超高效液相-離子阱質(zhì)譜法測(cè)定保健食品與中成藥中非法添加的10種禁用激素

王衛(wèi)鋼,岳磊（.河南省周口市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心（周口市食品藥品檢驗(yàn)所）,河南 周口 466000;2.鄭州市食品藥品檢驗(yàn)所,河南 鄭州 450000）

雌激素和孕激素是由女性卵巢分泌的最基本的兩個(gè)激素，也是直接導(dǎo)致女性在生理體征上有別于男性的最本質(zhì)的激素[1-2]。常見(jiàn)用于輔助治療青春期子宮異常出血、痛經(jīng)；更年期抑郁癥、心律失常、骨質(zhì)疏松等疾病[3-7]。針對(duì)于檢測(cè)雌激素及孕激素類(lèi)的非法添加的分析方法中，液質(zhì)聯(lián)用法是近期研究的一種主要方向[8]。在此基礎(chǔ)上，我們?cè)谫|(zhì)譜端采用線(xiàn)性離子阱（QTrap）技術(shù)，利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的定量數(shù)據(jù)，在質(zhì)譜方法中添加相關(guān)信息掃描（IDA）與增強(qiáng)離子掃描（EPI），在濃度更低的樣品基礎(chǔ)上，提取更多的質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)，為更準(zhǔn)確的定性提供有效參考。

1 材料

1.1 儀器 超高效液相色譜儀，型號(hào)：ACQUITY UPLC（美國(guó)Waters）；線(xiàn)型離子阱質(zhì)譜分析儀，型號(hào)：4000 QTrap（美國(guó)Sciex）；電子分析天平，型號(hào)：XS205DU（瑞士Mettler Toledo）；超聲波清洗機(jī)，型號(hào)：SB-800DTD（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試劑 對(duì)照品：黃體酮（批號(hào)：10027-201209，純度：99.7%），雌二醇（批號(hào)：100182-201205，純度：96.3%），雌三醇（批號(hào)：100934-201302，純度：97.6%），雌酮（批號(hào)：100949-200501，純度：100.0%），己烯雌酚（批號(hào)：10033-201308，純度：99.5%），戊酸雌二醇（批號(hào)：100063-200904，純度：99.6%）、苯甲酸雌二醇（批號(hào)：100006-200504，純度：100.0%）、尼爾雌醇（批號(hào)：100239-200702，純度：99.4%）、炔諾孕酮（批號(hào)：100028-199907，純度：99.4%）、庚酸炔諾酮（批號(hào)：100988-200901，純度：99.4%）均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件 色譜柱：C O R T E C S U P L C C18（2.1mm×50mm，1.6μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫程序（0-3min，20%→90%A；3-4min，90%A；4-4.1min，90%→20%A；4.1-5min，20%A）；流速：0.3ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1μl。電噴霧離子源（ESI）；正離子模式，MRM-IDA-EPI模式掃描。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 分別稱(chēng)取上述所有對(duì)照品各10mg（精確到0.01mg），分別置于100mL容量瓶，加少量甲醇，震搖使其溶解后再加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液配制 取上述各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制成濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0以及50.0μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 樣品處理 膠囊劑取10粒，將內(nèi)容物完全倒出，研細(xì)混勻，備用；片劑取10粒，研碎后混勻，備用。取樣品約1g（精確到0.0001g）置于50mL容量瓶中，精密加入甲醇20.0mL，超聲處理30min后放置至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4 結(jié)果 10種對(duì)照品的采樣離子對(duì)及相關(guān)質(zhì)譜信息參數(shù)見(jiàn)表1，其總離子流色譜圖（TIC）見(jiàn)圖1，各化合物增強(qiáng)離子掃描（EPI）子離子全掃圖見(jiàn)圖2。在檢測(cè)樣品擁有目標(biāo)對(duì)照品時(shí)，可提取出樣品的二級(jí)子離子圖與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，能夠提供對(duì)比出峰時(shí)間、離子豐度比之外的另一種驗(yàn)證方式。

表1 10種對(duì)照品質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果與方法學(xué)考察

圖1 10種對(duì)照品的TIC色譜圖。01.雌三醇；02.雌二醇；03.雌酮；04.己烯雌酚；05.炔諾酮；06.黃體酮；07.尼爾雌醇；08.苯甲酸雌二醇；09.戊酸雌二醇；10.庚酸炔諾酮

圖2 10種對(duì)照品的EPI子離子圖。01.雌三醇；02.雌二醇；03.雌酮；04.己烯雌酚；05.炔諾酮；06.黃體酮；07.尼爾雌醇；08.苯甲酸雌二醇；09.戊酸雌二醇；10.庚酸炔諾酮

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線(xiàn)性范圍 取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液與對(duì)照品儲(chǔ)備液按上述條件測(cè)定，以待測(cè)物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以待測(cè)物質(zhì)濃度（x，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)作定量工作曲線(xiàn)，得到線(xiàn)性回歸方程，結(jié)果表明，10種雌激素及孕激素對(duì)照品的溶液濃度與測(cè)得的峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.999。具體結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 10種化合物的檢出限、定量限、線(xiàn)性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各5mL，置于50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，照“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示10種化合物（按表1中順序）峰面積的RSD分別為3.0%、3.2%、3.0%、3.8%、1.9%、3.2%、3.1%、2.8%、2.1%、3.6%，表明儀器的精密度符合要求。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 隨機(jī)選取“2.5.2”項(xiàng)下一份混合溶液，避光放置0、2、4、6、8、12h后分別進(jìn)樣，結(jié)果各成分的RSD分別為4.1%、4.8%、4.3%、2.1%、3.5%、3.2%、2.3%、2.6%、2.1%、2.1%，表明該供試品溶液樣品在室溫下12h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.5.4 回收率 取同一批健字號(hào)膠囊，精密稱(chēng)取其顆粒細(xì)粉0.50g，精密加入2.2項(xiàng)下各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.30ml，制備6份加標(biāo)供試品溶液的平行樣，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果顯示，各成分的平均加樣回收率分別為98.7%、99.5%、102.7%、96.4%、97.9%、96.3%、105.7%、101.5%、99.6%、102.1%，其RSD分別為2.4%、2.9%、3.6%、4.6%、5.9%、2.7%、3.1%、2.4%、4.5%、3.3%。

2.6 結(jié)果判斷 若供試品色譜圖出現(xiàn)與對(duì)照品對(duì)應(yīng)離子對(duì)信號(hào)保留時(shí)間均一致的色譜峰，判斷其離子豐度比是否與對(duì)照品一致，再調(diào)用二者EPI圖譜確認(rèn)二者碎片離子分布及強(qiáng)度均一致，則可準(zhǔn)確定性供試品中的添加成分并予以定量分析。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定 按照“2.3”所述方法對(duì)2018-2020年度鄭州市安全評(píng)價(jià)性抽樣的72批抽檢樣品進(jìn)行處理，按照“2.6”項(xiàng)下方法進(jìn)行判斷，結(jié)果顯示各樣品中這10種化合物均未檢出，說(shuō)明抽檢的保健食品及中成藥中暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)這10種化合物的非法添加安全隱患。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 流動(dòng)相：考察甲醇-水、乙腈-水體系在不同梯度下的表現(xiàn)。其中乙腈-水體系可以在最終檢測(cè)時(shí)取得更好的峰型與分離度；采用梯度洗脫使得在總檢測(cè)時(shí)間5min內(nèi)保證目標(biāo)化合物全部出峰，并基本實(shí)現(xiàn)基線(xiàn)分離，有效的減少了檢測(cè)時(shí)間，提高了工作效率。

3.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化 在儀器自動(dòng)優(yōu)化的前提下，選擇適當(dāng)?shù)臐舛炔捎檬謩?dòng)優(yōu)化的方法對(duì)各化合物的質(zhì)譜條件進(jìn)行了進(jìn)一步的調(diào)整。利用儀器的線(xiàn)性離子阱（Q-Trap）功能在第三重四級(jí)桿處進(jìn)行離子富集掃描，可以在較低濃度條件下生成二級(jí)子離子全掃描圖，在定性時(shí)可以進(jìn)行有效的輔助判斷。以此為基礎(chǔ)，未來(lái)可以在選擇更多的激素類(lèi)化合物對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行補(bǔ)充，以進(jìn)一步擴(kuò)大該檢測(cè)方法的適用范圍。