程桂廣，張 靜，楊美蓮，李俊華，陳 婷，趙天瑞，曹建新，開國銀

(1.昆明理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650500;2.云南西草生物科技開發(fā)有限公司，云南 昆明 650500;3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310053)

免疫系統(tǒng)是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答和免疫功能、抵御病原菌侵害的重要系統(tǒng).它通過識(shí)別抗原而做出免疫應(yīng)答來維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)[1].淋巴細(xì)胞作為最重要的免疫細(xì)胞可分為T和B淋巴細(xì)胞.T淋巴細(xì)胞表面抗原主要是MHC抗原和CD分子，機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答時(shí)其通過分泌各類炎癥因子，輔助B細(xì)胞增殖分化成抗體，參與體液免疫，共同維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[2].然而T或B淋巴細(xì)胞的過度活化會(huì)導(dǎo)致一系列的自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等.目前臨床上常用的免疫抑制藥物主要有糖皮質(zhì)激素類免疫抑制藥物、化學(xué)免疫抑制藥物如硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、來氟米特和甲氨蝶呤等一些來自真菌代謝產(chǎn)物的免疫抑制藥物如他克莫司、環(huán)孢菌素、雷帕霉素、霉酚酸酯、咪唑立賓，以及從中草藥中提取的免疫抑制藥物如FTY720(冬蟲夏草的有效成分ISP-1經(jīng)化學(xué)修飾改造后的產(chǎn)物)和雷公藤等[3].但大多數(shù)的該類免疫抑制劑由于嚴(yán)重的副作用及對機(jī)體的有一定的耐藥性因而不能廣泛的應(yīng)用于臨床.因此，從天然產(chǎn)物中開發(fā)并尋找安全有效的免疫抑制藥物顯得尤為重要.

思茅藤屬(Epigynum)是夾竹桃科夾竹桃亞科(Apocynoideae)思茅藤族(Epigyneae)的一個(gè)屬.據(jù)記載，該屬植物大約有14個(gè)種，分布于馬來西亞和緬甸等熱帶地區(qū)，在中國只有思茅藤(Epigynumauritum)一種，產(chǎn)于云南南部西雙版納和景洪等地.思茅藤是傣族作為清熱、解毒和消腫止痛的民間用藥植物，其樹皮主要用于治療跌打損傷、肢體關(guān)節(jié)痛及頸腰椎病等[4].關(guān)于思茅藤的植物化學(xué)研究表明，該植物富含結(jié)構(gòu)多樣的甾體類化合物，且大多數(shù)具體較好的免疫抑制活性[5-8].其中Epigynosides E、Epigynosides F和Epigynosides G在 50 μmol/L 時(shí)的免疫抑制效果與地塞米松相當(dāng)[9].為了更好的開發(fā)和利用植物資源，從思茅藤植物中尋找有效的活性物質(zhì)，文中通過D101大孔吸附樹脂對思茅藤提取物進(jìn)行不同極性部分劃分，并利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UHPLC-MS/MS)對其進(jìn)行主要化學(xué)成分分析，結(jié)合免疫抑制活性結(jié)果，確定最佳活性部位，并考察對細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞周期變化的情況，為進(jìn)一步開發(fā)高效的活性物質(zhì)提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000超高效液相色譜儀(Thermo Scientific公司，美國)；乙腈、甲醇(質(zhì)譜純，Merck公司，德國)；甲酸(色譜純，Sigma-Aldrich公司)；超純水用Milli-Q系統(tǒng)制備(Millipore，美國)；SpectraMax M5 酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，美國)；SB5200D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；刀豆蛋白A(Con A)和脂多糖(LPS)(Sigma公司，美國)；CCK-8試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；小鼠ELISA測定試劑盒(IL-6，TNF-α)(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清和RPMI培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司).

1.2 思茅藤粗提物及不同極性混合物制備

思茅藤樣品于2018年4月采自云南普洱，經(jīng)昆明理工大學(xué)曹建新教授鑒定并保存于昆明理工大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院功能食品實(shí)驗(yàn)室(憑證標(biāo)本：Cheng20180412-01).思茅藤地上部分經(jīng)自然晾干后粉碎，稱取一定量的干燥粉狀樣品用70%乙醇水(料液比為1∶10)進(jìn)行超聲輔助提取3次，每次提取 30 min.收集提取液，經(jīng) 4 000 g 離心 10 min 后合并提取液上清部分，在 50 ℃ 下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸發(fā)濃縮，得到思茅藤提取物浸膏.經(jīng)冷凍濃縮機(jī)凍干后得到思茅藤乙醇粗提取物(CE).

參照文獻(xiàn)[10]的方法，CE通過D101型大孔吸附樹脂進(jìn)行極性段劃分.D101型大孔樹脂用乙醇浸泡過夜進(jìn)行活化，用蒸餾水清洗樹脂至無醇味后備用.將樹脂裝好柱后浸膏用蒸餾水完全溶解后上樣，待樣品吸附完全后，進(jìn)行梯度洗脫.流動(dòng)相依次為 MeOH∶H2O(0∶100，20∶80，40∶60，60∶40，80∶20和100∶0，V/V)，每個(gè)梯度清洗5個(gè)柱體積，洗脫完全后合并各極性部分的樣品，經(jīng)濃縮后得到6個(gè)組分樣品，分別為：Fr.0%，20%，40%，60%，80%和100%，并保存于 4 ℃ 下備用.

1.3 思茅藤各極性部分主要化學(xué)成分分析

將上述得到的思茅藤粗提物及不同極性部分混合物用質(zhì)譜級甲醇完全溶解后，過 0.22 μmol/L 的有機(jī)膜，使用安捷倫C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.9 μm)通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行化學(xué)組成分析.其中液相分離條件為：柱溫 35 ℃，進(jìn)樣量 2 μL，流速 0.2 mL/min.流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序?yàn)?～5 min，10%～15% B；5～10 min，5%～20% B；10～20 min，20%～40% B；20～25 min，40%～60% B；25～27 min，60% B；27～33 min，10%～60% B.質(zhì)譜條件：負(fù)離子模式，質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～1 000，分辨率 70 000，毛細(xì)管溫度 320 ℃，電壓 3.3 kV，鞘氣流速 32 L/min，輔助氣流流速 8 L/min.

1.4 免疫抑制活性實(shí)驗(yàn)

SPF級雄性BALB/c小鼠，體重18～24 g，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部(證號編號：SYXK, 2011-0004)，飼養(yǎng)在(23±2)℃、濕度50%～60%的SPF級動(dòng)物飼養(yǎng)房中.

1.4.1 免疫抑制指數(shù)的測定

參照文獻(xiàn)[11]的方法，將BALB/c小鼠經(jīng)安樂死后，放入無菌超凈工作臺(tái)中，進(jìn)行大體解剖.取出小鼠脾臟置于預(yù)冷的PBS中，輕輕晃動(dòng)清洗除去脂肪及結(jié)締組織.轉(zhuǎn)移脾臟至RPMI不完全培養(yǎng)基中通過0.075 0 mm目不銹鋼過濾篩網(wǎng)進(jìn)行研磨得到細(xì)胞，并進(jìn)行2次過濾除去多余組織.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中輕輕吹散開，并于 1 000 r/min 下離心 5 min 得到細(xì)胞沉淀，加入 3 mL 的紅細(xì)胞裂解液(Tris-NH4Cl)裂解細(xì)胞，裂解完全后用預(yù)冷的PBS清洗2遍即得脾細(xì)胞.用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，并按照如下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：

空白組 120 μL RPMI完全培養(yǎng)基；

陰性對照組 100 μL 脾細(xì)胞懸液+20 μL RPMI完全培養(yǎng)基；

模型組 100 μL 脾細(xì)胞懸液+10 μL Con A +10 μL RPMI完全培養(yǎng)基；

樣品組 100 μL 脾細(xì)胞懸液+10 μL Con A +10 μL 不同濃度樣品.

每組5個(gè)復(fù)孔，于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48 h.用CCK-8法測細(xì)胞的增殖情況，使用酶標(biāo)儀在 450 nm 處檢測各孔OD值，并按照以下公式進(jìn)行刺激指數(shù)值(SI)的計(jì)算：

B淋巴細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)將Con A(終質(zhì)量濃度為 10 μg/mL)換成LPS(終質(zhì)量濃度為 20 μg/mL)，重復(fù)上述步驟即可.

1.4.2 細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的測定

按照上述2.3.1的方法制備得到脾細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，并將其培養(yǎng)至24孔板中，按照上述方法進(jìn)行加樣并培養(yǎng) 48 h 后，10 000 r/min 離心 5 min 得到細(xì)胞培養(yǎng)上清液.按照ELISA測定試劑盒說明書的方法測定IL-6和TNF-α的含量.

1.4.3 細(xì)胞周期分布情況的測定

碘化丙啶(Propidium，PI)可染色細(xì)胞中的雙鏈DNA，產(chǎn)生熒光，且熒光的強(qiáng)度與雙鏈DNA的含量呈正相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的雙鏈DNA被PI染色后，可以用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行DNA含量的測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，進(jìn)行細(xì)胞周期分布分析.本研究參照之前的報(bào)道方法使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期分布情況進(jìn)行測定[12].具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

按照上述2.3.1的方法將細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，培養(yǎng) 48 h 后，小心吸取細(xì)胞至離心管中，經(jīng)離心得到細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷的PBS清洗2遍后，用少量的PBS重懸細(xì)胞.將 2 mL 預(yù)冷的75%乙醇溶液中逐滴加入上述的細(xì)胞懸液(冰上操作)，并輕輕吹打細(xì)胞使其分散均勻，于 4 ℃ 固定過夜.固定好后離心除去乙醇，并用PBS再次清洗細(xì)胞.參照細(xì)胞周期測定試劑盒的方法，使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期分布情況進(jìn)行測定.

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示(n=3)，對實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較的t檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)定為p<0.05.繪圖和數(shù)理統(tǒng)計(jì)等使用Origin 8.5軟件處理.

2 結(jié)果與討論

2.1 思茅藤不同極性部分主要化學(xué)成分分析

UHPLC-MS/MS對思茅藤提取物及不同極性部分中的化學(xué)成分進(jìn)行分析，其總離子流圖見圖1.通過與Massbank數(shù)據(jù)庫、標(biāo)準(zhǔn)品以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的一級和多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對思茅藤提取物主要化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)，鑒定結(jié)果如表1所示.共鑒定出24個(gè)化合物，包括6個(gè)多酚，5個(gè)黃酮、11個(gè)甾體化合物和2個(gè)其他類型化合物.

圖1 思茅藤粗提物和不同極性部分提取物液質(zhì)分析總離子流圖

表1 思茅藤粗提物及不同極性部分主要化學(xué)成分

高速逆流色譜法、模擬移動(dòng)床(SMB)色譜、衍生化技術(shù)、硅膠柱層析法等在植物甾醇和黃酮類化合物等非極性或弱極性物質(zhì)的分離和制備中有較廣泛的應(yīng)用[13].但由于實(shí)驗(yàn)條件、設(shè)備要求高以及資源浪費(fèi)等問題，很難實(shí)現(xiàn)高效分離及工業(yè)化應(yīng)用.大孔樹脂作為色譜法的吸附介質(zhì)，耐酸耐堿性好，穩(wěn)定性好，可再生后可重復(fù)使用，在甾體類化合物的分離純化中有較為廣泛的應(yīng)用.從思茅藤粗提物(CE)的總離子流中發(fā)現(xiàn)思茅藤提取物除了含較多小分子酸以外，化合物16(Androst-4,6,8(9),13(14)-tetraene-3,11,16-trione)有較高的峰面積，為該植物的主要化學(xué)成分.而經(jīng)D101大孔樹脂進(jìn)行極性段劃分后，不同極性部分提取物含有的化合物種類有較大的差異(表1).Fr.0%部分含有以葡萄糖酸等小分子酸為主的少量化合物.而Fr.20%～40%段化合物含有較多的多酚、黃酮等酚類化合物，其中Fr.20%部分的主要化成成分為綠原酸(5)，其顯示出最大的峰面積.Fr.60%和80%部分富含較多的木犀草苷、山奈酚及其他的一些酚類物質(zhì).此外，F(xiàn)r.80%段提取物還富含以Androst-4,6,8(9),13(14)-tetraene-3,11,16-trione(16)為主的甾體類化合物.而Fr.100%部分極性較小，富含的化合物以均以雄甾烷及其衍生物為主.

雄甾烷類化合物缺少統(tǒng)一的裂解規(guī)律，一般以丟失甲基、水分子為主，其他裂解必須涉及母核斷裂.而含糖苷的孕甾烷類化合物主要是糖苷的丟失，以及失去五元環(huán)的3個(gè)碳原子和C17的側(cè)鏈，最多還能再失去1個(gè)H原子.以化合物15(Epigycoisde B，孕甾烷)和化合物16(Androst-4,6,8(9),13(14)-tetraene-3,11,16-trione，雄甾烷)為例，在化合物15中，2個(gè)糖苷的斷裂，分別得到m/z145.029 2 和 177.064 4 的碎片，在進(jìn)一步電子的轟擊下會(huì)造成母核的斷裂，得到m/z303.049 4 的二級碎片.由于碳碳雙鍵容易質(zhì)子化，化合物16中，4位和8位上的雙鍵經(jīng)過質(zhì)子化后會(huì)造成母核的斷裂，主要得到m/z211.111 7 和m/z192.093 0 離子片段.除了帶糖苷的孕甾烷由于糖苷鍵的斷裂易得到糖苷片段以外，雄甾烷和孕甾烷均沒有固定的裂解規(guī)律，只能通過判斷某些母核的斷裂情況以及糖苷的質(zhì)譜結(jié)果去確定其部分結(jié)構(gòu)，卻很難通過液質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析[14]，因此化合物17～19和21均被鑒定為雄甾烷衍生物.

2.2 思茅藤提取物對脾細(xì)胞的增殖抑制活性

T和B淋巴細(xì)胞表面存在可以識(shí)別抗原的受體，當(dāng)受到特異性抗原刺激時(shí)，均會(huì)發(fā)生增殖現(xiàn)象.刀豆蛋白 A(Concanavalin A, Con A)能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子并且作為一種有絲分裂原能夠選擇性的激活T淋巴細(xì)胞增殖[15-16]；脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)則是一種可選擇性激活B細(xì)胞增殖的有絲分裂原，能夠促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞增殖并促使其產(chǎn)生抗體[17].因此，本研究根據(jù)這2種有絲分裂原的特異性，參照之前的方法建立脾細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑱z測思茅藤及不同極性部分提取物對其的影響，評價(jià)思茅藤不同極性部分提取物的免疫抑制活性.

刺激指數(shù)(SI)是評價(jià)細(xì)胞增殖活性的一個(gè)指標(biāo)，SI的高低反映了T/B淋巴細(xì)胞增殖率的高低[18].結(jié)果如圖2和3所示，經(jīng)Con A或LPS刺激后小鼠脾細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的增殖反應(yīng)，其SI值均大于4(空白組為1).而思茅藤粗提物及不同極性部分化合物均能夠不同程度地抑制Con A誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞以及LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖，與模型組(0 μg/mL)相比有顯著性差異(p<0.05)，且抑制能力呈現(xiàn)劑量依賴性上升.值得注意的是Fr.100%部分提取物對于該增殖的抑制效果最為明顯，其免疫抑制活性與陽性藥物地塞米松相當(dāng)，而Fr.0%部分提取物的抑制活性最差，對于LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖沒有抑制活性.

2.3 思茅藤提取物抑制炎癥因子的產(chǎn)生

T細(xì)胞按照其產(chǎn)生細(xì)胞因子的種類分為Th1和Th2細(xì)胞，其中Th1細(xì)胞主要分泌TNF-α、IL-2、IL-12和IFN-γ等細(xì)胞因子[19]，參與細(xì)胞免疫和遲發(fā)型超敏反應(yīng)；Th2細(xì)胞主要分泌IL-6、IL-5、IL-4和IL-10等細(xì)胞因子輔助B細(xì)胞增殖分化成抗體，主要參與體驗(yàn)免疫[20].在本研究中，我們分別將Th1細(xì)胞分泌的TNF-α和Th2細(xì)胞分泌的IL-6作為研究目標(biāo)，評價(jià)思茅藤提取物對Con A刺激的T淋巴細(xì)胞中過量炎癥因子分泌情況的影響.結(jié)果如下圖4所示，經(jīng)過Con A刺激后，淋巴細(xì)胞中TNF-α和IL-6的產(chǎn)生量均顯著上升(p<0.05)，而經(jīng)過思茅藤不同極性部分的提取物干預(yù)后呈現(xiàn)不同程度的抑制效果.其中Fr.0%～Fr.60%部分提取物對該類炎癥因子的產(chǎn)生均無明顯抑制活性(p>0.05)，而粗提取物(CE)、Fr.80%和Fr.100%部分的干預(yù)對于該趨勢有顯著的抑制活性(p<0.05)，其中Fr.100%抑制效果最為顯著.該結(jié)果表明思茅藤提取物的免疫抑制活性物質(zhì)主要集中在Fr.100%部分.而在利用大孔樹脂進(jìn)行極性段劃分時(shí)，大多數(shù)的酚酸及酚類物質(zhì)已在極性較大的Fr.0%～Fr.60%中被分離，F(xiàn)r.80%和Fr.100%段只剩下極性較小的少量酚類物質(zhì)和大量的甾體類成分.前期研究顯示，化合物16(Androst-4,6,8(9),13(14)-tetraene-3,11,16-trione)在 10 μg/mL 濃度下的免疫抑制活性與地塞米松類似[21]，即化合物16可能為思茅藤提取物的主要活性成分之一.然而液質(zhì)分析結(jié)果顯示其在Fr.100%段提取物中的含量很低，但該段提取物的免疫抑制活性卻明顯優(yōu)于Fr.80%段，這意味著除化合物16以外，思茅藤提取物中仍存在其他的有較強(qiáng)免疫抑制活性的甾體類化合物，且主要集中在Fr.100%段.

圖2 思茅藤粗提物和不同極性部分提取物對 圖3 思茅藤粗提物和不同極性部分提取物對 小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響 小鼠B淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖4 思茅藤粗提物和不同極性部分提取物對Con A刺激的小鼠脾細(xì)胞IL-6和TNF-α分泌的影響

2.4 思茅藤Fr.100%段對Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞分裂周期的影響

細(xì)胞周期由間期和分裂期組成，其正常規(guī)律分布是生命活動(dòng)正常進(jìn)行的基本保證.其中間期包括G0/G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)和G2/M期(DNA合成后期)，細(xì)胞增殖抑制主要發(fā)生該分裂期[22-23].上述研究結(jié)果表明思茅藤不同極性部分提取物中Fr.100%段顯示出最強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖抑制活性，因此，選擇其作為研究對象，進(jìn)一步通過細(xì)胞周期分布情況的測定對思茅藤提取物的免疫抑制活性機(jī)制進(jìn)行初步探究.結(jié)果如圖5所示，空白對照組的小鼠T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng) 48 h 后大多數(shù)細(xì)胞處于DNA合成前期(G0/G1期)，未進(jìn)入分裂周期，而經(jīng)過Con A刺激后，G0/G1期細(xì)胞量顯著減少，而G2/M期的細(xì)胞量顯著增加(p<0.05)說明大量細(xì)胞在受刺激后進(jìn)入分裂周期并發(fā)生明顯的增殖現(xiàn)象[24].然而在思茅藤提取物作用下，大多數(shù)細(xì)胞仍停滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，因此處于G2/M期細(xì)胞的數(shù)量顯著降低(p<0.05)，說明Fr.100%的思茅藤提取物抑制T淋巴細(xì)胞增殖可能是通過誘導(dǎo)G0/G1期停滯，從而抑制T淋巴細(xì)胞向G2/M期分裂的進(jìn)程，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[25].該結(jié)果與之前報(bào)道的從小花思茅藤(Epigynum cochinchinensis)中分離得到的甾體化合物Epigycoside E對Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖抑制效果相同[12].

圖5 思茅藤Fr.100%部分對T淋巴細(xì)胞增殖周期的影響

3 結(jié)語

本研究通過D101大孔吸附樹脂對是思茅藤提取物進(jìn)行不同極性段劃分，并對6個(gè)不同極性部分的提取物進(jìn)行免疫抑制活性評價(jià).結(jié)果顯示思茅藤粗提物富含甾體類化合物，且主要集中在Fr.80-100%極性段.不同極性部分提取物對Con A和LPS刺激的T和B淋巴細(xì)胞均有一定的增殖抑制活性，其中，粗提物、Fr.80%和Fr.100%能顯著抑制Con A刺激的TNF-α和IL-6的分泌，且Fr.100%的抑制效果最強(qiáng).通過對細(xì)胞分裂周期情況的測定發(fā)現(xiàn)該抑制活性主要通過阻斷T淋巴細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞向G2/M期分裂增殖，但其作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入探討.