李雪燕 熊典廣 田呈明

(北京林業(yè)大學林學院 北京 100083)

楊樹(Populus)腐爛病是一種分布廣泛、危害嚴重的世界性楊樹枝干病害，其主要病原菌金黃殼囊孢(Cytosporachrysosperma)是一種腐生或弱寄生性真菌，適應能力強、寄主范圍廣且長期潛伏感染，防治困難(陳洪珠, 2013; 閆騰飛, 2016)。在我國北方，楊樹腐爛病每年都會造成嚴重的經(jīng)濟和生態(tài)損失(Adamsetal., 2006; Wangetal., 2015)。目前，有關該病害的病原菌系統(tǒng)學、病害發(fā)生周期、流行病學、組織病理學和防控技術等方面已有很多研究(Biggsetal., 1983; Guyonetal., 1996; 李東, 2010; Fanetal., 2013)，而關于楊樹腐爛病菌與寄主的分子互作機制卻鮮有報道(Suetal., 2018; Yuetal., 2019; Wang, 2020)。

病原菌在侵染過程中釋放水解酶、毒素、激素等毒力因子，降低宿主植物的防御能力甚至殺死宿主，從而促進病原菌對宿主細胞的滲透和定殖(Kamounetal., 2006; Guanetal., 2020)。病原菌的這些毒力因子需要通過胞內的囊泡運輸系統(tǒng)進行轉運及分泌。囊泡運輸過程通常包括4個基本步驟： 出芽、轉運、錨定和融合(賈美慧等， 2012)，參與這一過程的許多蛋白已經(jīng)被鑒定出來，如可溶性N-乙基順丁基酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNAREs)、Sec1/Munc18家族(SM)蛋白、Rab GTPases和胞外分泌復合體(Kinchetal., 2006; Stenmark, 2009)。在細胞骨架動力蛋白將囊泡運送到質膜附近之后，且SNARE復合物形成之前，拴系過程開始發(fā)生。一系列的拴系相關蛋白，包括Rab-GTP以及多亞基復合物等均參與囊泡融合，目前對胞外分泌復合體(exocyst)在植物病原菌囊泡融合過程中的功能研究多。胞外分泌復合體是由8個亞基(Sec3、Sce5、Sce6、Sce8、Sce10、Sec15、Exo70和 Sec84)組成的(Lipschutzetal., 2002)，其中Exo70亞基是介導運輸囊泡與目的質膜錨定的關鍵因子。Exo70在植物病原真菌的發(fā)育、形態(tài)、致病性及細胞壁降解酶的分泌中發(fā)揮重要作用(Chenetal., 2015)?；颐共【?Botrytiscinerea)BcExo70的缺失導致其在生長、菌核的產生、毒力和細胞壁降解酶的分泌等方面表現(xiàn)出明顯的缺陷(Guanetal., 2020)。稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)Exo70參與調控胞質效應子分泌到生物營養(yǎng)界面(biotrophic interfacial complex，BIC)的非傳統(tǒng)外泌途徑，這與通過ER-Golgi途徑分泌質外體效應子的機制不同(Giraldoetal., 2013)。

Exo70及其他胞外分泌復合體亞基已經(jīng)在多種真菌中的研究證明它們在真菌生長、形態(tài)和致病性中發(fā)揮著重要作用，但在楊樹腐爛病菌中還未見Exo70相關的研究報道。本文以楊樹腐爛病菌中胞外分泌復合體亞基CcExo70為研究對象，利用分子生物學手段對其在生長發(fā)育、脅迫響應、內吞作用和致病性等方面的功能展開研究，為深入了解楊樹腐爛病菌致病機制及抗病育種和新型病害防控策略的制定提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

楊樹腐爛病菌野生型菌株(wild type，WT)是由本實驗室采集、鑒定并保藏于中國林業(yè)微生物菌種保藏中心(保藏號為 CFCC 89981)。本實驗室初步完成了該菌株的全基因組測序、組裝及基因功能注釋(accession number： JAEQMF000000000)。CcExo70的敲除突變體及回補菌株均由本試驗獲得。

1.2 CcExo70的序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)筆者實驗室構建的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Exo70的氨基酸序列在楊樹腐爛病菌本地全基因組數(shù)據(jù)庫中進行Blastp分析，獲得其同源的CcExo70氨基酸序列。其他真菌物種的Exo70同源序列下載于GenBank數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)和JGI數(shù)據(jù)庫(https:∥mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/home)。使用ClustalX2.0進行多序列比對(Jeanmouginetal., 1998)，利用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹(Tamuraetal., 2013)。

1.3 CcExo70突變體及回補菌株的獲得

使用Split-marker的方法對CcExo70基因進行敲除，采用PEG介導的遺傳轉化法將重組片段導入野生型原生質體中，原生質體再生于含有25 μg·mL-1潮霉素的TB3瓊脂培養(yǎng)基，并利用含有35 μg·mL-1潮霉素的PDA進行覆蓋篩選(劉玲玲等, 2017)。利用引物External-Exo70for/External-Exo70rev和Internal-Exo70for/Internal-Exo70rev對生長出來的轉化子進行PCR篩選。

利用引物CcExo70Compfor/CcExo70Comprev進行PCR擴增獲得包括CcExo70啟動子在內的整個編碼區(qū)作為ΔCcExo70-8的回補片段，將得到的回補片段連同含有編碼遺傳霉素(G418)抗性基因的T質粒共同轉化至ΔCcExo70-8菌株的原生質體中，原生質體再生于含有60 μg·mL-1遺傳霉素的TB3瓊脂培養(yǎng)基，并利用含有75 μg·mL-1遺傳霉素的PDA進行覆蓋篩選。利用Internal-Exo70for/Internal-Exo70rev對生長出來的轉化子進行PCR篩選。本文所涉及的引物見表1。

表1 引物序列Tab.1 List of primers

1.4 CcExo70的基本生物學表型測定

1.4.1CcExo70敲除突變體的營養(yǎng)生長及菌絲形態(tài)測定 為了分析野生型、突變體及回補菌株營養(yǎng)生長的差異，分別取直徑3 mm的各菌株的菌絲塊接種于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)2天測量菌落直徑(張星耀等, 2007)。每個菌株3次重復，試驗重復3次。在載玻片上用PDA瓊脂薄層培養(yǎng)各菌株，25 ℃溫箱中培養(yǎng)3天后，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)并統(tǒng)計單根菌絲的分枝數(shù)，每個菌株3次重復，試驗重復3次。

1.4.2CcExo70敲除突變體對H2O2耐受性測定 為了檢測不同菌株的氧化應激反應(Yuetal., 2019)，將分生孢子座碾碎，用2 mL無菌去離子水洗滌獲得分生孢子懸浮液。將106·mL-1的分生孢子懸浮液與PDA混合后，倒入培養(yǎng)皿中。將滅菌濾紙置于培養(yǎng)皿的中央，分別將10 μL 2 mol·L-1和 3.5 mol·L-1H2O2滴加在濾紙上，25 ℃培養(yǎng)2天后測定抑菌圈的直徑。每個菌株3次重復，試驗重復3次。

1.4.3 致病性測定 于北京林業(yè)大學苗圃采集1年生的健康歐美楊(Populus×euramericana)扦插枝條，將枝條剪成25 cm的小段，用蒸餾水沖洗，后用1%次氯酸鈉消毒，并用無菌水沖洗3次，石蠟密封枝條頂端防止水分流失。然后用直徑5 mm的圓鐵加熱后將每根嫩枝段燙傷，用打孔器從生長活躍的菌落邊緣獲取直徑5 mm的菌絲塊接種于傷口處，用保鮮膜纏繞固定，將接種后的枝條一端浸入水中并覆蓋保鮮膜保濕，于室溫下培養(yǎng)，定時噴水。發(fā)病后測量病斑面積并拍照。所有試驗重復3次，每次每個菌株處理至少25根細枝(Yuetal., 2018)。

1.4.4 菌絲染色觀察 幾丁質沉積染色試驗參考Harris等(1994)的方法，在載玻片上用PDA瓊脂薄層培養(yǎng)菌株，25 ℃溫箱中培養(yǎng)3天后，用10 mg·mL-1的熒光增白劑(calcofluor white，CFW)對菌絲進行染色，于熒光顯微鏡下觀察幾丁質的分布。菌絲活性氧積累染色試驗參考Song等(2010)的方法，將2 mg·mL-1二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)滴加到菌絲上24 h后觀察菌絲中活性氧(ROS)的積累情況。內吞作用參考Fischer-Parton等(2010)的染色方法，在生長于載玻片瓊脂薄層上的菌絲中滴加10 μL 5 μmol·L-1FM4-64水溶液，染色相應時間后，立即置于激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)光波長514 nm，發(fā)射光波長550 nm)下觀察菌絲染色情況。以上試驗中每個菌株3次重復，試驗重復3次。

1.5 蛋白質樣品的提取及測序

為了研究CcExo70對胞外分泌蛋白的調控作用，將野生型和ΔCcExo70突變體在添加了滅菌楊樹枝條作為誘導的PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天。分別收集菌體的培養(yǎng)物及其培養(yǎng)濾液提取蛋白(王爽等, 2012; 胡彬彬等, 2013)。采用Bradford 法測定提取的蛋白濃度(Bradford, 1976)。

取100 μg各樣品的蛋白，使用胰蛋白酶在37 ℃條件下過夜酶切，胰蛋白酶處理后的樣品利用同位素標記的相對和絕對定量(iTRAQ 8 Plex)結合液相色譜和質譜串聯(lián)(LC-MS/MS)的蛋白質組學定量分析技術，對蛋白組進行對比分析(Wieseetal., 2007; Unwinetal., 2010)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS對野生型、CcExo70敲除突變體、互補菌株的生長速率、菌絲分枝數(shù)量、H2O2脅迫下的抑菌圈大小、病斑面積、菌絲隔膜數(shù)量等試驗數(shù)據(jù)進行多重比較分析(Pallant, 2013)，顯著性差異水平設定為0.05，當P≤0.05時對比間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 CcExo70的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

以釀酒酵母Exo70(CAA89380.1)的蛋白序列為基序，從楊樹腐爛病菌全基因組數(shù)據(jù)庫中獲得一個同源基因，通過序列分析發(fā)現(xiàn)該同源基因含有典型的Exo70結構域，因此命名為CcExo70(ID:MT803485)。該基因全長為1 992 bp，包含1個內含子，編碼636個氨基酸。在NCBI和JGI數(shù)據(jù)庫中也獲得不同真菌和典型模式生物的Exo70同源基因。分析發(fā)現(xiàn)在所有選擇的尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、釀酒酵母、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)等真菌及典型模式生物人類(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)和黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中只找到1個Exo70同源基因，而在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、毛果楊(Populustrichocarpa)和水稻(Oryzasativa)中發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個Exo70同源基因。此外，在所選的致病卵菌中未能鑒定到Exo70的同源基因。通過對所選病原真菌Exo70同源基因、人類HsExo70、黑腹果蠅DmExo70和小鼠MmExo70進行系統(tǒng)發(fā)育和序列比對分析表明，CcExo70與其他病原真菌Exo70同源基因具有較高的序列相似性(VM1G_04257相似度94.9%，VP1G_07527相似度95.1%，MGG_01760相似度62.8%，BcExo70相似度53.9%和SS1G_13345相似度55.2%)，然而其與模式物種釀酒酵母ScExo70(19.1%)、人類HsExo70(14%)和小鼠MmExo70(14.8%)的序列相似性較低(圖1)。

圖1 Exo70的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of Exo70 homologs from different organisms

2.2 CcExo70敲除突變體和回補菌株的獲得及驗證

采用Split-maker的方法對目的基因進行敲除(Goswami, 2012)，敲除突變體及回補菌株獲得策略見圖2A。通過PCR擴增方法，利用目標基因內部引物Internal-Exo70for/Internal-Exo70rev在野生型基因組中能擴增出單一的目的條帶，突變體中擴增不出目的條帶； 采用目標基因外部引物External-Exo70for/External-Exo70rev在突變體中能擴增出單一的條帶且大小與替換后的片段大小相近，而野生型中擴增出的片段大小不變(圖2B)，證明成功獲得CcExo70敲除突變體(ΔCcExo70-8、ΔCcExo70-9)。為了驗證突變體的表型是否由CcExo70引起，從基因組DNA中擴增出一個包含自身啟動子和CcExo70編碼區(qū)的片段，并將其轉化到ΔCcExo70-8原生質體中，通過PCR驗證成功擴增出條帶，表明成功獲得回補菌株(ΔCcExo70/C)(圖2B)。

圖2 CcExo70敲除突變體及回補菌株的獲得Fig. 2 Targeted gene deletion and complementationA： 突變體及回補菌株構建策略；B： 利用特異性引物對得到的轉化菌株進行PCR驗證。Primer 1： 目標基因外部引物External-Exo70for/External-Exo70rev，M： 1 000 marker; Primer 2： 目標基因內部引物Internal-Exo70for/Internal-Exo70rev，M： 250 marker。A： Construction strategy of mutants and complementary strain； B： Specific primers were used to verify the transformed strains by PCR. Primer 1: External primer for target gene External-Exo70for/External-Exo70rev, M： 1 000 marker;Primer 2: Target gene internal primer Internal-Exo70for/Internal-Exo70rev, M： 250 marker.

2.3 CcExo70參與調控菌絲生長發(fā)育和脅迫應答

野生型、突變體和回補菌株在PDA平板上培養(yǎng)結果顯示，CcExo70敲除突變體的菌落直徑顯著小于野生型和回補菌株(圖3A，C)。同時，在PDB中培養(yǎng)7天后，CcExo70敲除突變體與野生型和回補菌株相比，其生長也顯著減慢(圖3B)。

圖3 CcExo70敲除突變體徑向生長Fig. 3 Radial growth in CcExo70 deletion mutantA： 野生型、突變株和回補菌株在PDA平板上生長2天和7天后的菌落形態(tài)；B： 菌株在液體PDB中生長7天后的菌絲形態(tài)；C： 菌株在培養(yǎng)基上生長2天后菌落直徑的統(tǒng)計分析。誤差線采用的是標準偏差； 小寫字母不同者表示在0.05水平上差異顯著。A： Colony morphologies of the wild-type, mutant, and complemented strains after 2 and 7 days of growth on PDA plates; B： The mycelia morphology of the strains after 7 d of growth in liquid PDB; C. Statistical analysis of colony diameters of the indicated strains after 2 d on media. Error bars are standard deviation and different lowercases represent significant difference at P <0.05.

CcExo70敲除突變體在單個菌絲上分枝數(shù)量明顯多于野生型和回補菌株(圖4)。

圖4 CcExo70敲除突變體的菌絲形態(tài)Fig. 4 Mycelium morphology of CcExo70 deletion mutantA： 在含PDA斜面的載玻片上25 ℃培養(yǎng)3天，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)； B： 顯微鏡下計數(shù)單個菌絲分枝。誤差線采用的是標準偏差； 小寫字母不同者表示在0.05水平上差異顯著。A： The strain was cultured at 25 ℃ on a slide containing PDA ramp for 3 days, then the mycelia morphology was observed under microscope; B： The number of single mycelium branches was counted under microscope. Error bars are standard deviation and different lowercases represent significant difference at P <0.05.

ΔCcExo70突變體菌株對氧化脅迫的反應結果顯示，與野生型和回補菌株相比，菌落直徑生長量在H2O2脅迫下受到明顯抑制(圖5)。

上述結果表明CcExo70參與了楊樹腐爛病菌的生長、菌絲形態(tài)的發(fā)生、脅迫的應答。

2.4 CcExo70參與調控楊樹腐爛病菌的致病性

CcExo70敲除突變體對寄主植物致病性測定結果顯示，接種野生型和回補菌株的枝條3天后均出現(xiàn)明顯的病斑(圖6A)，但接種CcExo70敲除突變體的枝條病斑面積顯著小于接種野生型和回補菌株的枝條。7天后，接種野生型和回補菌株的枝條病斑面積較接種3天時的病斑面積顯著增大，而接種CcExo70敲除突變體的枝條病斑面積無顯著差異(圖6B)。以上結果表明敲除CcExo70會顯著降低楊樹腐爛病菌對楊樹枝條的致病力。

2.5 CcExo70的缺失導致楊樹腐爛病菌ROS水平下降

由于CcExo70的缺失導致菌絲生長和致病性的缺陷，使用DAB對楊樹腐爛病菌進行染色，24 h后觀察細胞內ROS的積累情況，結果顯示野生型和互補菌株在菌絲體內能夠檢測到明顯的ROS積累，而CcExo70敲除突變體菌絲體內僅檢測到少量的ROS積累，這表明CcExo70敲除突變體菌絲生長過程中產生的活性氧明顯低于野生型和回補菌株(圖7)，說明CcExo70基因的缺失導致了楊樹腐爛病菌中ROS水平的下降。

圖7 超氧化物生成檢測Fig. 7 Detection of superoxide productionA： DAB染色法檢測超氧化物的產生。DAB染色后野生型顯示了較深的顏色，表明ROS積累較高，而突變體顯示了較淺的顏色，表明ROS積累減少?；匮a菌株表現(xiàn)出與野生型相似的深色。B： 在DAB染色2天后單根菌絲中ROS積累情況。所有菌株在PDA平板上 25 ℃培養(yǎng)2天，DAB染色后在顯微鏡下觀察。A： Detection of superoxide production by DAB staining. Dark DAB dye in wild type strain suggested a high ROS level, while the mutant showed less color, indicating a reduced ROS accumulation. The reconstituted strain exhibited a darker color similar to wild type. B： Accumulation of ROS in single hyphae after two days of DAB staining. All strains were cultured on PDA plate at 25 ℃ for 2 days, then observed under light microscope after DAB staining.

2.6 CcExo70調控菌絲中幾丁質的分布及內吞作用

與野生型和回補菌株相比，CcExo70敲除突變體幾丁質沉積存在明顯缺陷(圖8A)。野生型和回補菌株的菌絲尖端有明顯的幾丁質沉積，而CcExo70敲除突變體的菌絲尖端幾乎沒有幾丁質沉積的現(xiàn)象(圖8B)。然而，在CcExo70敲除突變體的菌絲中發(fā)現(xiàn)了比野生型和回補菌株更為密集的隔膜分布(圖8C, D)。以上結果說明CcExo70參與了楊樹腐爛病菌菌絲中幾丁質的分布。

圖8 CcExo70敲除突變體中幾丁質的分布Fig. 8 Distribution of chitin in the CcExo70 deletion mutantA： 用鈣熒光白(CFW)對WT、ΔCcExo70和ΔCcExo70/C菌株的菌絲進行染色，觀察幾丁質的積累情況。B： 熒光顯微鏡下單根菌絲尖端幾丁質沉積情況。與野生型和回補菌株相比，敲除突變體菌絲頂端沒有明顯的幾丁質沉積。C： 熒光顯微鏡下單根菌絲隔膜幾丁質分布情況。野生型和回補菌株的隔膜分布明顯少于突變體菌株。D： 野生型、突變體和回補菌株單根菌絲的隔膜數(shù)統(tǒng)計。誤差線采用的是標準偏差； 小寫字母不同者表示在0.05水平上差異顯著。A： Mycelium of WT, ΔCcExo70 and the ΔCcExo70/C strains were stained by calcofluor white(CFW) to observe chitin accumulation. B： Chitin deposition at the tip of mycelia.Compared with the wild type and complementary strains, there was no obvious chitin deposition at the tip of the mutant hyphae.C： After CFW staining, the septal distribution of wild type and complementary strains was significantly less than that of mutant strains under fluorescence microscope. D： The number of septa in mycelium cytoplasm of wild type, ΔCcExo70 and complementary strains. Error bars are standard deviation and different lowercases represent significant difference at P <0.05.

通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)M4-64染色1 min后，可以在野生型和回補菌株的細胞內膜內觀察到FM4-64的熒光信號。CcExo70敲除突變體染色1 min后，僅在細胞膜上能夠觀察到熒光信號； 染色5 min后，可以在CcExo70敲除突變體菌絲內膜中觀察到FM4-64的熒光信號(圖9)。以上結果表明敲除CcExo70會延遲楊樹腐爛病菌的內吞作用。

圖9 CcExo70敲除突變體中囊泡的分布Fig. 9 Distribution of vesicles in the CcExo70 deletion mutant菌絲培養(yǎng)3天后用5 μmol·L-1的FM4-64對菌落沙銀菌絲體染色進行共聚焦成像。The mycelium were stained with 5 μmol·L-1 FM4-64 for confocal imaging after cultured for 3 days.

2.7 CcExo70參與水解酶及候選效應分子的外泌過程

對WT菌株和ΔCcExo70敲除突變體的細胞培養(yǎng)物和胞外培養(yǎng)濾液進行蛋白組測序分析，在所有樣本中共鑒定到284個蛋白，其中有25個蛋白含有信號肽，有8個蛋白的豐度在ΔCcExo70-F中較WT-F相比下降了50%以上(表2)，功能注釋顯示其包括2個Heat shock protein 70 family(IPR013126)，1個Peptidase G1(IPR000250)，1個Lactonase, 7-bladed beta propeller(IPR019405)，1個Protein disulphide isomerase(IPR005792)，1個L-lysine 6-monooxygenase/L-ornithine 5-monooxygenase(IPR025700)，1個Glycoside hydrolase family 31(IPR000322)，1個Alpha-L-arabinofuranosidase B。

表2 ΔCcExo70-F與WT-F中蛋白質豐度比值Tab.2 List of proteins with abundances fall by over half in ΔCcExo70-F compared to WT-F

進一步分析發(fā)現(xiàn)，糖類分解蛋白和蛋白CcSP2、CcSP3、CcSP6和CcSP7在胞外培養(yǎng)濾液中的含量顯著高于細胞內，表明這些蛋白很可能作用于胞外。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，肽酶蛋白CcSP2符合典型效應分子的特征，包括氨基酸序列較小(≤300 aa)、含有信號肽、富含半胱氨酸殘基、不含跨膜結構域等。通過LOCALIZER軟件對CcSP2進行亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)，CcSP2定位于植物線粒體的概率為99.8%。另外，在植物與病原物互作數(shù)據(jù)庫PHI-base中未發(fā)現(xiàn)CcSP2同源蛋白的研究報道。CcSP3是一個假定蛋白含有一個內酯酶的結構域，而CcSP6(糖苷水解酶31家族)和CcSP7(α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶B)通過參與糖苷的水解代謝過程，從而調控病原菌的致病過程，說明CcExo70參與調控了楊樹腐爛病菌候選效應分子和水解酶的外泌。

3 討論

真核細胞通過胞外分泌調控系統(tǒng)，在特定的位置和時間條件下，將所選的“貨物”運輸?shù)劫|膜或細胞外空間調控許多生理過程，如極性生長、形態(tài)發(fā)生、植物共生及病原微生物與宿主植物的相互作用(Hückelhoven, 2007; Heideretal., 2012; Liuetal., 2012)。作為多亞基栓系復合體家族的一員，胞外分泌復合體在胞吐過程中起著重要作用(Chenetal., 2011; Rivera-Molinaetal., 2013; Shenetal., 2013)。Exo70為胞外分泌復合體中的一員，在病原真菌中研究較少，其在與菌絲生長和致病性相關的胞外和胞內分子運輸?shù)壬飳W過程中的作用機制尚不清楚。本研究在楊樹腐爛病菌中鑒定了一個胞外分泌復合體亞基CcExo70，對其功能分析發(fā)現(xiàn)CcExo70的缺失導致楊樹腐爛病菌生長發(fā)育、幾丁質分布和毒力出現(xiàn)明顯的缺陷。

大多數(shù)胞外分泌復合體亞基都參與調控真菌的生長及形態(tài)(Lipschutzetal., 2002; Guptaetal., 2015; Guanetal., 2020)。例如，敲除白色念珠菌的Sec3基因，其菌絲的生長顯著降低，同時造成菌絲形態(tài)異常(Lietal., 2007)，且使囊泡不能夠栓系和錨定在菌絲尖端的生長點位置； 酵母中胞外分泌復合體2個亞基Sec3和Exo70會形成亞復合體結合在質膜上，促進分泌囊泡與目標區(qū)域的質膜進行栓系和錨定，從而調控酵母的出芽生長(Bendezúetal., 2012)； 敲除灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)BcExo70會顯著降低該病菌的生長速率； 且菌絲內的囊泡并不會顯著的聚集于菌絲的尖端生長點，而主要分布于菌絲胞質內(Guanetal., 2020)。在真菌中，將分泌囊泡轉運至菌絲尖端富含囊泡的頂體區(qū)域(Spitzenk?rper, 2007)對于維持菌絲的生長和正常形態(tài)具有重要的意義(Riquelmeetal., 2014)。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)敲除CcExo70同樣會造成楊樹腐爛病菌生長顯著降低，使用FM4-64染色發(fā)現(xiàn)，敲除CcExo70會延遲菌體的內吞作用，同時也會影響菌絲內囊泡的分布，原本會在菌絲尖端生長點聚集的幾丁質消失了，但菌絲內的隔膜數(shù)量顯著增多。此外，與野生型和回補菌株相比，CcExo70敲除突變體的菌絲形成了更多的分枝。因此，推測敲除Exo70后，含有調控菌絲生長相關的酶和其他材料的囊泡不能夠正常轉運至菌絲尖端而導致菌絲生長和形態(tài)缺陷。與上述功能相對應的是，胞外分泌復合體不同亞基在菌絲的尖端生長點都存在明顯的聚集(Chenetal., 2015; Guptaetal., 2015)。

CcExo70調控楊樹腐爛病菌候選效應分子和水解酶的分泌及致病過程。病原菌向胞外分泌各類水解酶、毒素以及效應分子是其非常重要的一類致病策略，胞外分泌復合體通過調控病原物的這一過程，從而在一定程度上影響病原菌的致病性。對灰葡萄孢菌BcExo70的研究發(fā)現(xiàn)，敲除該基因會顯著降低該病菌對寄主植物番茄(Lycopersiconesculentum)的致病力； 灰葡萄孢菌致病關鍵水解酶聚半乳糖醛酸酶的活性在BcExo70敲除突變體胞外培養(yǎng)液中顯著降低(Guanetal., 2020)。敲除稻瘟菌Exo70同源基因后不僅顯著降低了該病菌的致病力，還會造成分生孢子尖端以及附著胞外圍的粘液顯著減少，導致病菌對寄主葉片附著能力下降，從而降低其致病性。另外，對稻瘟菌Exo70和Sec5敲除突變體胞外分泌總蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，Exo70敲除突變體胞外分泌總蛋白量僅有野生型菌株的1/3左右，Sec5敲除突變體胞外分泌總蛋白量也不到野生型菌株的一半。稻瘟菌的Exo70和Sec5參與調控了該病菌胞質效應分子分泌到BIC界面的過程，從而影響該病菌的致病過程(Giraldoetal., 2013; Guptaetal., 2015)。敲除CcExo70也會顯著降低楊樹腐爛病菌對楊樹枝條的毒力，進一步對野生型和CcExo70敲除突變體的胞內和胞外蛋白進行蛋白質組分析發(fā)現(xiàn)，幾個候選效應分子和水解酶的分泌依賴于CcExo70。本研究表明，與野生型和回補菌株相比，CcExo70敲除突變體對H2O2脅迫更敏感，并且CcExo70敲除突變體菌絲中ROS積累顯著減少，這表明CcExo70在細胞外ROS耐受和細胞內ROS穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，而植物病原物細胞內ROS穩(wěn)態(tài)對于其發(fā)揮毒力功能十分關鍵，細胞內ROS穩(wěn)態(tài)的破壞將導致其功能缺陷(Eganetal., 2007)。在稻瘟菌中還未探究Exo70與ROS的關系，但對另一個胞外分泌復合體亞基Sec6的研究表明，在ROS合成缺陷的NADPH氧化酶類ΔnoxR和Δnox2敲除突變體中，Sec6在附著胞中會出現(xiàn)錯誤的定位。這表明胞外分泌復合體與ROS之間存在一定的關聯(lián)，但它們之間是如何相互作用的還需要進一步探究。上述研究結果表明，不同病原真菌的Exo70同源基因在調控菌絲生長和形態(tài)、胞內囊泡轉運、毒力物質的分泌及致病性等方面具有保守功能(Guptaetal., 2015; Guanetal., 2020)。

4 結論

本研究通過生物學功能分析，發(fā)現(xiàn)CcExo70參與調控真菌生長、內吞作用、脅迫應答反應、水解酶類和候選效應蛋白的分泌，降低病原菌的致病性。