吳珊

[關(guān)鍵詞] 漿液性癌;惡性腹水;GRB7;BRCA

[中圖分類號] R737.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）16-0012-04

Correlation analysis between GRB7 protein and BRCA gene expression in ascites of patients with serous ovarian carcinoma

WU Shan

Department of Obstetrics and Gynecology， Xianning Maternal and Child Health Hospital in Hubei Province， Xianning 437000， China

[Abstract] Objective To explore the relationship between GRB7 protein expression and BRCA gene mutation in ascites tumor cells of patients with serous ovarian carcinoma and its clinical significance. Methods From July 2017 to June 2020， cancerous ascites in 31 patients with serous ovarian cancer were collected. The expression of GRB7 protein was detected by Immunohistochemistry（IHC）. The BRCA gene mutation status was detected by high-throughput next-generation sequencing （NGS）. The correlation between the two was analyzed based on clinical characteristics. Results The positive expression rate of GRB7 protein in the ascites of 31 patients with serous ovarian carcinoma was 51.6% （16/31）. The positive expression rate of GRB7 was correlated with distant metastasis of patients（P<0.05）， but it was not related to age， lymph node metastasis， surgery， andradiotherapy/chemical/targeted therapy（P>0.05）. The BRCA gene mutation rate was 22.6%（7/31）， including 5 cases of BRCA1 mutation and 2 cases of BRCA2 mutation.GRB7 correlated with the results of BRCA （r=0.79， P<0.05）. Conclusion Serous cancer ascites cell wax block is a reliable source of specimens for GRB7 protein and BRCA gene detection. GRB7 protein expression is correlated with BRCA gene mutation， and it is a potential treatment and prognostic target for serous ovarian cancer.

[Key words] Serous carcinoma; Malignant ascites; GRB7; BRCA

漿液性癌為卵巢最常見的上皮性惡性腫瘤，病死率占所有婦科惡性腫瘤的首位[1]。當(dāng)晚期漿液性癌發(fā)生腹腔播散后往往失去手術(shù)機(jī)會，以鉑類和紫杉醇為基礎(chǔ)的化學(xué)治療在此取得了一定的效果，但由于患者無法耐受和易短期復(fù)發(fā)等因素，嚴(yán)重影響臨床應(yīng)用前景，而具有選擇性高、副作用少、作用精準(zhǔn)的分子靶向藥物為此提供了新的方向[2]。卵巢漿液性癌與BRCA基因的關(guān)系密切，其陽性表達(dá)被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤發(fā)生的重要因素，可以作為臨床制定個(gè)性化治療方案、預(yù)后評估和隨訪的重要依據(jù)[3]。2017版中國婦產(chǎn)科專家共識[4]推薦，所有的卵巢癌無論其年齡及有無家族史，均需要進(jìn)行BRCA基因檢測。而GRB7蛋白的過表達(dá)被認(rèn)為與乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生存在著重要的聯(lián)系，正成為新的研究熱點(diǎn)[5]。本研究以卵巢漿液性癌患者惡性腹腔積液（Malignant peritoneal effusion，MPE）細(xì)胞學(xué)為研究對象，探討卵巢漿液性癌患者M(jìn)PE中的GRB7蛋白表達(dá)與BRCA基因突變的相關(guān)性及其臨床意義，為細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的臨床分子學(xué)檢測和卵巢漿液性癌MPE患者的個(gè)體化診療方案提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2017年7月至2020年6月經(jīng)病理形態(tài)學(xué)及免疫組化確診為卵巢漿液性癌的31例MPE患者，年齡34～72歲，中位年齡56歲，同時(shí)記錄患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有無手術(shù)切除及放/化/靶向治療等情況。

1.2 標(biāo)本的制備

新鮮MPE倒入50 mL試管高速離心，盡可能多地收集腫瘤細(xì)胞沉渣，酒精固定后，常規(guī)取材、包埋制成細(xì)胞學(xué)蠟塊。

1.3 免疫組化及抗體

GRB7為美國Agilent公司產(chǎn)品（工作濃度1∶100）。高年資技師常規(guī)石蠟4 μm切片，采用SP法按照GRB7試劑說明書規(guī)范操作，以磷酸鹽緩沖液和正常卵巢組織為陰性對照，陽性切片為陽性對照。GRB7陽性為棕黃染色，定位于包膜和胞質(zhì)。按腫瘤細(xì)胞表達(dá)的陽性占比和強(qiáng)度分別計(jì)數(shù)，其中（2+～3+）認(rèn)為表達(dá)陽性，（0～1+）認(rèn)為表達(dá)陰性。

1.4 NGS測序

QIAamp DNA FFPE DNA 抽提試劑盒（德國Qiagen公司）按操作說明提取MPE蠟塊基因組DNA;使純度A260/280和濃度分別保持在1.8～2.0 ng/μL和10～15 ng/μL之間;采用二代測序DNA建庫試劑盒（Illumina平臺）構(gòu)建DNA測序文庫，對目標(biāo)DNA片段利用特定的探針進(jìn)行樣本的雜交捕獲;Illumina Miseq 測序平臺進(jìn)行上機(jī)測序，測序讀長和深度為150 bp和>500 X;所得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分析并過濾，最后行生物信息學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)及Fisher精確概率法，相關(guān)性分析采用Logistic回歸分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GRB7蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

31例卵巢漿液性癌MPE細(xì)胞學(xué)蠟塊行石蠟切片和HE染色檢測腫瘤細(xì)胞含量（封三圖1）。免疫組化檢測GRB7結(jié)果顯示（2+～3+）陽性表達(dá)率為51.6%（16/31）（封三圖2），在設(shè)立的正常對照卵巢組織中表達(dá)陰性或弱陽性。GRB7的陽性表達(dá)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性[66.7%（14/21）;20.0%（2/10），P=0.023]，但與年齡（≥50歲）[42.9%（6/14）;58.8%（10/17），P=0.479]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[58.3%（14/24）;28.6%（2/7），P=0.221]、手術(shù)切除[52.9%（9/17）;50.0%（7/14），P=0.578]及放化療及靶向治療[46.7%（7/15）;56.3%（9/16），P=0.431]無明顯相關(guān)性。見表1。

2.2 BRCA基因突變情況

31例卵巢漿液性癌MPE標(biāo)本中，其中7例檢測到BRCA基因突變，總突變率為22.6%，包括無義突變5例和移碼突變2例。其中BRCA1（封三圖3）和BRCA2（封三圖4）基因突變率為分別16.1%（5/31）和6.5%（2/31）。根據(jù)遺傳變異分類指南（ACMGA）和生信分析軟件預(yù)測危害結(jié)果顯示，其中6例為致病性BRCA基因突變，1例為可能致?。ú±?，BRCA1，c.2566T>C）。見表2。

2.3 GRB7蛋白表達(dá)及與BRCA基因的相關(guān)性

31例卵巢漿液性癌MPE標(biāo)本中，GRB7蛋白表達(dá)及與BRCA基因突變率分別為51.6%（16/31）和22.6%（7/31）。兩者均有陽性表達(dá)且一致的有6例，兩者均為陰性表達(dá)的14例;不一致者11例，其中BRCA基因突變而GRB7蛋白表達(dá)陰性的僅1例病例。采用Spearman分析檢驗(yàn)兩者相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，GRB7蛋白表達(dá)與BRCA基因突變水平呈正相關(guān)（r=0.79，P<0.05）。見表3。

3 討論

MPE的成因較為復(fù)雜，據(jù)統(tǒng)計(jì)一半以上的晚期卵巢漿液性癌患者可合并發(fā)生[6]。研究認(rèn)為MPE的發(fā)生與漿液性癌細(xì)胞惡性程度高、黏附性差，極易穿透卵巢包膜形成腹腔內(nèi)廣泛播散種植，同時(shí)易于侵犯脈管，阻塞淋巴管，使淋巴液回流受阻[7]。當(dāng)發(fā)生MPE時(shí)，患者已經(jīng)處于疾病的絕對晚期，往往失去手術(shù)機(jī)會，無法取得活檢組織，失去基因檢測的機(jī)會，而細(xì)胞學(xué)蠟塊技術(shù)為此提供一個(gè)很好的機(jī)會，具有微創(chuàng)性、來源方便、可反復(fù)操作、易于保存等優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步基因檢測和預(yù)后評估提供了便利[8]。GRB7蛋白作為一類生長因子受體結(jié)合蛋白，由535個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，共存在5個(gè)功能區(qū)，能通過SH2結(jié)構(gòu)區(qū)識別磷酸化酪氨酸，激發(fā)腫瘤表面受體和特異性下游信號的耦聯(lián)，調(diào)控下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]。已有研究表明GRB7的過表達(dá)能夠獨(dú)立或協(xié)同其他基因、蛋白參與腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和遷徙，能提高ERK磷酸化和FOXM1的水平，激活高級別卵巢漿液性癌的發(fā)生，而降低GRB7活性能夠顯著地抑制腫瘤細(xì)胞遷移/侵襲、腫瘤生長[10]。BRCA1/2為卵巢漿液性癌的易感基因，BRCA1由1863個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，定位于17q21號染色體上，BRCA2由3418個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，定位于13q12號染色體上[11]。當(dāng)BRCA基因發(fā)生突變后能夠產(chǎn)生截短蛋白，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞重組和修復(fù)缺陷，從而破壞基因組的穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤增殖[12]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BRCA基因突變，同樣也增加了針對DNA雙鏈斷裂和DNA單鏈損傷修復(fù)的PARPi抑制劑對腫瘤的敏感性，針對性的用藥能顯著延長患者的生存周期，而未發(fā)生BRCA基因突變的晚期患者，由于無敏感性的靶點(diǎn)藥物，預(yù)后依然極差[13]。因此，尋找潛在治療和預(yù)后評估的靶點(diǎn)，正成為晚期卵巢漿液性癌研究的熱點(diǎn)。

本研究顯示，在31例卵巢漿液性癌MPE患者中，GRB7蛋白陽性表達(dá)率為51.6%（16/31）。在與臨床特征的關(guān)系上，GRB7蛋白的表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)切除及放化療及靶向治療等因素?zé)o關(guān)，但與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在明顯的相關(guān)性，Wang等[14]應(yīng)用免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)GRB7蛋白與卵巢癌進(jìn)展存在顯著的相關(guān)性，提示GRB7蛋白的高表達(dá)能夠?qū)е履[瘤的侵襲和遷移，GRB7有望成為評判腫瘤的惡性程度及預(yù)后的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。31例卵巢漿液性癌MPE患者中共發(fā)現(xiàn)7例（22.6%）BRCA基因突變，其中BRCA1突變5例，BRCA2突變2例。突變模式均為無義突變和移碼突變（包括插入突變和重復(fù)突變），未發(fā)現(xiàn)其他內(nèi)含子突變。7例突變病例中6例（85.7%）為高致病性突變，1例為可能致病性突變。Eccles等[15]通過大樣本回顧性研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中BRCA基因的綜合突變率約為14.1%，其中的高致病BRCA突變約70%。本研究無論是突變率還是所含高致病性突變率均有升高，這可能與亞洲人群相對于歐美人群卵巢癌BRCA基因胚系細(xì)胞突變率更高[16]或本研究收集的病例為卵巢漿液性癌MPE樣本惡性程度更高有關(guān)。

目前多量的研究證實(shí)，GRB7蛋白和Her2基因在乳腺癌中存在著強(qiáng)相關(guān)性，兩者在腫瘤發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程中具有協(xié)同性，抑制腫瘤細(xì)胞中GRB7的高表達(dá)，可以提高Her2抑制劑的抑制效果[17]。而同樣與乳腺癌密切相關(guān)的GRB7蛋白和BRCA基因的高表達(dá)各自在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。本研究通過分析卵巢漿液性癌MPE中GRB7蛋白表達(dá)及與BRCA基因兩者相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，兩者的相關(guān)度r值為0.79，證實(shí)結(jié)果為正相關(guān)。提示兩者在卵巢漿液性癌的發(fā)生發(fā)展中可能存在協(xié)同和促進(jìn)作用，而通過有效的抑制GRB7的高表達(dá)，或許能提高針對于BRCA的PARPi抑制劑的效果。目前GRB7蛋白或基因的靶向治療還處于實(shí)驗(yàn)階段，但已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)肽結(jié)合磷酸化絡(luò)氨酸能夠通過抑制GRB7表達(dá)來使腫瘤細(xì)胞失去增殖活性，極有可能成為潛在的治療熱點(diǎn)。

綜上所述，卵巢漿液性癌腹水脫落細(xì)胞是GRB7蛋白與BRCA基因檢測的可靠標(biāo)本來源，GRB7的高表達(dá)與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是作為評價(jià)卵巢漿液性癌預(yù)后的指標(biāo)。GRB7蛋白的表達(dá)與BRCA基因突變存在著相關(guān)性，GRB7是卵巢漿液性癌的潛在治療和預(yù)后評估的靶點(diǎn)。然而，由于本次納入研究病例較少，且未進(jìn)一步闡明GRB7與BRCA相互的分子機(jī)制及聯(lián)系，有待于接下來進(jìn)一步大樣本的深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Lisio MA，F(xiàn)u L，Goyeneche A，et al. High-grade serous ovarian cancer： Basic sciences， clinical and therapeutic standpoints[J]. Int J Mol Sci，2019，20（4）：952.

[2] Kansu B，Gardner J，Price-Tate R，et al. BRCA gene testing in women with high-grade serous ovarian carcinoma[J]. J Obstet Gynaecol，2020，23：1-4.

[3] Moschetta M，George A，Kaye SB，et al.BRCA somatic mutations and epigenetic BRCA modifications in serous ovarian cancer[J]. Ann Oncol，2016，27（8）：1449-1455.

[4] 楊佳欣，孔北華，高雨農(nóng)，等.卵巢上皮性癌BRCA基因檢測的中國專家討論[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2017，52（1）：8-10.

[5] 程倩.GRB7在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和臨床意義及與HER2的關(guān)系[J].中國婦幼保健，2020，35（1）：147-149.

[6] Davidson B.The diagnostic and molecular characteristics of malignant mesothelioma and ovarian/ peritoneal serous carcinoma[J]. Cytopathology，2011，22（1）：5-21.

[7] Schwamborn K，Weirich G，Steiger K，et al.Discerning the primary carcinoma in malignant peritoneal and pleural effusions using imaging mass spectrometry-A feasibility study[J]. Proteomics Clin Appl，2019，13（1）：e1 800 064.

[8] Matsui A，Murata Y，Masuda N，et al.Clinical significance of evaluating hormone receptor and HER2 protein using cell block against metastatic breast cancer：A multi-institutional study[J]. Oncotarget，2019，10（55）：5680-5689.

[9] Chu PY，Tai YL，Shen TL.Grb7，a critical mediator of EGFR/ErbB signaling，in cancer development and as a potential therapeutic target[J].Cells，2019，8（5）：435.

[10] Vermehren-Schmaedick A，Mhawech-Fauceglia P，Park BS，et al.The prognostic significance of GRB7 protein expression and localization in human breast and ovarian cancers[J]. Oncotarget，2020，11（24）：2273-2289.

[11] Petrillo M，Marchetti C，De Leo R，et al. BRCA mutational status，initial disease presentation，and clinical outcome in high-grade serous advanced ovarian cancer：A multicenter study[J]. Am J Obstet Gynecol，2017，217（3）：334.e1-334.e9.

[12] Arts-de Jong M，de Bock GH，VAN Asperen CJ，et al.GermLine BRCA1/2 mutation testing is indicated in every patient with epithelial ovarian cancer：A systematic review[J]. Eur J Cancer，2016，61：137-145.

[13] Tan DS，Kaye SB.Chemotherapy for patients with BRCA1 and BRCA2-mutated ovarian cancer：Same or different？[J].Drurs，2015，80：114-121.

[14] Wang Y，Chan DW，Liu VWS，et al. Differential functions of growth factor receptor-bound protein 7 （GRB7） and its variant GRB7v in ovarian carcinogenesis[J]. Clinical Cancer Research，2010，16（9）：2529-2539.

[15] Eccles DM，Balma？觡a J，Clune J，et al. Selecting patients with ovarian cancer for germLine BRCA mutation testing：Findings from guidelines and a systematic literature review[J].Adv Ther，2016，33（2）：129-150.

[16] 劉偉玲，王志中，趙九洲，等.散發(fā)性高級別卵巢漿液性癌的BRCA基因突變及其臨床意義[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2017，52（1）：26-31.

[17] Bivin WW，Yergiyev O，Bunker ML，et al.GRB7 Expression and correlation with HER2 amplification in invasive breast carcinoma[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol，2017，25（8）：553-558.

（收稿日期：2021-01-04）