楊紅玉，張敏，馬超鋒，閆文朝

(1. 南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 南陽 473000；2. 焦作市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 焦作 454150；3. 信陽市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 信陽 464000；4. 河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023)

肉孢子蟲病是由肉孢子蟲(Sarcocystis)寄生于多種宿主的肌肉而引起的一種人獸共患原蟲病，豬、牛、羊和鳥類等多種動物均可感染。肉孢子蟲屬于孢子蟲綱、真球蟲目、肉孢子蟲科。肉孢子蟲屬有200多個蟲種，不同蟲種的中間宿主和終末宿主也存在差異。一些蟲種感染動物后不表現(xiàn)明顯癥狀，而有些蟲種可對中間宿主表現(xiàn)明顯致病性，引起動物貧血、發(fā)熱、嗜酸性粒細胞肌炎、流產(chǎn)或者死亡。人因食用含有蟲體的肉制品主要是豬肉而感染，出現(xiàn)發(fā)熱、惡心、嘔吐和腹瀉等癥狀[1-2]。因此，開展豬的肉孢子蟲調(diào)查和研究具有重要的經(jīng)濟價值和公共衛(wèi)生意義。

豬是肉孢子蟲的中間宿主。根據(jù)報道，豬有3種肉孢子蟲，米氏肉孢子蟲(S.miescheriana)、豬人肉孢子蟲(S.suihominis)和豬貓肉孢子蟲(S.porcifelis)，其中米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲流行最為廣泛且致病性最強，曾引起豬場肉孢子蟲病暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來較大危害和損失[1，3]。本研究采用劉婕等[4]開發(fā)的豬源肉孢子蟲雙重套式PCR檢測試劑盒對河南省11個地市62家屠宰場開展生豬肉孢子蟲感染情況調(diào)查，以期掌握河南省豬的肉孢子蟲感染情況，為該地區(qū)肉孢子蟲病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及處理

2018年6月—2019年10月，在河南省11個地市62個屠宰場采集膈肌樣品2 038份，每份5～8 g，登記樣品來源(年存欄大于500頭為規(guī)模場，少于500頭為散養(yǎng)戶)，冷藏帶回實驗室，統(tǒng)一編號登記，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.2 主要檢測試劑

普通Taq聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、10×緩沖液、瓊脂糖等購自大連寶生物工程有限公司；組織細胞DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司；豬源肉孢子蟲雙重套式PCR檢測試劑盒由河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院動物檢疫實驗室提供。

1.3 主要試驗儀器

全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)；5424R高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；LC-800低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)；PCR儀(德國Biometre公司)；Eppendorf 不同量程單道移液器及25～300 μL多道移液器(德國Eppendorf公司)；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(以色列DNA公司)；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇晶玻實驗儀器廠)等。

1.4 引物的設(shè)計與合成

參考文獻[4]的報道米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲特異引物(如表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 豬源肉孢子蟲雙重套式PCR檢測引物

1.5 檢測方法

將采集的樣品剪成小塊放入離心管中，隨后加入液體在全自動樣品快速研磨儀上制成勻漿；采用組織細胞DNA提取試劑盒提取處理過樣品的總DNA，操作方法參照試劑盒說明書進行；將提取的總DNA作為模板，采用文獻[4]建立的肉孢子蟲雙重套式PCR方法對待檢樣品進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲擴增產(chǎn)物的大小分別為415和591 bp。

反應(yīng)條件：第一輪擴增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。第二輪PCR 擴增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.6 檢測數(shù)據(jù)分析

結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進行分析，分別對不同地區(qū)屠宰場肉孢子蟲場陽性率和樣品陽性率、不同規(guī)模豬群肉孢子蟲陽性率、不同季節(jié)屠宰場肉孢子蟲陽性率進行χ2檢驗分析差異顯著性，P<0.05時差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 河南省屠宰場肉孢子蟲總體感染情況

從圖1可以看到，本次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的只有米氏肉孢子蟲(415 bp)。本次檢測調(diào)查河南省11個地市的62個屠宰場，肉孢子蟲陽性場37個，平均場陽性率為59.7%，最高的為駐馬店、商丘和鄭州，均為66.7%，其次為信陽，為62.5%；場陽性率最低的為安陽和漯河，陽性率均為33.3%。2 038份樣品的平均陽性率為29.4%，南陽、駐馬店、信陽、鄭州、周口和新鄉(xiāng)樣品陽性率均超過30%，周口樣品陽性率最高，為37.1%；陽性率最低為漯河和安陽，分別為為10.5%和11.1%(見表2)。χ2檢驗分析表明，河南不同地區(qū)屠宰場肉孢子蟲場陽性率差異不顯著(P>0.05)，不同地區(qū)間樣品陽性率均差異極顯著(P<0.01)。

表2 樣品來源及抗體陽性率

M．DL2000 DNA Marker；1～6.被檢樣品；7.陽性對照；8.陰性對照

2.2 河南省不同規(guī)模豬場肉孢子蟲感染情況

本次調(diào)查根據(jù)豬的來源，分為規(guī)模場(存欄500頭以上)和散養(yǎng)戶(存欄500頭以下)。從表3可以看出，散養(yǎng)戶的肉孢子蟲陽性率(32.3%)略高于規(guī)模場(27.7%)。χ2檢驗分析表明，不同規(guī)模豬場肉孢子蟲陽性率差異顯著(P<0.05)。

表3 不同場點類型豬場肉孢子蟲感染率

2.3 河南省屠宰場不同季節(jié)豬肉孢子蟲感染情況

本次屠宰場生豬肉孢子蟲感染調(diào)查，每個季節(jié)均有陽性檢出，其中，春季最高，達到33.8%，冬季最低為26.1%(見表4)。χ2檢驗分析表明，不同季節(jié)豬群肉孢子蟲陽性率差異不顯著(P>0.05)。

表4 屠宰場不同季節(jié)肉孢子蟲感染率

3 討論

肉孢子蟲病是一種重要的人獸共患寄生蟲病，感染后會對人體健康造成一定的危害。牛、羊、豬等動物是肉孢子蟲傳播的中間宿主，與人類密切接觸，因此查清肉孢子蟲的感染狀況，有重要公共衛(wèi)生意義。豬肉因其較高的營養(yǎng)價值而為人們所喜愛，我國每人年平均豬肉消費量為27.1 kg(2019年)，豬肉是國人餐桌的主要肉類。2019全年，河南省生豬出欄量達3 170萬頭，對屠宰生豬開展肉孢子蟲感染調(diào)查有重要的公共衛(wèi)生意義。本次共調(diào)查11個地區(qū)的62個屠宰場，場陽性率為59.7%，樣品陽性率為29.4%；這與曹謙[5]調(diào)查的青海同仁縣隆務(wù)地區(qū)豬感染率83.15%，馮成蘭等[6]調(diào)查的青海共和地區(qū)屠宰生豬感染率61.91%，周偉業(yè)[7]調(diào)查的青海冷湖地區(qū)的感染率47.34%，王榮菊等[8]調(diào)查的青海西寧屠宰場豬感染率44%相比，都要低；與薛瑞等[9]2018年調(diào)查的河南洛陽豬源肉孢子蟲感染率26.8%接近；遠高于李明偉等[10]對湛江市豬肉孢子蟲調(diào)查的感染率2.05%，張浩吉等[11]對廣州地區(qū)豬肉孢子蟲調(diào)查的感染率0.7%，李小軍等[12]對河南豫北地區(qū)豬肉孢子蟲調(diào)查的感染率0.238%。需要說明的是以上調(diào)查所采用的方法均是鏡檢壓片法，檢測結(jié)果靠主觀判斷，與檢測者水平有較大關(guān)系，存在一定誤差。周望平等[13]采用ELISA 方法對湖南地區(qū)開展豬肉孢子蟲病血清學(xué)調(diào)查，感染率為4.4%，低于本次調(diào)查的感染率。本次調(diào)查肉孢子蟲感染情況采用的雙重套式PCR檢測方法，具有敏感、特異和快捷等優(yōu)點，可以實現(xiàn)對豬肌肉組織和血液等樣品中肉孢子蟲的快速、準(zhǔn)確檢測，可以為豬肉孢子蟲病診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供高效的檢測手段和方法，可以大范圍推廣應(yīng)用。

本次調(diào)查將根據(jù)屠宰場豬的來源，將豬群劃分為規(guī)模場和散養(yǎng)戶，均有肉孢子蟲陽性檢出，說明不同場點豬場均有感染，分析散養(yǎng)戶陽性率高于規(guī)模場可能與規(guī)模場大多集約化養(yǎng)殖，有效切斷了中間宿主與終末宿主的聯(lián)系有關(guān)。從本次調(diào)查結(jié)果來看，河南省豬群一年四季均有肉孢子蟲感染，但是不同季節(jié)感染率有差異，春季感染率最高，夏季、秋季和冬季感染率較接近，其中冬季感染率最低。當(dāng)前還沒有特效藥物治療肉孢子蟲病，防治肉孢子蟲病主要采取綜合性防控措施切斷傳播途徑：一是豬場禁止飼養(yǎng)犬貓，犬貓作為肉孢子蟲的終末宿主，在肉孢子蟲的感染中起到重要作用；二是病死動物及時處理，禁止用生肉或者下水飼喂犬貓等動物。