李明強，韓志俊，裴天容，代露露，宋姍姍，周艷萌

(1. 遵義醫(yī)科大學 微生物學與免疫學實驗室，遵義 563000；2. 遵義醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 急診科，遵義 563000)

抗體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，除已知的重要功能，還可縮短抗原性藥物在體內存留時間，影響藥物療效的發(fā)揮[1]。在體外可根據抗體與抗原反應的特異性和敏感性，應用免疫學技術檢測、鑒定抗原物質以及深入研究抗原性藥物[2-3]。蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜)為大蒜氨基酸成分，大蒜素前體物質，在蒜酶、代謝酶的作用下，蒜氨酸均可被其分解生成脂溶性有機含硫化合物，即大蒜素[4-6]，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節(jié)、防治心血管疾病等多種生物活性。蒜氨酸的檢測方法有利用蒜氨酸的化學性質測定其含量，但特異度、準確度差。利用蒜氨酸物理特性建立的色譜法[7-8]，結果相對可靠、準確，但需要繁瑣的樣本處理過程和高昂的硬件條件支持，成本較高。將免疫學技術應用于蒜氨酸檢測，其敏感度、特異度、可靠性都將得到極大提高，且方法簡便易行。要將免疫學技術應用于蒜氨酸的檢測與研究，蒜氨酸抗體的制備是關鍵。本研究將蒜氨酸與蛋白質結合形成完全抗原，結合弗氏佐劑免疫家兔制備蒜氨酸抗體并作初步研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物及試劑參照文獻[9]自紫皮大蒜提取蒜氨酸，將其配制成100 mg/mL溶液，備用。成年家兔20只，體質量1.5～2.0 kg，成年豚鼠1只，體質量250～300 g，兩者雌雄不拘，均為清潔級，購自遵義醫(yī)科大學實驗動物中心。卵清蛋白，購自華中海威(北京)基因科技有限公司。山羊抗兔IgG-FITC熒光抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。山羊抗兔IgG-Cy3熒光抗體，購自武漢賽維爾生物科技有限公司。FITC，購自蘇州亞科科技股份有限公司。金黃色葡萄球菌菌種CMCC26003、大腸埃希菌菌種CMCC44102，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 偶聯抗原的制備：參照文獻[10-11]，制備濃度為40 mg/mL的卵清蛋白溶液20 mL，加入蒜氨酸溶液2 mL，攪拌5 min至出現乳白色沉淀。

固定抗原的制備：將偶聯抗原加入甲醛溶液，室溫靜置30 min，離心后收集沉淀，PBS漂洗3次，最后用等量PBS稀釋。

1.2.2 動物的分組與免疫 將20只家兔隨機分為2組，每組10只。家兔按表1程序免疫，聯合弗氏完全佐劑，每次免疫后間隔7 d進行下一次免疫，共免疫4次。末次免疫7 d后采血，分離血清，檢測抗蒜氨酸抗體。皮內和皮下注射采用1次劑量多點連續(xù)注射；靜脈注射采用脫敏注射方法進行，1次免疫劑量分3次注射，8 h內完成1次免疫。

表1 家兔免疫注射程序

1.2.3 蒜氨酸抗體的檢測 離心抗凝血分離紅細胞，PBS漂洗3次。參照文獻[12]用蒜氨酸包被紅細胞，最后用PBS將紅細胞配制成2%致敏紅細胞懸液。

參照文獻[12]用紅細胞懸液進行玻片間接血凝試驗和試管間接血凝試驗，檢測蒜氨酸抗體及其效價。

1.2.4 蒜氨酸抗體的鑒定 離心抗凝血分離淋巴細胞，參照文獻[12]用蒜氨酸包被淋巴細胞，PBS沖散沉淀細胞，制備蒜氨酸抗原片備用。滴加待檢免疫兔血清于抗原片，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗。滴加山羊抗兔IgG-FITC熒光抗體，37 ℃孵育1 h，漂洗；晾干，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.2.5 蒜氨酸抗體的應用

1.2.5.1 蒜氨酸的組織分布特點 健康豚鼠1只，于心腔內注射蒜氨酸溶液1 mL；10 min后處死豚鼠，分離心、肝、脾、肺和腎，制備石蠟切片。切片經EDTA抗原修復，淬滅自發(fā)熒光，滴加用PBS按1∶10稀釋的蒜氨酸抗血清于樣本上，4 ℃濕盒孵育過夜；滴加山羊抗兔IgG-Cy3熒光抗體進行50 min間接熒光染色，后用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5.2 蒜氨酸抗菌作用及機制的探討 取蒜氨酸免疫兔血清50 mL，參照文獻[12-14]分離純化蒜氨酸抗體，用FITC標記抗蒜氨酸IgG抗體，制備蒜氨酸熒光抗體。

96孔板的第1孔加入蒜氨酸溶液100 μL，從第2孔開始對蒜氨酸倍比稀釋至第10孔，稀釋2排，第11孔蒜氨酸，第12孔為空白對照。參照文獻[15]檢測蒜氨酸對大腸埃希菌和葡萄球菌的殺菌作用，將細菌培養(yǎng)板經37 ℃培養(yǎng)24 h，取第1～10孔培養(yǎng)液，劃線接種于平板培養(yǎng)基，觀察細菌生長情況。培養(yǎng)72 h后檢測光密度[D(450 nm)]值。收集第1至10孔培養(yǎng)液，單獨收集第11孔培養(yǎng)液作為陰性對照，175×g離心5 min。取上清液加入多聚甲醛，固定上清液中細菌10 min。離心細菌沉淀，PBS漂洗3次，制備細菌涂片，干燥，丙酮固定。滴加FITC標記的家兔抗蒜氨酸抗體于細菌涂片表面，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗，晾干，熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 蒜氨酸抗體的檢測玻片間接血凝試驗顯示，第1組免疫家兔樣本中均可見明顯紅細胞凝集，第2組均未見紅細胞凝集；試管間接血凝試驗顯示，第1組8只家兔血清抗體效價為1∶64，2只效價為1：32；第2組無效價結果。詳見表2。

表2 紅細胞凝集試驗結果

2.2 蒜氨酸抗體的鑒定第1組可見淋巴細胞表面呈綠色熒光，第2組未見熒光染色細胞。詳見圖1。

注：A. 淋巴細胞表面蒜氨酸熒光染色情況(×100)；B. 心肌組織中蒜氨酸熒光染色分布情況(×40)；C. 肝臟組織中蒜氨酸熒光染色分布情況(×40)；D. 脾臟組織中蒜氨酸熒光染色分布情況(×40)；E. 肺組織中蒜氨酸熒光染色分布情況(×40)；F. 腎臟組織中蒜氨酸熒光染色分布情況(×40)。圖1 熒光染色示蹤蒜氨酸在組織細胞中分布情況

2.3 蒜氨酸抗體的應用

2.3.1 組織切片的免疫熒光結果觀察 DAPI染出的細胞核發(fā)射藍光，山羊抗兔IgG-Cy3抗體發(fā)射紅光，表示有蒜氨酸抗體結合于該處細胞膜，具體如下。

心肌細胞：藍色心肌細胞核、細胞膜上明顯可見少量散在紅色點狀物。肝細胞：藍色細胞核周圍有豐富的紅色熒光染色細胞膜，出現紅藍相間發(fā)光現象。脾臟細胞：明顯可見較多的細胞膜表面呈現紅色光斑。肺泡細胞：藍色細胞核外有較多的紅色光斑，可見肺泡組織結構特點。腎細胞：紅色細胞膜包繞著藍色細胞核，排列形成扁圓形的腎小管狀，部分細胞紅光強度超過藍光。詳見圖1。

2.3.2 蒜氨酸的體外抗菌實驗 為檢測蒜氨酸的體外抑菌作用，24 h后培養(yǎng)板第1～10孔劃線平板均有細菌生長，說明蒜氨酸無殺菌作用。72 h時第1～10孔D(450 nm)值均顯著低于陽性對照孔。詳見表3。收集培養(yǎng)液并制片，經抗蒜氨酸-FITC抗體染色，可見呈綠色熒光的菌體，對照孔細菌無綠色熒光。革蘭陰性菌菌體表面熒光強度也弱于革蘭陽性菌。詳見圖2。

表3 蒜氨酸抑菌試驗結果

注：A. 大腸埃希菌菌體熒光染色情況；B. 葡萄球菌菌體熒光染色情況。圖2 熒光染色示蹤標記蒜氨酸于不同菌體表面分布情況(×100)

3 討論

蒜氨酸與卵清蛋白結合，為可逆性結合，當溶液中游離蒜氨酸濃度降低，結合的蒜氨酸就會游離，成為游離蒜氨酸，沉淀溶解。有研究表明，游離蒜氨酸不具免疫原性，與動物機體自身成分結合只是一種體內運輸形式[16]；蒜氨酸與動物異種蛋白可逆性結合，能否使蒜氨酸顯示免疫原性，有待研究證實。甲醛固定結合物，蛋白質分子結構發(fā)生了不可逆轉的改變，蒜氨酸被固定于蛋白分子，其免疫原性能否有效顯現則未見研究報道。文章即采用這兩種類型抗原免疫家兔，探討其免疫原性。結果表明，蒜氨酸偶聯抗原具有免疫原性，而蒜氨酸固定抗原不具免疫原性。

蒜氨酸與蛋白結合會出現沉淀，影響免疫沉淀試驗檢測結果，因此本研究采用間接血凝試驗檢測蒜氨酸抗體及其效價。蒜氨酸與蛋白質結合發(fā)生沉淀，并非蛋白質分子聚集形成的沉淀[17-18]，而是分子空間結構改變引起的沉淀。肉眼與顯微鏡下均未見異常的紅細胞凝集現象，提示試驗結果具有抗原抗體反應的高度特異性。

本研究中，于豚鼠心腔注射蒜氨酸溶液，參照文獻[6]，10 min后處死豚鼠。這一處理既給予蒜氨酸在體內分布至全身組織的充分時間，又不讓蒜氨酸在體內過多分解。而樣本及時用甲醛固定則防止蒜氨酸游離，能真實反映蒜氨酸在體內的分布特點。在肝臟中，肝細胞表面激發(fā)了較多、較強的紅色熒光，表明肝細胞具有富集蒜氨酸的能力，以供代謝需要；腎臟組織切片熒光染色顯示蒜氨酸能通過腎小球濾過作用，經腎小管被大量重吸收，與文獻報道[6]相符；肺泡組織中，細胞表面顯示豐富的紅色光斑，是含蒜氨酸血液在肺部進行氣體交換所致；脾臟為特殊的免疫器官，有大量的血液成分分布，表明蒜氨酸在血液細胞的分布顯著高于一般組織細胞；心臟雖然血流豐富，但血液限于血管及心腔內，因此心肌細胞的蒜氨酸分布可代表蒜氨酸在一般組織細胞的分布特點。

微量稀釋法結果顯示蒜氨酸有較好的抑菌作用，無殺菌作用。蒜氨酸與蛋白質結合影響結果觀察，培養(yǎng)72 h后抑菌孔D值顯著低于陰性對照孔，說明細菌在進行緩慢代謝，分解蒜氨酸，同時沉淀逐漸減少。免疫熒光染色檢測菌體表面蒜氨酸結合情況，結果顯示2種細菌抑菌孔中的菌體均有較好的激發(fā)熒光，提示抑菌孔中的菌體表面結合有大量蒜氨酸，導致菌體蛋白空間結構改變，阻斷細菌細胞壁、細胞膜與環(huán)境間的物質交換；同時，蒜氨酸也與細菌酶蛋白結合，抑制酶活性，從而抑制其生命活動，發(fā)揮較強的抑菌作用。當細菌離開高濃度蒜氨酸環(huán)境后，結合蒜氨酸從菌體和酶蛋白上游離，細菌細胞壁與細胞膜正常生理活動恢復，酶蛋白活性恢復，細菌恢復正常生長繁殖。革蘭陰性桿菌細胞壁薄，革蘭陽性球菌細胞壁厚而致密，鏡下也可見革蘭陰性菌表面熒光強度較陽性菌弱，可能導致蒜氨酸對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌最低抑菌濃度具有顯著差異，有待進一步研究證實。

綜上所述，蒜氨酸為半抗原物質，正確選擇好載體、偶聯方法，能夠提高其免疫原性。通過合理的免疫程序免疫動物，即可獲得高效的蒜氨酸抗體，可應用于體內外蒜氨酸的基礎與臨床研究。