安淑靜，牛豆，王婷，韓彬凱，王紅菊，康杰芳

(陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，教育部藥用資源與天然藥物化學(xué)重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西 西安 710119)

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)是山茱萸科山茱萸屬植物，又名山萸肉、棗皮、藥棗等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，其干燥成熟果肉可入藥，具有補益肝腎、澀精固脫等功效[2]。研究表明山茱萸皂苷類和環(huán)烯醚萜苷類化合物是重要的生物活性成分，具有降血糖、抗氧化、抗炎、抗癌、神經(jīng)保護、肝臟保護和腎臟保護[3-9]等作用。山茱萸主要分布在陜西、河南、浙江、山西、湖北和安徽等地。洑香香等[10]對4個地區(qū)7個山茱萸群體的種子形態(tài)指標變異、種子形態(tài)指標與環(huán)境因子的相關(guān)性、種子形態(tài)地理變異趨勢和群體聚類進行了探討，表明不同群體種子形態(tài)均存在顯著差異；種子寬度與體積呈顯著正相關(guān)，且二者與緯度呈顯著負相關(guān)；種子寬度和種子體積的地理變異趨勢明顯。焦媛等[11]采用ICP-MS法分析5個產(chǎn)區(qū)22種無機元素的差異性，發(fā)現(xiàn)山茱萸中無機元素的含量與產(chǎn)地存在高度相關(guān)性。其他研究也發(fā)現(xiàn)山茱萸產(chǎn)地與其生物活性成分存在一定相關(guān)性[12-14]。

以上對于山茱萸有效成分的研究表明了不同產(chǎn)地間含量存在差異，但少有對有效成分含量與不同產(chǎn)地具體環(huán)境因素相關(guān)性研究的報道。尋找影響活性成分含量的具體環(huán)境因子對于優(yōu)良產(chǎn)區(qū)的選擇、品種選育、質(zhì)量控制及規(guī)范化栽培有重要的指導(dǎo)作用。本研究對6個主產(chǎn)區(qū)15個產(chǎn)地的具體環(huán)境因素(緯度、經(jīng)度、海拔、年降雨量、年均氣溫、年日照、無霜期)與山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量進行相關(guān)性和聚類分析，為山茱萸質(zhì)量控制、優(yōu)良產(chǎn)區(qū)篩選和規(guī)范化栽培等提供相關(guān)的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；MD-SpectraMax M5多功能酶標儀(Molecular Devices)；LG-04C微型植物粉碎機(瑞安市百信藥機器械廠)；XH-B型旋渦混合器(美堰市康健有限公司)；XO-200超聲微波反應(yīng)系統(tǒng)(南京先歐儀器制造有限公司)；LC-2010A HT型高效液相色譜儀(日本 SHIMADZU)。

1.2 試藥

15批山茱萸藥材樣品的地理信息見表1，經(jīng)西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室曹曉燕教授鑒定為山茱萸科山茱萸(CornusofficinalisSieb et.Zucc.)的成熟果肉。取山茱萸樣品，粉碎，過40目篩，備用。

表1 不同產(chǎn)地山茱萸地理位置特征

齊墩果酸標準品(sigma公司)；馬錢苷(批號：MUST-12052813)、獐牙菜苷(批號：MUST-13031124)、莫諾苷(批號：MUST-13070102)、山茱萸新苷(批號：MUST-12101526)均購于上海源葉生物科技有限公司，純度≥98 %；乙腈(色譜純)；冰乙酸(色譜純)；其余試劑為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 總皂苷樣液制備

稱取樣品1.00 g，70%乙醇提取，料液比為1∶21，超聲功率471 W，微波功率369 W，5 min，抽濾，正丁醇萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去正丁醇，定容至20 mL，備用，每個樣本重復(fù)提取3次。

1.3.2 總環(huán)烯醚萜苷樣液制備

稱取樣品1.00 g，80%甲醇提取，料液比為1∶21，超聲功率357 W，微波功率641 W，9 min，抽濾，甲醇補到原始重量，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用，每個樣本重復(fù)提取3次。

1.3.3 總皂苷含量的測定

總皂苷含量的測定參照CHEN等[15]的方法，略作改動。取齊墩果酸標準品2.00 mg，定容至10 mL。取不同量標準品液制成0.003 6、0.004 8、0.006 0、0.007 2、0.008 4、0.009 6、0.010 8、0.012 0、0.013 2、0.014 4 mg/mL濃度的樣品，水浴，冷卻后加入0.20 mL香草醛-冰醋酸、0.80 mL高氯酸，60℃水浴15 min。冷卻后加入5.00 mL冰醋酸，于550 nm下測吸光度。標準曲線為：A=0.037 6c-0.021 0，R2=0.999 2。吸取山茱萸樣品50 μL，相同的方法測定，取3次結(jié)果平均值為測定結(jié)果。

1.3.4 總環(huán)烯醚萜苷含量測定

HPLC色譜條件： Phenomenex luna ODS 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：35 ℃，波長：240 nm，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL。流動相：A (冰乙酸)，B(乙腈)；梯度洗脫：0～15 min，10%～20% B；15～19 min，20%～22% B；19～25 min，22%～25% B；25～35 min，25%～27% B；35～50 min，27%～70% B；50～55 min，70%～10% B。莫諾苷、馬錢苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷的線性回歸方程見表2。在此條件下，測定各個成分的峰面積，計算各產(chǎn)地山茱萸藥材環(huán)烯醚萜苷的含量，取3次平均值即為測定結(jié)果。

表2 各成分線性回歸方程

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量分析

表3顯示了15批山茱萸藥材中總皂苷和環(huán)烯醚萜苷的含量，不同產(chǎn)地之間含量存在顯著差異，其中總皂苷含量以河南西峽最高，其次為陜西佛坪；總環(huán)烯醚萜苷含量以浙江淳安最高，其次為河南西峽；總皂苷含量的變化幅度為13.55～26.65 mg/g，總環(huán)烯醚萜苷含量的變化幅度為23.05～32.68 mg/g。

表3 不同產(chǎn)地山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量

對表3進行多重比較分析，結(jié)果顯示15個產(chǎn)地間的山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷的含量存在顯著差異。河南西峽、陜西佛坪的總皂苷含量最高，分別為26.22 mg/g、25.80 mg/g。安徽石臺在所選的15個產(chǎn)地中含量最低，為13.55 mg/g，其中山西陽城、河南魯山、浙江淳安、陜西丹鳳、湖北?？?、湖北南漳和湖北鄖縣7個產(chǎn)地之間總皂苷含量無明顯差異，平均含量為17.86 mg/g。15個產(chǎn)地的總環(huán)烯醚萜苷含量多重比較分析表明，浙江淳安和河南西峽兩地的總環(huán)烯醚萜苷含量最高，分別為32.67 mg/g和31.68 mg/g，但和陜西丹鳳、佛坪等地差異不顯著。

2.2 地理因子相關(guān)性分析

采用Person對總皂苷和環(huán)烯醚萜苷與產(chǎn)地地理因子進行相關(guān)性分析。表4顯示山茱萸總皂苷含量與產(chǎn)地海拔、緯度和無霜期正相關(guān)，其中與海拔呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與經(jīng)度、年降雨量、年日照、年均氣溫負相關(guān)，其中與經(jīng)度呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，表明總皂苷含量隨著海拔的升高而增加，隨著經(jīng)度的增加而減少，出現(xiàn)明顯的東西部地域分化即西高東低的趨勢；山茱萸總環(huán)烯醚萜苷與經(jīng)度、年降雨量、年均氣溫、無霜期正相關(guān)，但相關(guān)性不顯著(P>0.05)，與海拔、緯度負相關(guān)，但相關(guān)性也不顯著(P>0.05)，與年日照無相關(guān)性，究其原因可能是由于不同產(chǎn)地對環(huán)境因子響應(yīng)的差異性減弱了其相關(guān)性。圖1顯示總皂苷與經(jīng)度、海拔之間的散點圖，Loess加擬合線，結(jié)果顯示山茱萸總皂苷含量隨產(chǎn)地經(jīng)度的增加逐漸遞減，整體表現(xiàn)出西高東低的變化趨勢，而隨產(chǎn)地海拔的增加逐漸遞增，與其他5個地理因子之間不顯著相關(guān)；山茱萸總環(huán)烯醚萜苷含量與地理因子無顯著相關(guān)，表明次生代謝產(chǎn)物是植物與環(huán)境長期相互作用的結(jié)果[16]，各種生態(tài)因子對植物的次生代謝產(chǎn)物起一種連續(xù)的、動態(tài)的生態(tài)綜合作用，而不是單一的對植物起作用，影響著植物次生代謝產(chǎn)物的生成與動態(tài)變化[17-18]。

2.3 不同產(chǎn)地山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量的聚類分析

根據(jù)表4和圖1的結(jié)果，對15個產(chǎn)地山茱萸的總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷與海拔、經(jīng)度進行SPSS聚類分析，結(jié)果如圖2所示。15個產(chǎn)地的山茱萸種質(zhì)資源大致可分為四類，第一類有4個產(chǎn)地，分別是：浙江臨安、安徽歙縣、安徽石臺、安徽霍山，其皂苷平均含量為14.58 mg/g，總環(huán)烯醚萜苷平均含量為27.18 mg/g；第二類有5個產(chǎn)地，分別是：河南鞏義、河南魯山、浙江淳安、湖北南漳、湖北?？担湓碥掌骄繛?7.28 mg/g，總環(huán)烯醚萜苷含量為30.32 mg/g；第三類有3個產(chǎn)地，分別是：湖北鄖縣、山西陽城、陜西丹鳳，其皂苷平均含量為17.69 mg/g，總環(huán)烯醚萜苷含量為27.57 mg/g；第四類有3個產(chǎn)地，分別是：河南內(nèi)鄉(xiāng)、河南西峽、陜西佛坪，其皂苷平均含量為24.35 mg/g，總環(huán)烯醚萜苷含量為27.13 mg/g。在四類中，前兩類經(jīng)度較大，海拔較高，且親緣關(guān)系和地理位置較近，又可聚為一大類，其皂苷及總環(huán)烯醚萜苷的平均含量為45 mg/g；后兩類經(jīng)度相對較小，海拔較高，且山茱萸中總皂苷及總環(huán)烯醚萜苷的平均含量為53.37 mg/g，其中的陜西丹鳳、河南西峽、陜西佛坪的總皂苷及總環(huán)烯醚萜苷含量均較高，可作為山茱萸種質(zhì)資源的優(yōu)良產(chǎn)地。

表4 山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量與地理因子的相關(guān)系數(shù)分析

圖1 山茱萸總皂苷含量與海拔和產(chǎn)地經(jīng)度間的關(guān)系

圖2 不同產(chǎn)地山茱萸總皂苷、總環(huán)烯醚萜苷的聚類分析圖

3 討論與結(jié)論

山茱萸為世界三大名貴木本藥材之一，其藥用和食用價值已具有1 500多年的歷史，控制其質(zhì)量對山茱萸的開發(fā)應(yīng)用意義重大。2015年版《中國藥典》以馬錢苷和莫諾苷含量作為山茱萸質(zhì)量的控制標準[2]。然而，僅以馬錢苷和莫諾苷作為其質(zhì)量的控制標準比較單一，缺乏全面性和系統(tǒng)性，尋找新的質(zhì)量控制標準，有助于山茱萸類產(chǎn)品的深度開發(fā)，更好地應(yīng)用于醫(yī)藥和保健行業(yè)。研究表明，山茱萸主要含有環(huán)烯醚萜苷、皂苷、有機酸、酯類、鞣質(zhì)、黃酮和多糖等多種成分[19-21]。皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，陸地高等植物中含量較多，如人參、桔梗等，具有降血糖血脂、保護神經(jīng)元、抗癌和保護腎臟等藥理活性；萬靜枝等[22]發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參皂苷通過激活Sirt1蛋白抑制線粒體功能障礙來改善D-半乳糖對神經(jīng)細胞的損傷；張紫薇等[23]從耐藥、抗炎和血管生成等多方面對薯蕷皂苷的抗癌機制進行闡述，為開發(fā)薯蕷皂苷的抗癌藥物提供理論依據(jù)。王娟[24]等和關(guān)悅等[25]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3和苦瓜總皂苷均對糖尿病腎病大鼠有保護作用。鑒于皂苷的藥用價值，考慮亦可將總皂苷含量作為山茱萸質(zhì)量控制的標準之一。環(huán)烯醚萜類化合物具有多種生物活性，其中馬錢苷、莫諾苷和獐牙菜苷是山茱萸中最主要的環(huán)烯醚萜苷成分。許多研究表明[26]山茱萸環(huán)烯醚萜苷中含量較高的馬錢苷與莫諾苷對保護神經(jīng)元、抑制黑素和改善糖尿病有顯著作用。HE等[27-28]發(fā)現(xiàn)山茱萸中的馬錢苷，莫諾苷，熊果酸可以保護胰島β細胞免受高糖誘導(dǎo)的過度氧化應(yīng)激和細胞凋亡；LV、JIANG等[29-30]發(fā)現(xiàn)山茱萸環(huán)烯醚萜苷還可以通過減少NF-κB及其下游合成酶和細胞因子的產(chǎn)生顯著減輕糖尿病器官損傷。因此，山茱萸中總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷的含量，可為山茱萸質(zhì)量控制提供重要參考依據(jù)。

山茱萸是多年生小喬木，喜生長在400～1 200 m海拔之間，主要分布于陜西、河南、浙江、安徽、山西和湖北，產(chǎn)地的不同，意味著海拔、溫度、氣候的差異性。本研究通過對不同產(chǎn)地山茱萸樣品中總皂苷與總環(huán)烯醚萜苷的測量，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地間含量差異顯著，表明地理因子對山茱萸總皂苷和總環(huán)烯醚萜苷含量有著重要的影響；有效成分產(chǎn)地地理環(huán)境因子的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，總皂苷含量與產(chǎn)地經(jīng)度呈負相關(guān)、與海拔呈正相關(guān)，東西地域間存在明顯的分化，即西部低于東部的變異趨勢。郭蘭萍[31]和NCUBE[32]研究表明，植物次生代謝產(chǎn)物受生態(tài)因素直接或間接的影響，如：產(chǎn)地氣候、環(huán)境、土壤等，具有明顯的地域特性；與海拔和地理位置有顯著的相關(guān)性。因此，不同產(chǎn)地的地理因子的差異是造成山茱萸次生代謝物含量不同的主要因素。

近年來，道地性藥材品質(zhì)的提升是中藥現(xiàn)代化的基石，需要根據(jù)產(chǎn)地地理環(huán)境、自然氣候等自然環(huán)境特點對道地藥材種植進行合理規(guī)劃。因此，對于山茱萸資源發(fā)展和利用來說，探索山茱萸有效成分含量和環(huán)境因子的相關(guān)性將會為山茱萸道地性和有效成分形成的生態(tài)機制提供重要參考。在15個產(chǎn)地中，陜西丹鳳、佛坪和河南西峽的皂苷和環(huán)烯醚萜苷的含量均較高，可作為山茱萸種質(zhì)資源的優(yōu)良產(chǎn)地。