李星瑤，趙延紅，蔡子墨，葉冰玉，安鵬，張愛軍，石興民，董盛，吳喜利*

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004；2.陜西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，陜西 西安 710082；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安 710061；4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712023)

1 材料

1.1 動物

60只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，飼養(yǎng)溫度保持在25 ℃，相對濕度為40%～60%，每天人工照明12 h。由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(陜)2012-003，所有操作均通過西安交通大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物及試劑

復(fù)方由黑附片15 g(先煎)，生黃芪15 g，山萸肉15 g，金櫻子45 g，芡實(shí)30 g，生大黃10 g(后下)，澤蘭15 g，川芎15 g，桂枝25 g，茯苓15 g，車前子20 g(包煎)等組成。經(jīng)煎煮、減壓、過濾、濃縮得復(fù)方溶液，相當(dāng)于生藥濃度1.55 g/mL，實(shí)驗(yàn)時配制為高、中、低3種劑量溶液。注射用鹽酸多柔比星(阿霉素)，海正輝瑞制藥有限公司(H33021980)；醋酸潑尼松片，浙江仙琚制藥股份有限公司(071 088)；蛋白抽提試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所(P0033)；兔抗TRPC6 IgG單克隆抗體，美國Abcam公司(ab137028)；小鼠抗β-Actin單克隆抗體，美國CMCTAG公司(AT0001)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，西安壯志生物科技有限公司(P48010)。SP法免疫組化染色法檢測試劑盒，北京中杉金橋有限公司(SP-9000)。

1.3 儀器

TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(德國Lecia公司)；Ti-E全自動熒光倒置顯微鏡(日本Nikon Eclipse)；G:Box凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)；Revco Elite超低溫冰箱(美國Thermo公司)；5810R冷凍型臺式大容量高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；半干轉(zhuǎn)移槽(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組及模型的制備

60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組(對照組、模型組、潑尼松組、溫陽化濁方高劑量組、溫陽化濁方中劑量組、溫陽化濁方低劑量組)，每組10只，除對照組外，其余各組大鼠均按CHEN Z B[7]法經(jīng)尾靜脈分兩次注射阿霉素進(jìn)行造模，第一次經(jīng)尾靜脈注射阿霉素4 mg/kg，1周后第二次經(jīng)尾靜脈注射阿霉素3.5 mg/kg，對照組采用相同方法注射同體積的生理鹽水。于第二次注射阿霉素1周后收集尿液，若檢測出尿蛋白陽性，則模型制備成功。

2.2 給藥

造模成功后，治療組分別給予潑尼松組6.45 mg/(kg·d)，溫陽化濁方高劑量組7.26 g/(kg·d)、中劑量組2.42 g/(kg·d)、低劑量組0.81 g/(kg·d)，用蒸餾水配成混懸液進(jìn)行灌胃，灌胃按照動物和人的等效計量換算灌胃量，模型組和對照組給予2 mL蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃56 d。

2.3 一般情況觀察

觀察實(shí)驗(yàn)大鼠精神狀態(tài)、活動度、體質(zhì)量、尿量、背毛色澤等。

2.4 尿液指標(biāo)及甲狀腺功能檢測

分別于尾靜脈注射阿霉素前1 天、第2次尾靜脈注射阿霉素后第1周、灌胃干預(yù)后的第2、4、8周將各組大鼠放入代謝籠，收集24 h尿液，20 ℃，3 000 r/min，離心15 min，吸取上清液，采用鄰苯三酚紅比色法測定尿液24 h尿蛋白定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時給予3%戊巴比妥麻醉，分離血清，放射免疫分析法檢測樣品中促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)。

2.5 腎臟病理指標(biāo)

左腎分離被膜后分成2份，-80 ℃保存。取腎皮質(zhì)切成小塊后分別置于4%多聚甲醛固定，備用。腎組織進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 激光共聚焦顯微鏡檢測腎組織TRPC6蛋白表達(dá)

將腎組織冰凍切片后浸于丙酮固定，山羊血清封閉，加一抗孵育4 ℃過夜，次日加二抗室溫孵育1 h，PBS清洗后DAPI染色，加熒光淬滅劑封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，TRPC6的陽性染色分布。

2.7 免疫組化法檢測腎組織TRPC6蛋白表達(dá)

石蠟切片脫蠟水化，微波修復(fù)抗原，采用SP法免疫組化試劑盒，TRPC6(1∶300稀釋)孵育，4 ℃過夜，二抗室溫孵育30 min，DAB顯色10 min，鏡下觀察后蘇木素復(fù)染核10 min，所有步驟均參照說明書進(jìn)行操作。在每張切片中隨機(jī)選擇20個連續(xù)不重復(fù)視野(×400)進(jìn)行觀察，拍照。

2.8 Western Blot法檢測腎組織TRPC6的表達(dá)

稱取200 mg腎組織，加RIPA組織裂解液，勻漿3次，冰上裂解30 min后4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清液。10 000 r/min離心5 min得蛋白提取液，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白，以SDS-PAGE電泳法分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗TRPC6(1∶10 000)、HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育2 h后洗膜，顯色、拍照，統(tǒng)計分析。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 一般情況

注射阿霉素后第1周除對照組外，其余各組大鼠精神稍差，食欲可，活動及大小便均尚可。在第2次注射阿霉素后約3 d大鼠逐漸出現(xiàn)精神和食欲明顯變差，并有脫毛及腹瀉表現(xiàn)，約第5天時部分大鼠出現(xiàn)口鼻有血性分泌物及爛尾現(xiàn)象。溫陽化濁方高、中、低劑量組及潑尼松組于灌胃后第4周開始，大鼠體質(zhì)量明顯增加，精神及食欲狀況不同程度好轉(zhuǎn)，但開始出現(xiàn)較為明顯的水腫；模型組大鼠一般情況無明顯改善且水腫程度相對其余各組較重。

3.2 對ADR腎病大鼠24 h尿蛋白定量的影響

與對照組比較，其余各組經(jīng)造模處理后第2、4、8周24 h尿蛋白量均有不同程度升高；造模后2周，與模型組比較，各治療組的大鼠24 h尿蛋白定量變化顯著(P<0.05)；造模后4周時，與模型組比較，各治療組大鼠24 h尿蛋白定量明顯降低(P<0.05)；經(jīng)藥物治療8周后，與模型組比較，各治療組大鼠24 h尿蛋白定量明顯降低(P<0.05)，提示各治療組均有降低尿蛋白作用，且溫陽化濁方高劑量組與潑尼松組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示高劑量溫陽化濁方降蛋白效果更好，見表1。

表1 各組對ADR腎病大鼠24 h尿蛋白定量的影響

3.3 對ADR腎病大鼠血清甲狀腺激素水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清中TSH、T3水平顯著升高，T4水平降低(P<0.05)；與模型組比較，各治療組大鼠血清T4水平明顯升高，而T3及TSH水平明顯降低(P<0.05)；溫陽化濁方高、中、低劑量組對血清T4水平的影響有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；溫陽化濁方高劑量對TSH水平的影響有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。綜合3項血清水平，提示溫陽化濁方改善甲狀腺功能的效果優(yōu)于激素，見表2。

表2 各組對大鼠血清甲狀腺激素水平的影響

3.4 對ADR腎病大鼠腎組織病理學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，基底膜完整，系膜及基質(zhì)未見增生，腎小管間質(zhì)正常，皮髓質(zhì)分界清晰(圖1A，圖2A)。模型組可見系膜細(xì)胞及基質(zhì)輕度增生，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞空泡變性，管腔變窄并有瘀血，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、脫落，管腔內(nèi)存在大量蛋白管型，腎間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤，少部分腎小球出現(xiàn)球囊壁纖維化及毛細(xì)血管襻節(jié)段性硬化(圖1B，圖2B)；各治療組球囊腔變窄減輕，蛋白管型明顯減少，且溫陽化濁方高、中劑量組腎臟整體病理損傷輕于潑尼松組及溫陽化濁方低劑量組(圖1WM、圖1WH、圖2WM、圖2WH)。

3.5 對ADR腎病大鼠腎臟組織TRPC6蛋白水平的影響

免疫組化法染色結(jié)果顯示，對照組TRPC6蛋白在腎小球和腎小管均有表達(dá)，在腎小球中分布不均，染色強(qiáng)度較弱，面積較少，呈團(tuán)塊狀或僅有顆粒狀分布；在腎小管近曲及遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞中有棕黃色的陽性染色顆粒(圖3A、圖4A)。與對照組比較，模型組腎小球及腎小管中TRPC6染色強(qiáng)度增加(圖3B、圖4B)；與模型組比較，各治療組腎小球及腎小管中TRPC6表達(dá)呈不同程度減少(圖3WL、圖3WM、圖3WH、圖4WL、圖4WM、圖4WH)。

激光共聚焦熒光顯微鏡檢測TRPC6蛋白，對照組大鼠腎臟TRPC6表達(dá)微弱(圖5A)，在模型組中，TRPC6表達(dá)最強(qiáng)，分布最廣(圖5B)；溫陽化濁方低、中、高劑量組以及潑尼松組干預(yù)后TRPC6熒光強(qiáng)度明顯減弱，分布區(qū)域也相對減少，但其組間無明顯差異性(圖5C、圖5WL、圖5WM、圖5WH)。

注：A.對照組；B.模型組；C.潑尼松組；WL.溫陽化濁方低劑量組；WM.溫陽化濁方中劑量組；WH.溫陽化濁方高劑量組。圖1 各組對ADR腎病大鼠腎小球病理學(xué)的影響(HE染色)

注：A.對照組；B.模型組；C.潑尼松組；WL.溫陽化濁方低劑量組；WM.溫陽化濁方中劑量組；WH.溫陽化濁方高劑量組。圖2 各組對ADR腎病大鼠腎小管病理學(xué)的影響(HE染色)

注：A.對照組；B.模型組；C.潑尼松組；WL.溫陽化濁方低劑量組；WM.溫陽化濁方中劑量組；WH.溫陽化濁方高劑量組。圖3 各組對大鼠腎小球中TRPC6蛋白表達(dá)的影響(Masson染色)

注：A.對照組；B.模型組；C.潑尼松組；WL.溫陽化濁方低劑量組；WM.溫陽化濁方中劑量組；WH.溫陽化濁方高劑量組。圖4 各組對大鼠腎小管中TRPC6蛋白水平的影響(Masson染色)

注：A.對照組；B.模型組；C.潑尼松組；WL.溫陽化濁方低劑量組；WM.溫陽化濁方中劑量組；WH.溫陽化濁方高劑量組。圖5 激光共聚焦檢測各組對大鼠TRPC6 的表達(dá)情況

Western Blot法檢測各組大鼠腎組織中TRPC6蛋白的表達(dá)。與模型組比較，各治療組均能不同程度的下調(diào)大鼠腎組織TRPC6蛋白的表達(dá)(P<0.01)(表3，圖6)。

表3 溫陽化濁方對大鼠腎組織TRPC6蛋白水平的影響

注：A.對照組；B.模型組；C.潑尼松組；WL.溫陽化濁方低劑量組；WM.溫陽化濁方中劑量組；WH.溫陽化濁方高劑量組。與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.01，##P<0.01。圖6 Western Blot檢測TRPC6蛋白表達(dá)情況

4 討論

溫陽化濁方是在陜西省名老中醫(yī)喬成林教授“治水必先溫通”的學(xué)術(shù)理論指導(dǎo)下創(chuàng)立的治療腎性蛋白尿的臨床有效方劑[8]。該方由黑附片、生黃芪、山萸肉、金櫻子、芡實(shí)、生大黃、澤蘭、川芎、桂枝、茯苓、車前子等藥物組成。現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，附子具有抗炎、增強(qiáng)免疫、擴(kuò)張外周血管、保護(hù)腎功能的作用[9-10]；大黃能夠抑制腎單位高代謝，延緩腎小球硬化，抑制系膜細(xì)胞增生[11]，還可改善腎衰患者的高凝狀態(tài)，減少蛋白尿[12]；黃芪可改善全身血流，以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝[13-14]；山茱萸雙向調(diào)節(jié)免疫，促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬功能[15]；澤蘭具有抗凝血、調(diào)節(jié)血脂代謝、升高血清總蛋白和白蛋白的作用[16]；川芎可改善患者高凝狀態(tài)，具有一定抗炎作用[17]。

TRPC6屬于一種壓力激活的機(jī)械敏感性鈣離子通道，其可產(chǎn)生由機(jī)械和滲透作用而誘導(dǎo)的膜牽張反應(yīng)，在壓力的誘導(dǎo)下TRPC6的活化不依賴于磷脂酶C，TRPC突變可以改變靜水壓驅(qū)動的超濾作用，從而引起蛋白尿和腎小球硬化[18-19]，并且其開放可觸發(fā)感受器細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度升高以及胞膜的去極化，繼而促進(jìn)動作電位發(fā)出，激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，對細(xì)胞生理功能進(jìn)行調(diào)控[20]。本研究顯示溫陽化濁方可明顯減少尿蛋白、改善甲狀腺功能及減輕腎臟病理損害。同時中藥各治療組均能不同程度下調(diào)腎臟組織TRPC6蛋白的表達(dá)，提示這可能是溫陽化濁方防治腎病的作用機(jī)制之一。但由于TRPC6信號通路相當(dāng)復(fù)雜，還需進(jìn)行更深層次的探討，而對于臨床治療NS，使用抑制TRPC6表達(dá)或降低其活性的藥物可能是未來一個理想的治療方案。