注射用長春西汀中兩種磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的測(cè)定

焦?jié)?，王濤，妙苗（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，西安 710065）

注射用長春西汀是由主藥長春西汀和輔料甘露醇、山梨醇等制成的無菌粉針劑，臨床主要用于改善腦梗死后遺癥、腦出血后遺癥、腦動(dòng)脈硬化癥等誘發(fā)的各種癥狀[1]。其主要成分長春西汀是以長春胺為起始原料，經(jīng)脫水消除反應(yīng)、水解反應(yīng)和酯化反應(yīng)制得。在長春西汀中間體制備過程中使用了對(duì)甲苯磺酸作為催化劑，雖然在后續(xù)處理過程中進(jìn)行了充分的洗滌，但仍然可能殘留對(duì)甲苯磺酸，在后續(xù)的酯化反應(yīng)中會(huì)繼續(xù)反應(yīng)生成對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯。對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯為基因毒性雜質(zhì)，因此需要在成品質(zhì)量中嚴(yán)格控制其含量。

目前，對(duì)甲苯磺酸酯類的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[2-7]、液質(zhì)聯(lián)用法[8-11]、氣質(zhì)聯(lián)用法[12-13]等。高效液相色譜法具有低成本、分離效率快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。注射用長春西汀中這兩種基因毒性雜質(zhì)的測(cè)定還未見有報(bào)道。本研究建立了 HPLC 法測(cè)定注射用長春西汀中對(duì)甲苯磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸乙酯的含量，為該藥中潛在有害雜質(zhì)的檢測(cè)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），XPE-105 型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試藥

對(duì)甲苯磺酸甲酯（批號(hào)：F1012054；純度：98.0%）、對(duì)甲苯磺酸乙酯（批號(hào)：E1012037；純度：98.0%）（對(duì)照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；注射用長春西汀（15 個(gè)廠家，共計(jì)92 批樣品，包括5 mg、10 mg、20 mg、30 mg 4 種規(guī)格）；磷酸（西安試劑廠，分析純），乙腈（美國天地公司，色譜純），水為高純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ODS2 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61）；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長：225 nm；柱溫：35℃，進(jìn)樣體積：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯各適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋成含對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯各約0.25 μg·mL－1的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取供試品1 支，精密加入流動(dòng)相適量，振搖使溶解并稀釋制成每1 mL含長春西汀約為5 mg 的溶液，作為供試品溶液。

2.2.3 輔料空白溶液制備 根據(jù)各生產(chǎn)企業(yè)提供的注射用長春西汀處方，取甘露醇、枸櫞酸、山梨醇、焦亞硫酸鈉、維生素C、酒石酸、活性炭、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、亞硫酸氫鈉、依地酸二鈉等輔料適量，配制輔料空白，稱取適量，用流動(dòng)相溶解并過濾，作為注射用長春西汀輔料空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)

取流動(dòng)相（空白溶液）、對(duì)照品溶液、加標(biāo)供試品溶液（按“2.5”項(xiàng)下方法配制）和輔料空白溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液出峰順序依次為對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯，分離度為9.2，理論塔板數(shù)分別為13 359 和13 880，空白溶液和輔料對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 專屬性色譜圖Fig 1 Specific chromatogram

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取對(duì)甲苯磺酸甲酯12.24 mg 和對(duì)甲苯磺酸乙酯9.27 mg 同置100 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋到刻度，搖勻。精密量取2.5 mL，置100 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1、1.5、2、3 和4 mL，分別置20 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋到刻度，搖勻即得線性對(duì)照品溶液。

精密量取線性對(duì)照品溶液各20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)試，分別獲得相應(yīng)線性方程。對(duì)甲苯磺酸甲酯：Y＝6.36×104X－3.09×102，r＝1.000；對(duì)甲苯磺酸乙酯：Y＝6.12×104X－3.17×102，r＝1.000；對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯分別在0.15～0.60 μg·mL－1，0.11～0.45 μg·mL－1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 回收試驗(yàn)

考慮到各企業(yè)之間工藝和處方的差別，選擇注射用長春西汀使用輔料最多的A 公司樣品進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)。取A 公司生產(chǎn)的批號(hào)為DB190101 的樣品6 支（規(guī)格10 mg，對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯均未檢出），精密加入線性對(duì)照品溶液適量，搖勻。

精密量取對(duì)照品溶液和上述溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。對(duì)甲苯磺酸甲酯平均加樣回收率為98.9%，RSD＝1.2%；對(duì)甲苯磺酸乙酯平均加樣回收率為99.5%，RSD＝1.6%。結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度符合要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)6 份加標(biāo)樣品中對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯含量均值分別為0.0059%、0.0045%，RSD均小于1.6%，表明方法的重復(fù)性符合要求。

2.7 定量限和檢測(cè)限

取線性對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯的定量限（S/N≈10）分別為0.037 μg·mL－1和0.045 μg·mL－1，檢測(cè)限（S/N≈3） 分別為0.015 μg·mL－1和0.023 μg·mL－1。

2.8 精密度試驗(yàn)

精密量取甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯對(duì)照品溶液20 μL（質(zhì)量濃度分別為0.3、0.23 μg·mL－1，如前配制）連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得兩者峰面積的RSD分別為0.91%和2.0%。表明儀器的精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液于室溫放置 0、1、2、3、4、5、6 h，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯峰面積有變小的趨勢(shì)，但在6 h 內(nèi)峰面積變化RSD＜2.0%，建議供試品溶液在配制后6 h 內(nèi)測(cè)定。

2.10 樣品含量測(cè)定

取92 批注射用長春西汀樣品，分別按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果均未檢出甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

試驗(yàn)中先后考察了① 乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61），檢測(cè)波長為225 nm；② 乙腈-水（40∶60），檢測(cè)波長為220 nm；③ 乙腈-0.2 mol·L－1醋酸銨溶液（50∶50），檢測(cè)波長為260 nm 3 種體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種流動(dòng)相均可滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，但③的檢出限是①和②的10倍，且②的系統(tǒng)耐用性較差，故采用流動(dòng)相①。

3.2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)中先后考查了①Waters ODS2 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱、②Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱、③ACE Excel C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相條件下，3 種色譜柱均可滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，但在使用②和③色譜柱時(shí)2 種待測(cè)物均在長春西汀主成分之后出峰，由于供試品溶液濃度較大，有一定程度的拖尾，導(dǎo)致2 種待測(cè)物的靈敏度低，達(dá)不到限度要求。采用色譜柱①，待測(cè)物在長春西汀主峰前流出，可以杜絕高濃度樣品拖尾對(duì)待測(cè)組分的干擾，降低基線噪音，提高檢測(cè)的靈敏度。

3.3 待測(cè)物的確認(rèn)

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，部分廠家供試品溶液色譜圖中，在待測(cè)物甲苯磺酸甲酯保留時(shí)間附近還有其他色譜峰，為排除因保留時(shí)間漂移引起的漏檢，對(duì)上述樣品均進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證，結(jié)果表明，該色譜峰不是待測(cè)物，為長春西汀原料引入的雜質(zhì)。

3.4 限度的確定

根據(jù)ICH 規(guī)定，基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5 μg·d－1，長春西汀每日最大用量為30 mg，按此計(jì)算，確定本品中對(duì)甲苯磺酸甲酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯的限度為50 ppm，即不得過0.005%。