曾江琴，孫勤國，徐鴻婕，丁曉明，牟艷杰，蔣躍文

(1. 武漢市第三醫(yī)院 中醫(yī)科，武漢 430060；2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)臨床學(xué)院，武漢 430061)

高脂血癥(hyperlipidemia，HLP)是指由于機體血脂水平過高導(dǎo)致的全身性脂質(zhì)代謝紊亂性疾病，會誘發(fā)冠心病、腦栓塞、動脈粥樣硬化等一系列心腦血管疾病[1-2]。隨著生活水平的提高，高蛋白、高脂肪食物的攝取量日益增多，同時缺乏運動，導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過度積累，形成HLP[3]。HLP是中老年人的常見病，近些年發(fā)現(xiàn)，患病人群仍在不斷增加并呈逐漸年輕化發(fā)展[4]。因此，調(diào)控脂質(zhì)代謝，降低血脂水平對于心腦血管疾病的防治具有重要意義[5]。他汀類藥物是臨床上治療HLP的主要藥物，但其治療靶點單一，長期服用存在多種不良反應(yīng)[6]。因此，探尋有效且安全的HLP治療藥物具有重要意義。

在中醫(yī)學(xué)上，HLP被認為屬于“痰濁”、“瘀血”等范疇[7]。小陷胸湯最早出自《傷寒論》，由黃連、瓜蔞、半夏三味藥組成，具有清熱化痰、寬胸散結(jié)的功效[8]。本研究以高脂飼料喂養(yǎng)小鼠建立HLP模型，探究小陷胸湯對模型小鼠血脂以及免疫功能的影響，旨在為HLP的防治提供新的方向和理論參考。

1 材料

1.1 實驗動物36只5周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～22 g，購自三峽大學(xué)實驗動物中心。小鼠飼養(yǎng)于22～26 ℃，相對濕度50%～60%環(huán)境中，晝夜交替照明12 h/12 h。

1.2 實驗藥物小陷胸湯(黃連3 g、瓜蔞30 g、半夏12 g)，由武漢市第三醫(yī)院中藥房提供，用傳統(tǒng)方法浸泡、煎煮、過濾、濃縮，制成煎劑，調(diào)制至每毫升含生藥0.12、0.06及0.03 g(根據(jù)人與小鼠體表面積換算得出的劑量)，低溫冷藏備用。

1.3 實驗試劑洛伐他汀，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高脂飼料，購自北京華阜康生物科技股份有限公司；總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)檢測試劑盒，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；小鼠血清CRP ELISA檢測試劑盒，購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；PBS、鈣離子載體離子霉素、布雷非德菌素A(brefeldin A，BFA)，購自北京索萊寶科技有限公司；佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)購自Sigma-Aldrich公司；小鼠抗CD40-FITC、抗CD40L-PE、抗IL-4-PE、抗IFN-γ-PE、抗CD4-FITC抗體，購自eBioscience公司；破膜劑，購自BD公司。

1.4 實驗儀器全自動生化分析儀，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；酶標儀，購自Labsystems公司；CO2常溫培養(yǎng)箱，購自賽默飛世爾科技有限公司；FACS，購自艾森生物(杭州)有限公司 。

2 方法

2.1 HLP小鼠模型的構(gòu)建適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，對照組小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，模型組飼喂高脂飼料。飼喂8周后，夜間饑餓處理對照組和模型組小鼠，尾靜脈取血，檢測血清中TC和TG水平，模型組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義即為HLP模型構(gòu)建成功。

2.2 分組和給藥將小鼠隨機分為6組：陰性對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組，每組6只。除陰性對照組外，其余各組小鼠均進行HLP模型的構(gòu)建。建模成功后，低、中、高劑量組小鼠分別灌胃0.03、0.06和0.12 g/mL小陷胸湯，陽性對照組小鼠灌胃2.5 mg/kg洛伐他汀，陰性對照組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。給藥頻率為1次/d，連續(xù)8周。末次給藥結(jié)束后，稱取各小鼠體質(zhì)量。1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，處死后采集小鼠主動脈血液分離血清并收集小鼠脾臟、肝臟及主動脈血管組織，計算肝臟、脾臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)=(肝質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%；脾臟指數(shù)=(脾質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%

2.3 小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的檢測采用全自動生化分析儀測定小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，操作嚴格按照生化試劑盒說明書進行。

2.4 FACS檢測血管組織CD40+/CD40L+細胞百分比取各組主動脈血管組織樣本，用含5%雙抗的PBS漂洗后剪碎組織塊，經(jīng)0.25%胰酶及0.1% Ⅱ型膠原酶(體積比1∶1)37 ℃消化20 min。收集單細胞懸液，175×g離心10 min，棄上清液，PBS漂洗后備用。用100 μL 流式緩沖液重懸細胞，取1×106個細胞于1.5 mL離心管中，每管加入2 μL 抗CD40-FITC和抗CD40L-PE抗體，4 ℃避光孵育30 min；400×g離心5 min，棄上清液；400 μL PBS重懸細胞，使用FACS檢測。

2.5 FACS檢測脾臟組織Th1、Th2百分比取各組小鼠脾臟組織樣本，剪碎，37 ℃消化30 min，收集細胞懸液。經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾，175×g離心10 min，棄上清液，PBS漂洗1次。取1×106個細胞于1.5 mL離心管中，每管加入2 μL PMA(50 ng/mL)、離子霉素(2 μg/mL)和BFA(3 μg/mL)的混合物，培養(yǎng)6 h。PBS漂洗1次，4 ℃、400×g離心5 min，棄上清液；100 μL流式緩沖液重懸細胞，加入2 μL抗CD4-FITC抗體，4 ℃避光孵育30 min；加入1 mL固定劑，避光孵育20 min，4 ℃、400×g離心5 min，棄上清液；加入1 mL破膜劑，避光孵育40 min，4 ℃、400×g離心5 min，棄上清液；PBS重懸細胞，加入2 μL抗IFN-γ-PE、抗IL-4-PE抗體，4 ℃避光孵育45 min；400 μL PBS重懸細胞，使用FACS檢測。

2.6 ELISA檢測小鼠外周血CRP水平按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，稀釋標準品，繪制標準曲線。將各組小鼠血清加入待測樣本孔中，依次加入抗CRP-Biotin抗體、酶標試劑、顯色劑和終止液，于酶標儀檢測各孔光密度D(450 nm)值，通過標準曲線方程計算各組小鼠血清CRP水平。

3 結(jié)果

3.1 小陷胸湯對HLP小鼠臟器指數(shù)的影響與對照組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低(均P<0.05)，高劑量組和陽性對照組小鼠脾臟指數(shù)顯著下降(P<0.05， 表1)。

表1 各組小鼠臟器指數(shù)的變化

3.2 小陷胸湯對HLP小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響與對照組比較，模型組小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平顯著升高(均P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量組和陽性對照組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著降低(均P<0.05)，HDL-C水平顯著升高(均P<0.05, 表2)。

表2 各組小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的變化

3.3 小陷胸湯對HLP小鼠血清CRP水平的影響與對照組比較，模型組小鼠血清CRP水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠血清CRP水平顯著降低(均P<0.05, 圖1)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖1 各組小鼠血清CRP水平的變化

3.4 小陷胸湯對HLP小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比的影響與對照組比較，模型組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比顯著下調(diào)(均P<0.05, 圖2)。

注：A. FACS檢測各組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比；B. 各組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比統(tǒng)計結(jié)果。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖2 各組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比的變化

3.5 小陷胸湯對HLP小鼠脾臟Th1、Th2百分比的影響與對照組比較，模型組小鼠脾臟細胞中Th1百分比顯著增加(P<0.05)，Th2百分比顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組小鼠脾臟細胞中Th1和Th2百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；中、高劑量組和陽性對照組小鼠脾臟細胞中Th1百分比顯著減少(均P<0.05)，Th2百分比顯著增加(均P<0.05， 圖3)。

注：A～B. FACS檢測各組小鼠脾臟細胞中Th1和Th2百分比；C～D. 各組小鼠脾臟中Th1和Th2百分比的統(tǒng)計結(jié)果。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖3 各組小鼠脾臟細胞中Th1和Th2百分比的比較

4 討論

血脂異常表現(xiàn)為外周血TC、TG、LDL-C等一種或多種指標水平升高，或者HDL-C水平降低[9-10]。LDL-C參與肝臟中TC向肝外轉(zhuǎn)運的過程，其水平過高會導(dǎo)致TC、TG沉積，堵塞血管[11]。而HDL-C參與將外周組織中的TC轉(zhuǎn)運至肝臟的分解代謝，能夠減少TC在外周組織血管的沉積，有利于心血管系統(tǒng)健康[12]。CRP是一種典型的急性相血漿蛋白，常作為衡量臨床炎癥反應(yīng)的非特異性標志物[13]。研究表明，CRP與高血糖、高血脂及多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。本研究采用高脂飼料飼喂小鼠以構(gòu)建HLP模型，結(jié)果顯示，模型組小鼠血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高(均P<0.05)，HDL-C水平顯著下降(P<0.05)，符合HLP動物模型評價指標[15]，說明本研究成功構(gòu)建了HLP小鼠模型。經(jīng)不同劑量小陷胸湯給藥治療后，HLP小鼠CRP、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平得到不同程度改善，其中高劑量組的逆轉(zhuǎn)效果最為明顯。這提示小陷胸湯能抑制CRP水平，上調(diào)HDL-C，加速肝外TC和TG向肝內(nèi)轉(zhuǎn)運的代謝，即小陷胸湯具有降低HLP小鼠血脂的功效。

免疫損傷、炎癥反應(yīng)在HLP及其相關(guān)疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[16]，因此，調(diào)節(jié)免疫功能是HLP相關(guān)疾病的主要治療策略之一。免疫器官的質(zhì)量和相關(guān)指標是評價機體免疫系統(tǒng)狀態(tài)的重要指標。脾臟為體積最大的外周免疫器官，可對血源性抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)[17]。研究顯示，HLP小鼠脾臟指數(shù)降低，機體免疫功能下降[18-19]。肝臟在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)，改善肝臟脂質(zhì)代謝和減輕炎癥反應(yīng)可對高脂飲食誘導(dǎo)的HLP發(fā)揮較好的治療效果[20]。CD40/CD40L通路在免疫應(yīng)答的啟動中發(fā)揮重要作用[21]，抑制CD40/CD40L復(fù)合物水平可顯著減輕炎癥反應(yīng)程度[22]。Th1/Th2平衡在免疫調(diào)節(jié)過程中具有關(guān)鍵性作用，根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果顯示，調(diào)節(jié)脾臟Th1/Th2平衡向Th2偏移可發(fā)揮炎癥反應(yīng)抑制作用，從而實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)[23]。

本研究中，造模后小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著升高，CD40+/CD40L+細胞百分比顯著增加，Th1百分比顯著上升，Th2百分比顯著下降，而中劑量和高劑量小陷胸湯治療HLP小鼠后，臟器指數(shù)顯著下降，CD40+/CD40L+細胞百分比顯著減少，Th1百分比顯著下降，Th2百分比顯著上升，提示小陷胸湯能夠改善HLP小鼠臟器，調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)。

綜上所述，小陷胸湯可降低HLP小鼠TC、TG和LDL-C水平，提高HDL-C水平，改善小鼠免疫功能。但是，目前其作用靶點尚不明確，還需進一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理手段分析其主要活性成分及可能靶點并進行驗證，從而為小陷胸湯的應(yīng)用推廣提供更多實驗依據(jù)。