甄 娟，劉玉東，吳 莎，宋春紅，畢學(xué)杰

目前子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)防和治療方案已較為完善，然而近年來子宮頸癌發(fā)病趨勢(shì)逐漸年輕化，且仍有50%以上病例發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，患者出現(xiàn)全身衰竭癥狀，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量和生存率，因此早期篩查和早期發(fā)現(xiàn)危險(xiǎn)因素對(duì)于改善晚期子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后至關(guān)重要[1-3]。已有大量研究及臨床實(shí)驗(yàn)從基因、分子等方面入手，以改善患者生活質(zhì)量及延長患者生存期為治療目標(biāo)，尋找更有前途的治療途徑。研究發(fā)現(xiàn)，E3泛素連接酶SIAH2在有增殖能力的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，在不增殖的細(xì)胞中表達(dá)缺失，SIAH2作為一種重要的腫瘤因子，在惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[4]。然而，SIAH2在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討SIAH2在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌癌變過程中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，并分析SIAH2與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012年12月～2019年12月間石家莊市第四醫(yī)院婦科陰道鏡活檢和手術(shù)切除的子宮頸組織標(biāo)本220例，其中癌旁正常子宮頸組織40例，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變60例，子宮頸鱗狀細(xì)胞癌120例，所有患者術(shù)前均未接受放、化療及其他治療。標(biāo)本均經(jīng)石蠟包埋及HE染色，分別由兩名病理醫(yī)師根據(jù)WHO(2014)子宮頸腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)和FIGO(2018)分期系統(tǒng)確定腫瘤的組織學(xué)分級(jí)以及病理分期。術(shù)中同時(shí)留取36對(duì)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌及癌旁子宮頸組織(經(jīng)形態(tài)學(xué)證實(shí)為正常子宮頸組織，無病變殘留)，組織離體后取少量立即放入液氮后移入-80 ℃冰箱保存，以備RT-qPCR和Western blot檢測(cè)。所有標(biāo)本的使用均通過了本院倫理委員會(huì)審核，患者均知情同意。

1.2 主要試劑SP試劑盒(KIT9710)、DAB顯色試劑、PBS緩沖液均購自福州邁新公司，F(xiàn)astQuant RT Kit試劑盒購自天根生化科技公司，GO Taq qPCR Master Mix試劑盒購自Promega公司，PCR引物合成委托生工生物工程(上海)公司進(jìn)行。鼠抗人SIAH2抗體(sc81787)購自美國Santa Cruz公司，β-actin抗體購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 采用免疫組化SP法染色。所有組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯、水化，高溫高壓抗原修復(fù)，按SP試劑盒說明書進(jìn)行染色，SIAH2(抗體濃度1 ∶200)，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性片作為陽性對(duì)照。結(jié)果判定：染色結(jié)果由兩名有經(jīng)驗(yàn)的中級(jí)以上病理科醫(yī)師閱片審核，SIAH2蛋白在細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片在腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)域選取5個(gè)高倍視野(400×)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)瘤細(xì)胞。按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：無陽性細(xì)胞計(jì)0分，陽性細(xì)胞≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～80%計(jì)3分，>80%計(jì)4分。按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無陽性著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，黃褐色計(jì)3分。將上述兩項(xiàng)計(jì)分相乘：<3分為陰性，≥3分為陽性[5]。

1.3.2RT-qPCR 采用RT-qPCR法，用Trizol試劑提取36對(duì)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常子宮頸組織總RNA，利用FastQuant RT Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，在ABI 7500上利用GO Taq qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR分析。SIAH2上游引物：5′-AGCATCAGGAACCTGGCTAT-3′；下游引物：5′-CTGGTTTCTCCGTATGGTGC-3′。內(nèi)參18S上游引物：5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3′；下游引物：5′-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3′。

1.3.3Western blot法 采用Western blot法，收集36對(duì)新鮮子宮頸組織，加入裂解液，粉碎勻漿后，低溫高速離心(4 ℃，12 000 r/min，40 min)，提取上清液為總蛋白，Bradford法測(cè)定細(xì)胞提取物的蛋白濃度。聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳、恒壓轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉封閉，抗SIAH2(1 ∶150)、抗β-actin(1 ∶200)4 ℃孵育過夜，與相應(yīng)二抗室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光。Image J軟件用于半定量分析特異性條帶的光密度值，將目的蛋白與β-actin光密度值比值作為相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4 隨訪所有子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后進(jìn)行定期隨訪，隨訪截至2020年11月31日。采用患者門診復(fù)查及電話隨訪等方式，每6個(gè)月隨訪1次，開始時(shí)間為患者接受手術(shù)時(shí)間，死亡患者以死亡時(shí)間為終止時(shí)間，刪失者亦納入分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)。SIAH2與HPV16感染、Ki-67蛋白的表達(dá)的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。定量資料采用t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)比較組間總生存率(overall survival, OS)的差異。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型篩選子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸組織中SIAH2的表達(dá)SIAH2陽性定位于細(xì)胞核(圖1)，其在癌旁正常子宮頸組織、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變及子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性率分別為5.00%(2/40)、48.33%(29/60)和75.83%(91/120)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=50.451，P<0.001)。子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中，SIAH2表達(dá)與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HPV16感染、Ki-67表達(dá)密切相關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡及組織學(xué)分級(jí)無關(guān)(P均>0.05，表1)。Spearman相關(guān)性分析顯示，SIAH2表達(dá)與HPV16感染(r=0.340，P<0.001)和Ki-67表達(dá)(r=0.496，P<0.001)呈正相關(guān)。

表1 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中SIAH2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 SIAH2在子宮頸組織中的表達(dá)，SP法：A.癌旁正常子宮頸組織；B.高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變組織；C.子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織

2.2 子宮頸組織中SIAH2的相對(duì)表達(dá)量RT-qPCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，在36對(duì)癌旁子宮頸組織及子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，SIAH2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為29.28±0.68和30.76±0.83，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.220，P<0.001，圖2A)；SIAH2蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.21±0.04和0.79±0.07，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-43.096，P<0.001，圖2B)。

2.3 SIAH2表達(dá)與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者OS的關(guān)系生存分析顯示，SIAH2陽性和陰性患者的5年平均生存時(shí)間分別為42和56個(gè)月，5年中位生存時(shí)間分別為45和60個(gè)月。SIAH2陽性患者的生存時(shí)間顯著低于陰性患者(Log-rankWardχ2=12.905，P<0.001，表2，圖3)。單因素生存分析結(jié)果表明，SIAH2表達(dá)、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的OS相關(guān)(表2，圖3)。Cox多因素分析表明，SIAH2高表達(dá)是子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P<0.05，表3)。

圖3 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌臨床病理因素與患者OS的關(guān)系：A.SIAH2表達(dá)；B.FIGO分期；C.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

表2 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者OS的單因素分析

表3 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者OS的多因素分析

圖2 癌旁正常子宮頸和子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中SIAH2 mRNA和蛋白的表達(dá)：A.RT-qPCR法檢測(cè)SIAH2 mRNA表達(dá)，***P<0.001；B.Western blot法檢測(cè)SIAH2蛋白表達(dá)；C1、C2.子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織；N1、N2.癌旁正常子宮頸組織

3 討論

子宮頸癌是全球婦女第四常見的惡性腫瘤[6]。2018年全球子宮頸癌新增約57萬例，死亡約31.1萬例。子宮頸癌也是我國婦女較常見及預(yù)后較差的腫瘤之一。子宮頸癌可分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和小細(xì)胞癌等，其中鱗狀細(xì)胞癌占80%。眾多高危因素，如持續(xù)HPV感染、長期口服避孕藥、營養(yǎng)不良、吸煙、早期性行為和多名性伴侶等，均與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。手術(shù)治療是早期子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的首選治療方法，而晚期患者通常同時(shí)接受化、放療，且預(yù)后較差[7]。因此，從分子水平尋找控制子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的靶向治療越來越受到臨床重視，與子宮頸癌患者預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)也將逐步被發(fā)現(xiàn)，這將有助于臨床醫(yī)師對(duì)患者治療方案的調(diào)整，提高患者生存率。

SIAH2基因定位于3Q25號(hào)染色體，其編碼的蛋白SIAH2是高度保守的E3泛素連接酶，經(jīng)由RING FINGER區(qū)域參與一些底物蛋白的泛素化和水解作用，從而影響細(xì)胞的功能，如低氧反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞生存、線粒體生物合成、細(xì)胞增殖、脂肪生成和神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)等[8-14]。近來研究發(fā)現(xiàn)，SIAH2作為癌基因在惡性腫瘤中發(fā)揮生物學(xué)作用，SIAH2在肺癌[15]、乳腺癌[16]、喉鱗狀細(xì)胞癌[17]和前列腺癌[18-19]等組織中均高表達(dá)。并且，隨著肺癌[15]及卵巢上皮性癌[4]惡性程度及臨床病理分期的增高，SIAH2表達(dá)水平也逐漸增高。在乳腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)SLAH2，能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力；而干擾SIAH2表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的增殖侵襲能力下降[16]。本組免疫組化結(jié)果顯示，SIAH2在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中彌漫陽性，而僅在正常子宮頸組織有增殖活性的細(xì)胞中表達(dá)，并且其表達(dá)模式與Ki-67表達(dá)模式相同，說明SIAH2在有增殖能力的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]，從正常子宮頸組織→高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變→子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，SIAH2的陽性率逐漸升高。RT-qPCR和Western blot結(jié)果也顯示，從正常子宮頸組織→子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，SIAH2 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著升高，提示SIAH2在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌癌變過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。眾所周知，高危HPV感染與子宮頸癌的發(fā)生相關(guān)，HPV16常見于鱗狀細(xì)胞癌，HPV18更常見于腺癌，本組統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，SIAH2表達(dá)與HPV16感染呈密切正相關(guān)，可借此推測(cè)SIAH2在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生過程中發(fā)揮作用。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析還顯示，隨著FIGO分期增高SIAH2陽性率顯著增加，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67表達(dá)呈密切正相關(guān)，推測(cè)SIAH2與子宮頸鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，并且可能與患者預(yù)后有關(guān)。

Huang等[20]發(fā)現(xiàn)在低氧條件下，白血病細(xì)胞株均有較低的PHD3、較高的HIF-1α和VEGF表達(dá)。SIAH2的抑制劑維生素K3能夠逆轉(zhuǎn)上述變化，并且促進(jìn)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對(duì)伊馬替尼化療藥物的敏感性，從而克服慢性粒細(xì)胞白血病的耐藥性。這些發(fā)現(xiàn)可為臨床應(yīng)用SIAH2抑制劑治療慢性粒細(xì)胞白血病提供依據(jù)。由此可見，SIAH2可在腫瘤治療中發(fā)揮一定的作用。本組前期實(shí)驗(yàn)在卵巢上皮性癌中發(fā)現(xiàn)，SIAH2高表達(dá)患者的5年生存率明顯降低，無瘤生存期顯著縮短，SIAH2是卵巢上皮性癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，提示患者預(yù)后不良[4]。那么，SIAH2在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后評(píng)估中是否也起到一定作用呢？本實(shí)驗(yàn)將常見的臨床病理因素納入單因素分析發(fā)現(xiàn)，SIAH2、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者的OS有關(guān)，與SIAH2陰性患者相比，SIAH2陽性者的OS下降，生存時(shí)間縮短，SIAH2陽性提示患者預(yù)后不良；多因素分析發(fā)現(xiàn)SIAH2是子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SIAH2可能在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。SIAH2具有成為子宮頸鱗狀細(xì)胞癌診斷、治療靶點(diǎn)的可能，可以幫助臨床評(píng)估患者的預(yù)后，然而本實(shí)驗(yàn)只是初步驗(yàn)證，其具體機(jī)制有待深入探究。