等[46]利用核糖體展示技術(shù)篩選出兩個(gè)抗αs-酪蛋白熒光肽適配體Cas1和Cas2，通過(guò)PEG24在Cas1的N端進(jìn)行修飾，可以抑制β-乳球蛋白的熒光，同時(shí)增強(qiáng)αs-酪蛋白存在下的熒光，LOD為1008 ng/mL，與免疫層析試劑盒所需的15 min相比，基于熒光肽適配體傳感器的檢測(cè)時(shí)間僅要20~25 s，熒光適配體具有更加顯著的識(shí)別能力和潛在的應(yīng)用前景。

表 2 檢測(cè)食物過(guò)敏原的生物傳感器的基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)Table 2 Pros cons and principles of various biosensors for detection of food allergens

表 3 生物傳感器在牛乳過(guò)敏原β-乳球蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用Table 3 Application of biosensors in the detection of milk allergen β-lactoglobulin

表 4 檢測(cè)食物過(guò)敏原的光學(xué)傳感器的基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)Table 4 Pros cons and principles of optical biosensors for detection of food allergens

2.1.3 基于SPR的光學(xué)生物傳感器 當(dāng)消逝波穿過(guò)金屬薄膜時(shí)，金屬薄膜表面固定生物識(shí)別元件與其表面捕獲的食物過(guò)敏原的界面處發(fā)生表面等離子體共振（SPR）現(xiàn)象，傳感器實(shí)時(shí)記錄光折射率的變化，通過(guò)判斷食物過(guò)敏原與其受體的吸附和解離情況來(lái)定量食物過(guò)敏原（圖3）[47?52]。目前，表面等離子體共振（SPR）生物傳感已被開(kāi)發(fā)用于蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定，它對(duì)食物過(guò)敏原、有毒蛋白質(zhì)、抗體和藥物蛋白質(zhì)等具有極高的敏感性、無(wú)需標(biāo)識(shí)、能輕松地監(jiān)控各種生物分子相互識(shí)別的實(shí)時(shí)變化，但靈敏度不高，檢測(cè)限偏低[53?54]。Billakanti等[31]開(kāi)發(fā)了基于SPR生物傳感器定量測(cè)定加工過(guò)的牛乳樣品、乳清餾分和各種奶源產(chǎn)品中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、乳鐵蛋白和IgG的方法，平均含量為8.0×105、4.0×106、2.1×105、1.2×105和4.8×105ng/mL，且與HPLC測(cè)出的結(jié)果之間的決定系數(shù)R2>0.97，但存在靈敏度低的缺點(diǎn)，需要提升傳感器的性能。于是，Pollet等[50]將磁性納米顆粒與光纖平臺(tái)結(jié)合到一起，通過(guò)磁性納米顆粒增強(qiáng)傳感信號(hào)，利用光纖SPR傳感器快速準(zhǔn)確地檢測(cè)花生過(guò)敏原Ara h 1，將LOD提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，為90 ng/mL。Angelopoulou等[51]將微流控芯片與SPR光學(xué)傳感器結(jié)合，既可以縮短反應(yīng)時(shí)間，又能減少樣品消耗。通過(guò)電動(dòng)傳輸樣品并引導(dǎo)樣品到特定的位置，可同時(shí)檢測(cè)酪蛋白、花生蛋白、大豆蛋白和醇溶蛋白四種不同食物過(guò)敏原，檢測(cè)時(shí)間為6.5 min，LOD分別為40、1.0×103、800和100 ng/mL，與ELISA檢測(cè)結(jié)果一致，且成本更低。最近，Zhou等[47]研制了一款檢測(cè)原肌球蛋白（tropomyosin，TM）的傳感器，將抗TM的單克隆抗體修飾在金標(biāo)生物芯片表面，通過(guò)SPR傳感器進(jìn)行定量檢測(cè)，該方法檢測(cè)十分迅速，僅需3 min即可準(zhǔn)確檢測(cè)出不同貝類(lèi)中TM的含量。

圖 3 基于SPR生物傳感器的食物過(guò)敏原實(shí)時(shí)定量檢測(cè)工作原理[47]Fig.3 Principle of an SPR biosensor for food allergen real-time detection[47]

2.2 電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器將生物識(shí)別元件固定在電極表面，與識(shí)別到的待測(cè)物結(jié)合，從而引起電極上的電阻、電勢(shì)或電流等的變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的檢測(cè)[51?52]，根據(jù)最終檢測(cè)信號(hào)的不同大致可分為阻抗法、安培法和伏安法[53-54]。表5中列舉了基于阻抗法、安培法和伏安法電化學(xué)傳感器的基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)，其具有預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、便攜、易于操作、適用于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，但重復(fù)性不好、電極表面易鈍化和待測(cè)樣本受表面電活性物質(zhì)干擾等缺點(diǎn)。電化學(xué)生物傳感器對(duì)成分復(fù)雜以及帶有顏色的樣品的檢測(cè)尤其適用，被認(rèn)為是最有前途的分析工具之一[54?55]。

2.2.1 阻抗法 阻抗法電化學(xué)生物傳感器是將生物識(shí)別元件固定在電極表面，當(dāng)其與待測(cè)物結(jié)合時(shí)，引起電極表面阻抗值的變化來(lái)測(cè)定目標(biāo)物[56–57]。這類(lèi)傳感器的制備過(guò)程簡(jiǎn)易，穩(wěn)定性好，由于方法學(xué)的限制，它不能同時(shí)對(duì)多種物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行分析。阻抗測(cè)量常分為兩種：非法拉第阻抗和法拉第阻抗，前者可以在沒(méi)有氧化還原對(duì)存在的情況下進(jìn)行檢測(cè)，在電化學(xué)生物傳感器中應(yīng)用較少，后者必須在有氧化還原對(duì)存在下才能測(cè)定。電化學(xué)阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）是法拉第阻抗，它通過(guò)測(cè)定固體電解質(zhì)的電導(dǎo)率、電極表面的電子傳遞阻抗等，從而獲得生物分子之間相互作用的結(jié)果。Sun等[40]以花生過(guò)敏原Ara h 1寡核苷酸為探針，探針的5′端用硫醇標(biāo)記，3′端用生物素標(biāo)記，通過(guò)硫醇親和力形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，將探針連接到金電極表面來(lái)改良阻抗型電化學(xué)DNA傳感器的靈敏度和選擇性，同時(shí)用EIS測(cè)量了探針與電極之間電子轉(zhuǎn)移效率的變化，該法LOD為2.22×10?5ng/mL。Jiang等[28]將肥大細(xì)胞與阻抗型電化學(xué)傳感器結(jié)合，通過(guò)模擬過(guò)敏原在體內(nèi)細(xì)胞中的生理效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)過(guò)敏原的檢測(cè)。肥大細(xì)胞的表面有大量Fc受體，可以選擇性結(jié)合IgE或IgG抗體，當(dāng)它與致敏原相結(jié)合后將觸發(fā)脫顆粒，引起組胺、5-羥色胺和β-己糖胺酶等化學(xué)介質(zhì)的釋放，從而轉(zhuǎn)化為可以很容易記錄和量化的信號(hào)。該課題組通過(guò)此方法構(gòu)建了檢測(cè)河蝦原肌球蛋白Pen a 1的方法，該法的LOD為150 ng/mL。隨后，研究者們又結(jié)合微流控芯片技術(shù)及巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)進(jìn)行微流控細(xì)胞培養(yǎng)、食物過(guò)敏原誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)變化和高通量過(guò)敏原的分析測(cè)定[58]。

2.2.2 安培法 安培法電化學(xué)生物傳感器是當(dāng)工作電極的電位恒定時(shí)，待測(cè)物在電極表面或其修飾層內(nèi)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生的電流隨時(shí)間的變化來(lái)定量分析反應(yīng)中的電活性物質(zhì)[59]。這類(lèi)傳感器因?yàn)槠潆姌O的輸出信號(hào)直接和待測(cè)物的濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，成為研究最多、應(yīng)用最廣的一類(lèi)電化學(xué)傳感器，但重復(fù)性差。Sun等[60]制備了電化學(xué)DNA傳感器檢測(cè)花生過(guò)敏原Ara h 1，用安培法監(jiān)測(cè)DNA雜交，通過(guò)在電極上涂覆一層殼聚糖-多壁碳納米管復(fù)合材料和酶聯(lián)放大生物分子的電化學(xué)反應(yīng)活性，以此來(lái)提高靈敏度，增大動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)范圍，該法LOD為8.26×10?7ng/mL，線(xiàn)性范圍為2.48×10?6~7.94×10?5ng/mL。Ruiz-Valdepe?as等[61]使用羧酸修飾的磁珠固定酶標(biāo)記的抗體，用安培法電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)α-乳白蛋白，其LOD達(dá)到0.011 ng/mL。Angulo-Ibá?ez等[62]首次開(kāi)發(fā)了一款基于磁珠修飾捕獲抗體的夾心安培型電化學(xué)傳感器去檢測(cè)蝦TM。通過(guò)磁珠修飾捕獲抗體，可以使用外部磁鐵進(jìn)行快速和簡(jiǎn)單的分離，從而減少分析時(shí)間，提高在樣本中捕獲TM的效率，最大限度地減少了基質(zhì)效應(yīng)[63]，其LOD為0.0469 ng/mL。該傳感器簡(jiǎn)化了樣品制備過(guò)程，無(wú)需純化或濃縮階段，可直接在食品工業(yè)中進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)常規(guī)過(guò)敏原分析。

2.2.3 伏安法 伏安法電化學(xué)生物傳感器是通過(guò)將生物識(shí)別元件固定在電極表面，目標(biāo)物質(zhì)與之結(jié)合后引起電極表面電活性物質(zhì)發(fā)生改變，根據(jù)峰電流強(qiáng)度和濃度的關(guān)系準(zhǔn)確定量，濃度越高，峰電流越大[37]。它具有制作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、可同時(shí)分析多種分析物，但靈敏度較阻抗法偏低。Cao等[64]利用聚-L-精氨酸/多壁碳納米管（P-L-Arg/MWCNTs）復(fù)合膜對(duì)玻碳電極進(jìn)行改性，通過(guò)納米金（AuNPs）來(lái)修飾電極來(lái)促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移、提高電極電導(dǎo)率和結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而放大反應(yīng)[65]。該團(tuán)隊(duì)建立了一種基于循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）和差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）電化學(xué)傳感器檢測(cè)牛乳中酪蛋白的方法，線(xiàn)性范圍為102~104ng/mL，LOD為50 ng/mL。López等[66]研制了一種響應(yīng)面分析法與DPV電化學(xué)傳感器結(jié)合檢測(cè)Ara h 2的方法。通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化了捕獲探針和巰基己醇（間隔物）的濃度，使得傳感器的分析性能得到了提升，LOD為0.17 ng/mL。Alves等[67]通過(guò)兩種單克隆抗體來(lái)建立夾心型伏安法電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)食品中的Ara h 6，其線(xiàn)性范圍為1~100 ng/mL，LOD為0.27 ng/mL，該法被應(yīng)用于復(fù)雜食品基質(zhì)如餅干和巧克力中Ara h 6的檢測(cè)。隨后，Kokkinos等[68]開(kāi)發(fā)了一種基于量子點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性伏安法傳感器用來(lái)檢測(cè)酪蛋白和免疫球蛋白G（IgG）。該方法的線(xiàn)性范圍分別為0~5×103和0~2×103ng/mL，LOD分別為20和40 ng/mL，該法被應(yīng)用于牛乳摻假問(wèn)題的檢驗(yàn)。

表 5 檢測(cè)食物過(guò)敏原的電化學(xué)傳感器的基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)Table 5 Basic principle, advantages and disadvantages of electrochemical biosensors for detection of food allergens

2.3 壓電免疫傳感器

壓電免疫生物傳感器通常將抗體固定在晶體表面，壓電晶體在振蕩時(shí)存在一個(gè)基礎(chǔ)頻率，當(dāng)抗原抗體結(jié)合時(shí)，質(zhì)量增加，晶片的振蕩頻率會(huì)相應(yīng)減少，通過(guò)減少值與吸附量之間的相關(guān)性對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量分析[69]。它的優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好、檢測(cè)時(shí)間短、無(wú)需標(biāo)識(shí)即可實(shí)現(xiàn)免疫檢測(cè)，可用于表征生物分子相互作用。石英晶體是最為常用的壓電晶體，Sun等[70]首次將基于石英晶體微天平（quartzcrystalmicrobalance，QCM）的壓電免疫傳感器檢測(cè)蝦過(guò)敏原Pen 1；觀察傳感器表面特異性抗體結(jié)合時(shí)的振動(dòng)變化，其LOD為333 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間僅需10 min，可重復(fù)使用13次以上。Chu等[71]將金納米粒子（AuNPs）固定在QCM電極表面，再將雞抗醇溶蛋白抗體直接固定在AuNPs修飾的表面，通過(guò)壓電免疫傳感器檢測(cè)醇溶蛋白與抗體結(jié)合時(shí)頻率的變化，該方法的靈敏度大為提 高，LOD為8 ng/mL。隨 后，F(xiàn)unari等[72]將QCM傳感器與光子固定技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)食品中的醇溶蛋白，這種技術(shù)通過(guò)紫外線(xiàn)照射選擇性還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵，把抗體定向固定在QCM表面上，10 min內(nèi)即可完成對(duì)實(shí)際樣品中提取物的分析，該法的LOD為4×103ng/mL。

3 結(jié)論與展望

食物過(guò)敏原的檢測(cè)與食品生產(chǎn)、標(biāo)識(shí)及風(fēng)險(xiǎn)管理等息息相關(guān)，是確保食品安全的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，且微量的過(guò)敏原即可引發(fā)食物過(guò)敏反應(yīng)，因此高靈敏度和低檢出限的生物傳感器非常適合用于食物過(guò)敏原的檢測(cè)。本文論述了光學(xué)、電化學(xué)和壓電免疫生物傳感器在檢測(cè)食物過(guò)敏原的最新進(jìn)展，基于目前檢測(cè)食物過(guò)敏原的生物傳感器所存在的缺陷，未來(lái)的改進(jìn)方向主要集中在以下幾個(gè)方面：食品樣本基質(zhì)效應(yīng)大，如何從包含大量干擾成分的復(fù)雜食品基質(zhì)中成功提取目的過(guò)敏蛋白，避免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，是樣本制備的挑戰(zhàn)之一；雖然便攜式食品評(píng)估技術(shù)越來(lái)越熱門(mén)，但是目前大多數(shù)生物傳感器檢測(cè)平臺(tái)仍依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)室，若能將智能手機(jī)作為傳感器的現(xiàn)場(chǎng)控制或者分析工具，開(kāi)發(fā)強(qiáng)大的智能手機(jī)應(yīng)用程序，提供快速傳輸和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)功能，將大大提高生物傳感器的便攜性和可操作性；當(dāng)前大部分的生物傳感器中生物識(shí)別元件僅能識(shí)別一到兩種過(guò)敏原，而實(shí)際生產(chǎn)中需要同時(shí)對(duì)多種過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)，高通量快速檢測(cè)是生物傳感器發(fā)展的重要方向之一；由于納米材料（如金納米粒子、量子點(diǎn)和石墨烯等）具有放大信號(hào)、易于分離和良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，在生物傳感器中廣泛使用以提升性能，如何進(jìn)一步探索開(kāi)發(fā)新型納米材料用于超靈敏檢測(cè)食物過(guò)敏原也是十分有必要的；強(qiáng)效有毒的化學(xué)物質(zhì)作為固定材料會(huì)限制部分生物傳感器的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，尋找天然材料部分或完全替代這些有毒化學(xué)物質(zhì)且滿(mǎn)足檢測(cè)要求是一個(gè)可行的改進(jìn)方向，如加強(qiáng)天然橡膠、硬明膠膠囊和玉米醇溶蛋白等材料等在其中的應(yīng)用。

生物傳感器檢測(cè)是一類(lèi)多學(xué)科交叉融合的新興技術(shù)，它的易操作、響應(yīng)快速及樣品用量少等特性仍具有較大的優(yōu)勢(shì)?？梢灶A(yù)見(jiàn)，研發(fā)出微型、智能、環(huán)保和高通量的生物傳感器來(lái)監(jiān)控食品加工過(guò)程中的過(guò)敏原交叉污染，能夠幫助食品生產(chǎn)企業(yè)、食品加工商和食品安全監(jiān)管部門(mén)，保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，為快速現(xiàn)場(chǎng)定量檢測(cè)食品中的過(guò)敏原提供可靠的分析方法，具有很好的應(yīng)用前景。