麥洼牦牛冷凍精液效果試驗(yàn)

楊 壯，劉曉霞，趙睿驍，陳科宇，李小偉，何小強(qiáng)，王燕文，周凡莉，趙曉東，肖 敏，何明珠，唐 瑞，羅光榮*

（1.四川省龍日種畜場(chǎng)，四川 紅原624401；2.四川高原牦牛生態(tài)科技開發(fā)有限責(zé)任公司，四川 紅原624401）

麥洼牦牛（BOS MUTUS）主產(chǎn)于四川阿壩州的紅原、阿壩及若爾蓋縣，是川西北地區(qū)具有代表性的高原家畜，也是當(dāng)?shù)刂饕纳a(chǎn)資料[1-3]。近年來，隨著超載過牧、草原退化以及長期近親繁殖等因素的影響[4]，導(dǎo)致麥洼牦牛的后代生產(chǎn)性能逐漸降低，許多優(yōu)良的基因資源沒有得到很好地挖掘利用，通過有效的保種工作，將繁殖性能高、生產(chǎn)性能好、抗逆性強(qiáng)的麥洼牦牛種質(zhì)資源保存下來，防止品種資源退化，培育高產(chǎn)牲畜[5]成為必然。

凍精是指運(yùn)用超低溫冷凍技術(shù)將動(dòng)物新鮮精液保存起來，以便于精子使用和保存，是一種優(yōu)良的遺傳資源保存及推廣手段[6，7]。精液冷凍技術(shù)的研究，使得精子在體外保存時(shí)間大大延長，我國從80年代初從國外引進(jìn)生產(chǎn)冷凍精液的技術(shù)和設(shè)備，開始研究推廣液氮冷凍精液技術(shù)。根據(jù)凍精制作劑型的不同，相繼開發(fā)了顆粒凍精和細(xì)管凍精兩種劑型[8]。與細(xì)管凍精相比，在衛(wèi)生方面，由于顆粒凍精完全裸露在空氣和液氮中，易污染、易破損。而細(xì)管凍精由于封閉在細(xì)管中，其被污染率大大降低。在科學(xué)標(biāo)記方面[9]，顆粒凍精多為幾十粒甚至上百粒合裝，一旦散失，顆粒上既無包裝又無標(biāo)記，很容易造成品種混雜，而細(xì)管凍精每支均有詳細(xì)標(biāo)記，杜絕了此類事故的發(fā)生。在人工授精操作方面，顆粒凍精在人工授精時(shí)需要解凍試管、注射器及相關(guān)的消毒物品輔助進(jìn)行，而細(xì)管凍精則省去了解凍液、解凍管、注射器等用具，操作較為簡(jiǎn)易。在精液質(zhì)量指標(biāo)和使用效果上也有研究顯示解凍后精子活力和存活時(shí)間要顯著高于顆粒凍精[10]。精子活力強(qiáng)和存活時(shí)間久，說明精子存活率高，相應(yīng)也會(huì)提高母牛受胎率及犢牛生產(chǎn)率，直接與經(jīng)濟(jì)效益掛鉤?？偠灾?，從衛(wèi)生、科學(xué)、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等方面分析，細(xì)管凍精比顆粒凍精有著明顯的優(yōu)越性。因此，90年代后冷凍精液逐步由顆粒型轉(zhuǎn)向細(xì)管型。

目前，對(duì)麥洼牦牛冷凍精液相關(guān)研究較少，為進(jìn)一步做好麥洼牦牛優(yōu)秀種質(zhì)資源的保種工作，2021年4月，四川省龍日種畜場(chǎng)與四川高原牦牛生態(tài)科技開發(fā)有限責(zé)任公司按照牛冷凍精液國家標(biāo)準(zhǔn)（GB4143-2008）方法開展麥洼牦牛細(xì)管凍精質(zhì)量測(cè)評(píng)，以期達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，為后期優(yōu)秀遺傳資源保存、開展凍精推廣等工作打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 凍精來源

麥洼牦牛冷凍精液于2020年取自四川省龍日種畜場(chǎng)牦牛原種場(chǎng)，通過人工采集所收集，精液采集后加入配平的平衡液后，暫存至-6℃車載冷凍冰箱，運(yùn)送至都江堰綜合科研基地開展細(xì)管凍精制作，并保存至-193℃的液氮罐[11]。

1.2 凍精質(zhì)量檢測(cè)

1.2.1 精子活力檢查

1.2.1.1 主要器材 熒光相差顯微鏡、恒溫水浴鍋、5.0 mL試管、載玻片、蓋玻片、烘片機(jī)、移液槍。

1.2.1.2 檢查方法 將凍精置于37℃恒溫水浴鍋中解凍，取解凍精液20 μL置于載玻片上加蓋玻片，玻片置于恒溫于38℃的烘片機(jī)上，待放置2 min后，置于400倍熒光顯微鏡下觀察活力。每片樣觀察3個(gè)視野，進(jìn)行精子活力評(píng)定。按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB4143-2008）要求，精子活力≥35%（即0.35）即為合格。

精子活力評(píng)價(jià)值M=n1+n2+n3/3

式中，M為活力；n1為第一視野活力；n2為第二視野活力；n3為第三視野活力。

1.2.2 前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)檢查

1.2.2.1 主要器材 熒光相差顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、移液槍、小試管、計(jì)數(shù)器、3.0%Nacl溶液。

1.2.2.2 檢查方法 用移液槍吸取解凍后的精液20 μL，注入盛有0.98 mL的3.0%Nacl溶液中，混勻，使其稀釋成50倍的稀釋精液。用移液槍吸取稀釋精液20 μL放于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，用蓋玻片蓋好，使精液自然流入計(jì)數(shù)室，均勻填充，用400倍熒光相差顯微鏡鏡檢。按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB4143-2008）要求，前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)≥800萬個(gè)即為合格。

前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)c=s×m

式中，c為每計(jì)量前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)；單位為個(gè)，s為每計(jì)量中的精子數(shù)，單位為個(gè)；m為活力。

1.2.3 精子畸形率檢查

1.2.3.1 主要器材 熒光相差顯微鏡、載玻片、計(jì)數(shù)器、移液槍、蒸餾水、姬姆薩染液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醛、甲醇、甘油。

1.2.3.2 試劑配置 磷酸鹽緩沖液：磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.55 g；磷酸氫二鈉（NaH2PO4·12H2O）2.25 g；雙蒸餾水定容至100 mL。中性福爾馬林固定液：40%甲醛HCHO8.0 mL；磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.55 g；磷酸氫二鈉（NaH2PO4·12H2O）2.25 g，用濃度為0.89%Nacl50.0 mL溶解后加入8.0 mL中和后的甲醛，再加0.89%Nacl溶液定容至100.0 mL。姬姆薩原液：姬姆薩染液2.0 g；磷酸鹽緩沖液3.0 mL；蒸餾水5.0 mL。

1.2.3.3 制片、染色、鏡檢、抹片 用移液槍取解凍后的精液20 uL，置于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片呈夾角，將樣品均勻的涂布于載玻片上，自然風(fēng)干，風(fēng)干時(shí)間約為5 min；固定：在已風(fēng)干的抹片上滴上1.0 mL中性福爾馬林固定液，固定10 min后用清水沖去固定液，自然風(fēng)干；染色：將姬姆薩染液滴于自然風(fēng)干且固定好的抹片上，進(jìn)行染色，染色10 min，用清水沖去染液，自然風(fēng)干待檢；鏡檢：將處理好的抹片置于400倍熒光相差顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，每個(gè)抹片觀察200個(gè)以上的精子，進(jìn)行畸形精子計(jì)數(shù)。按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB4143-2008）要求，精子畸形率≤18%即為合格。

精子畸形率A=A1/S×100%

式中，A為精子畸形率；A1為畸形精子數(shù)，單位為個(gè)，S為精子總數(shù)，單位為個(gè)。

1.2.4 細(xì)菌數(shù)的檢查

1.2.4.1 主要器材 培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、燒杯、玻棒、天平、牛角匙、高壓滅菌蒸汽鍋、培養(yǎng)皿、水浴箱、pH試紙（pH5.5～9.0）、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、紗布、放大鏡、牛肉浸膏、蛋白胨、磷酸氫二鉀、Nacl、瓊脂粉、1 moL/L氫氧化鈉、1 moL/L鹽酸、蒸餾水。

1.2.4.2 培養(yǎng)基的配置 胰蛋白胨10 g；酵母粉5 g；氯化鈉10 g；瓊脂粉30 g。用1 L蒸餾水定容，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4范圍內(nèi)，然后分裝于三角燒瓶中高壓滅菌（121℃滅菌20～30 min）[12]。

1.2.4.3 檢查方法 細(xì)管冷凍精液置于37℃恒溫水浴鍋中解凍，用酒精棉球消毒以無菌操作，一支直接注于一個(gè)滅菌平板中；把冷卻至50℃左右的普通瓊脂以無菌操作傾倒入平板中，每個(gè)平板約15 mL，倒入平板時(shí)，轉(zhuǎn)動(dòng)平板使精液均勻混合。待瓊脂凝固后反轉(zhuǎn)平板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h取出，計(jì)數(shù)平板中的菌落個(gè)數(shù)。按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB4143-2008）要求，細(xì)菌數(shù)≤800個(gè)即為合格。

細(xì)菌數(shù)=每個(gè)平板中的細(xì)菌總數(shù)，不做細(xì)菌類別區(qū)分。

2 結(jié)果與分析

通過國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)觀察凍精樣品后，結(jié)果詳見圖1和表1。

圖1 麥洼牦牛細(xì)管凍精樣品

冷凍精液在37℃解凍后4 h內(nèi)，通過鏡檢活力仍能達(dá)到35%以上（表1）；冷凍精液經(jīng)過稀釋后，通過鏡檢精子密度較高；通過鏡檢，發(fā)現(xiàn)精子呈現(xiàn)出多種畸形狀態(tài)，出現(xiàn)尾部彎曲、頭尾折疊的畸形較多；從細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果看，精液內(nèi)的細(xì)菌含量較少，細(xì)菌數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)要求。試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨機(jī)抽取的15支牦牛凍精經(jīng)過檢測(cè)均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)（GB4143-2008）要求。

表1 麥洼牦牛細(xì)管凍精質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

精子是生命延續(xù)的基礎(chǔ)條件，運(yùn)用優(yōu)質(zhì)的精液于生產(chǎn)實(shí)踐中，能夠加快畜禽品種改良、調(diào)整地區(qū)畜禽結(jié)構(gòu)及豐富物種多樣性，冷凍精液保存正是優(yōu)秀種質(zhì)資源得以延續(xù)的重要載體。在牦牛本品種改良工作中，運(yùn)用牦牛細(xì)管凍精，能加快本地生產(chǎn)性能較為落后的弱母畜品種復(fù)壯，縮短牦牛飼喂周期、提升牦牛生產(chǎn)性能，提高養(yǎng)殖牧戶的經(jīng)濟(jì)效益[13]。

對(duì)公牛精液質(zhì)量的要求與母牛受胎率有著密切的關(guān)系，而“活力”則常被作為評(píng)價(jià)精液質(zhì)量的首要指標(biāo)。在不同時(shí)間段不同品種公牛精子活力的比較研究中發(fā)現(xiàn)[14]，不管是保存時(shí)間中表現(xiàn)的活力，還是精子存活力指數(shù)的評(píng)價(jià)，牦牛始終保持著強(qiáng)勢(shì)，特別是在14 h仍保持在18%的活力，顯著高于其他各品種牛。從抗逆性方面看，生活在高寒低溫環(huán)境中的牦牛，常年的風(fēng)土馴化使其產(chǎn)生了良好的適應(yīng)性，其公牛精子在生存能力上也表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性和存活力。我們的試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），所有樣品的精子活力均能達(dá)到35%以上，甚至部分達(dá)到80～90%，也同樣驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

除精子活力外，牦牛冷凍精液前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)也是評(píng)價(jià)凍精產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵性指標(biāo)之一，前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)不僅與受胎率有關(guān)，還關(guān)系到優(yōu)秀種公畜冷凍精液的產(chǎn)量及優(yōu)秀遺傳資源的利用率，在總精子數(shù)不變的情況下，有效精子數(shù)越多，受精率越高[15，16]。如表1所示，我們的所有實(shí)驗(yàn)樣品中前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)均≥800萬個(gè)，說明正常功能的精子數(shù)達(dá)到足夠數(shù)量，精子的受精能力可以得到保證。

與此同時(shí)，在牦牛凍精批量生產(chǎn)的過程中,不能只把精子的活力和密度作為精液品質(zhì)檢查的重要指標(biāo),而忽視了對(duì)畸形精子和細(xì)菌數(shù)的檢查。精子畸形率對(duì)母牛的受胎率有很大影響[17，18]，如果活力不夠、有效精子數(shù)量太低，畸形率和細(xì)菌數(shù)又太高,那么母牛的受孕率也會(huì)大大降低，因此精子畸形率以及細(xì)菌數(shù)也是保證凍精質(zhì)量過關(guān)的重要指標(biāo)，而我們的結(jié)果顯示（表1），精子畸形率以及細(xì)菌數(shù)遠(yuǎn)低于國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)，說明符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

此外，為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實(shí)際操作過程中仍要注意以下幾點(diǎn)：一是在冷凍精液的保存中要注意液氮罐的密封性，防止因液氮不足而導(dǎo)致凍精失活；二是在細(xì)管凍精解凍后要盡快完成整個(gè)流程的質(zhì)量檢測(cè)工作，抽樣數(shù)量一次性不宜抽檢過多，以免精子因長期暴露在自然條件下喪失活性降解；三是檢驗(yàn)人員對(duì)精子活力的判斷要客觀，要掌握精子不同類型的畸形狀態(tài)，以免錯(cuò)判；四是在配置培養(yǎng)基時(shí)，要注意整個(gè)配置流程均為無菌操作，以免細(xì)菌落入培養(yǎng)基中，影響檢測(cè)結(jié)果。

總而言之，優(yōu)秀種質(zhì)資源的保存不能僅僅依靠?jī)?yōu)秀種質(zhì)本身，更多的要運(yùn)用現(xiàn)代科技的技術(shù)手段，在不改變其生活狀態(tài)的前提下，開展優(yōu)秀資源的挖掘及保存。凍精技術(shù)在畜牧業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展進(jìn)程中起到不可替代的作用，它在畜禽養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)調(diào)整、轉(zhuǎn)變養(yǎng)殖模式、畜牧業(yè)提質(zhì)增效等方面具有十分重要的意義。

4 結(jié) 論

在精子總數(shù)不變的情況下，精子質(zhì)量越高、活力越好，母畜受精率就越高，繁育出來的種畜質(zhì)量也就越好[19]。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨機(jī)抽測(cè)的15支麥洼牦牛細(xì)管凍精均符合國家標(biāo)準(zhǔn)（GB4143-2008），由此可以說明我單位生產(chǎn)麥洼牦牛凍精質(zhì)量良好，可用于優(yōu)秀種質(zhì)資源的推廣工作中。