HPLC法同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心草中五種成分的含量

張 艷，丁仿霞，張建永

（遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 遵義 593099）

養(yǎng)心草學(xué)名景天三七（Sedum aizoonL.），又名費(fèi)菜、土三七、養(yǎng)心菜等，為薔薇目景天科的多年生草本植物，具有養(yǎng)心、平肝寧心、滋陰養(yǎng)血、活血止血之功效，在民間廣泛將其作藥食兩用的天然物用于降血脂、降血壓及相關(guān)心臟病的防治，也被稱為“救心草”或“救心菜”，含有多酚類、黃酮類、生物堿、多糖、齊墩果酸、谷甾酸、氨基酸及維生素等成分［1，2］，其中黃酮類成分是養(yǎng)心草的主要有效成分，研究表明養(yǎng)心草總黃酮有抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)血脂以及抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用［3，4］。所以測(cè)定養(yǎng)心草中黃酮類成分的含量可以對(duì)養(yǎng)心草的質(zhì)量進(jìn)行初步控制，為養(yǎng)心草總黃酮的進(jìn)一步研究提供質(zhì)量保證。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，對(duì)養(yǎng)心草質(zhì)量控制研究多是對(duì)其總黃酮或單一黃酮成分的含量測(cè)定［5-8］，未達(dá)到中草藥多成分質(zhì)量控制的要求。此外，梁泰剛等［9］、嚴(yán)勁松［10］分別采用HPLC法測(cè)定了養(yǎng)心草中2～3種黃酮類成分，本研究在已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過對(duì)提取方法、色譜條件的優(yōu)化，擬建立能夠準(zhǔn)確、靈敏、快速同時(shí)測(cè)定養(yǎng)心草中槲皮素、槲皮苷、蘆丁、楊梅苷、山奈酚5種化學(xué)成分含量的方法，對(duì)養(yǎng)心草的質(zhì)量進(jìn)行初步控制，為養(yǎng)心草藥食同源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Agilient Technologies 1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；HH-S6水浴鍋，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；KQ-300VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海雅榮生化儀器廠。

1.1.2 藥材與試劑 養(yǎng)心草全草采自遵義市新洲鎮(zhèn)，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)張建永副教授鑒定為景天三七，楊梅苷（PS001009）、槲皮苷（PS000433）、槲皮素（PS010462）、山柰酚（PS001201）、蘆丁（PS002032）對(duì)照品均購自成都普思生物科技有限公司，純度>98%；甲醇，色譜純，OCEA NPAK公司；磷酸，分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取楊梅苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚對(duì)照品適量，分別置10 mL容量瓶，甲醇溶解定容，制備得濃度依次為2.2、0.25、1.6、0.16、0.28 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取養(yǎng)心草全草，粉碎，過四號(hào)篩，稱取本品粉末約1.0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加入25 mL 50%甲醇溶液，稱定重量，90℃加熱回流30 min，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

1.2.3 色譜條件 采用Gemini-Nx3μ-C18110A Phe?nomenex（150 mm×3.0 mm，3μm）色譜柱，流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，35%A；20～34.5 min，35%～36%A；34.5～35 min，36%～37%A；35～42.5 min，37%A；42.5～43 min，37%～54%A；43～49.5 min，54%A；49.5～50 min，54%～90%A；50～58.5 min，90%A；58.5～59 min，90%～35%A；59～64 min，35%A），流速0.4 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量測(cè)定的方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 色譜圖 在“1.2.3”項(xiàng)的色譜條件下分別進(jìn)樣5種黃酮混合對(duì)照品儲(chǔ)備液和養(yǎng)心草提取液進(jìn)行色譜分析，得到圖1。

2.1.2 線性與范圍 依次精密量取楊梅苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于10 mL容量瓶，50%甲醇溶解定容，得到濃度依次為550、400、125、8、14μg/mL的混合對(duì)照品溶液，再依次量取混合對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL至10 mL容量瓶，50%甲醇溶解定容，得到系列濃度的混合對(duì)照品溶液，以峰面積y對(duì)濃度x（μg/mL）做回歸曲線，回歸方程、回歸系數(shù)和范圍見表1。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 按“1.2.2”的方法制備供試品溶液，HPLC法連續(xù)進(jìn)樣6次，5種成分色譜峰面積的RSD值 分 別 為0.19%、0.67%、0.63%、1.83%、1.97%，說明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“1.2.2”的方法制備供試品溶液，在0、4、8、12、16、24 h分別進(jìn)樣分析，5種成分峰面積的RSD值分別為1.05%、2.71%、2.14%、3.54%、4.01%，說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按“1.2.2”的方法制備供試品溶液6份，HPLC法進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，5種成分含量的RSD值分別為1.40%、1.50%、2.03%、2.15%、3.08%，說明方法的重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的養(yǎng)心草約0.5 g，按低、中、高（每個(gè)梯度3份）分別加入適量對(duì)照品溶液，按“1.2.2”的方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。5種成分的平均加樣回收率為95.61%～107.38%，RSD為1.37%～4.60%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.7 樣品含量測(cè)定 按“1.2.2”的方法制備供試品溶液6份，采用HPLC法進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算5種成分的含量，結(jié)果見表3。由表3可知，RSD均小于5%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

表3 含量測(cè)定結(jié)果

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn) 以養(yǎng)心草中5種成分的總含量為考察指標(biāo)，分別比較提取溶劑（30%、50%、70%、90%）、提取溫度（70、80、90、100℃）和提取時(shí)間（20、30、60、90、120 min）對(duì)5種成分含量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，5種成分的總提取率分別在提取溶劑為50%甲醇、提取溫度為90℃、提取時(shí)間為30 min時(shí)最高。

2.2.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素與水平表見表4，結(jié)果見表5。由表5可知，3因素對(duì)5種成分總量的影響程度為提取溶劑>提取溫度>提取時(shí)間，提取時(shí)間過長(zhǎng)使苷類化合物的含量下降，結(jié)合單因素試驗(yàn)來看，綜合考慮養(yǎng)心草中5種黃酮類化合物的最佳提取條件為A2B2C2，即提取溶劑為50%甲醇、提取溫度90℃、提取時(shí)間30 min。

表4 正交試驗(yàn)因素與水平

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

除試驗(yàn)采取的加熱回流提取方法外，還對(duì)比考察了冷浸提取法和超聲提取法，通過試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，加熱回流提取方法較超聲提取穩(wěn)定，提取率較冷浸法高，所以選擇加熱回流為試驗(yàn)的提取方法。

在流動(dòng)相的選擇中，分別篩選了甲醇-0.2%乙酸水、甲醇-0.2%甲酸水、甲醇-0.2%磷酸二氫鉀水、甲醇-0.2%磷酸水等系統(tǒng)，通過峰形、分離度、理論塔板數(shù)等對(duì)比，最后選用甲醇-0.2%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫；對(duì)色譜柱進(jìn)行篩選ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）、Phenomenex Gemini-Nx3μ-C18110A（150mm×3.0 mm，3μm），最后選用Gemini-Nx3μ-C18110A（150 mm×3.0 mm，3μm），分離效果較好，流速小，節(jié)約試劑；篩選檢測(cè)波長(zhǎng)254、256、360和370 nm，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm，各成分的含量及峰形較穩(wěn)定。

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)篩選出養(yǎng)心草中5種黃酮類成分（楊梅苷、蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚）的最優(yōu)提取工藝，建立了以HPLC法為檢測(cè)手段，同時(shí)測(cè)定5種成分含量的方法，方法準(zhǔn)確可靠，為養(yǎng)心草的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。