河南和廣西地區(qū)紫云英匍柄霉葉斑病的病原菌鑒定

錢寧 吳雨紅 馮彩蓮 張國珍 盧訓莉 趙文生

摘要 2019年-2020年，在我國河南省信陽市和廣西壯族自治區(qū)南寧市種植紫云英的田間發(fā)現(xiàn)一種紫云英葉斑病。通過常規(guī)組織分離法分離得到7株真菌（菌株號為XZYB1～XZYB6、GX1），經(jīng)單孢純化、形態(tài)學觀察和多基因系統(tǒng)發(fā)育學分析（ITS-GAPDH-CAL），結(jié)果顯示7株真菌均為黃芪匍柄霉Stemphylium astragali。依據(jù)柯赫氏法則，選取菌株XZYB1和XZYB4無傷接種紫云英離體葉片，選取菌株GX1活體接種紫云英葉片進行致病性測定。接種5 d后離體葉片和活體植株葉片均發(fā)病，發(fā)病癥狀與田間癥狀一致，且再分離得到的菌株與接種菌株相同。據(jù)此，確定黃芪匍柄霉為該葉斑病的病原菌，并將病害定名為紫云英匍柄霉葉斑病。這是該病害在河南和廣西發(fā)生的首次報道。本研究也為匍柄霉葉斑病的診斷與后續(xù)的防治策略提供了科學依據(jù)和理論指導。

關(guān)鍵詞 形態(tài)學; 系統(tǒng)發(fā)育學; 致病性測定; 黃芪匍柄霉; 紫云英

中圖分類號： S 435. 5

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2021048

Identification of the pathogen caused a leaf spot disease in Astragalus sinicus in Henan province and Guangxi Zhuang autonomous region

QIAN Ning， WU Yuhong， FENG Cailian， ZHANG Guozhen， LU Xunli， ZHAO Wensheng*

（Key Laboratory of Pest Monitoring and Green Management， Ministry of Agriculture and Rural Affairs; College of

Plant Protection， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract

A leaf spot disease was found in the milk vetch fields of Henan province and Guangxi Zhuang autonomous region （GZAR） in 2019-2020. Seven strains （XZYB1-XZYB6 and GX1） were isolated using the conventional tissue isolation method. After single spore purification， morphological observation and multi-gene phylogenetic analysis （ITS-GAPDH-CAL）， these strains were all identified as Stemphylium astragali. According to Kochs postulate， strain XZYB1 and XZYB4 were selected for noninvasive inoculation to milk vetch leaves and strain GX1 for noninvasive inoculation to milk vetch living plants for pathogenicity test. Disease can be developed in both the detached leaves and the in vivo leaves， and the symptoms on the inoculated leaves were consistent with those in the field. The re-isolated strains were still identified as S.astragali. Therefore S.astragali was determined as the pathogen of the milk vetch leaf spot disease， which was called as milk vetch Stemphylium leaf spot. This is the first report of the disease in Henan province and GZAR， which also provides a scientific basis and theoretical guidance for the diagnosis of Stemphylium leaf spot of other crops and follow-up control strategies of the leaf spot disease.

Key words

morphological; phylogenetic tree; pathogenicity test; Stemphylium astragali; Astragalus sinicus

紫云英Astragalus sinicus L.又名紅花草，是豆科黃芪屬二年生草本植物。它常作為重要的蜜源植物和綠肥作物而被廣泛栽培。作為綠肥作物，紫云英常與稻田輪作，在水稻種植前將上一季的紫云英翻壓入土以提高土壤肥力，并且它還能改善土壤理化性質(zhì)，最終提高作物產(chǎn)量[1]。在中國，一千多年前吳陸璣的《毛詩草木鳥獸蟲》中就記載了紫云英已經(jīng)被人們使用[2];明清時代，長江流域的紫云英已經(jīng)種植廣泛;民國時期，我國南部地區(qū)、中原地區(qū)均有紫云英種植，分布十余省[3]。

紫云英主要在中日韓等亞洲國家種植較為普遍，因此，目前關(guān)于紫云英的真菌病害記錄也多集中于這些地區(qū)，記錄較多的為白粉病和菌核病。中國和日本均有黃芪白粉菌Erysiphe astragali侵染引起的紫云英白粉病的記錄[4-6]。中國、日本和韓國均有豌豆白粉菌E.pisi侵染引起的紫云英白粉病的記錄[4，7-8]。據(jù)戴芳瀾《中國真菌總匯》記載，蓼白粉菌Erysiphe polygoni也可以侵染紫云英葉片引起紫云英白粉病，而核盤菌Sclerotinia sclerotiorum和杯狀核盤菌S.ciborioides可侵染紫云英引起菌核病[5]。日本報道了由三葉草核盤菌S.trifoliorum侵染引起的紫云英菌核病[9]。據(jù)《中國真菌志》第26卷記載，灰葡萄孢Botrytis cinerea可以侵染紫云英引起灰霉病[10]。此外，據(jù)美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局數(shù)據(jù)中心記錄顯示，早在1952年日本就報道了由苜蓿霜霉Peronospora aestivalis侵染引起的紫云英霜霉病;在1955年日本報道了由黃芪枝孢Cladosporium astragali侵染引起的紫云英葉枯病。據(jù)《中國真菌志》第14卷記載，變黑枝孢菌C.nigrellum可以侵染紫云英葉片引起葉斑病[11]。在我國大陸和臺灣地區(qū)有記載黃芪尾孢菌Cercospora astragali可以侵染引起紫云英褐斑病[5，12]。中國和日本曾報道了Neoovularia nomuriana 可以侵染紫云英葉片引起紫云英白斑病[13-15]。日本、韓國及我國浙江省曾有記錄黃芪匍柄霉Stemphylium astragali可以侵染紫云英葉片引起紫云英葉斑病[16-18]，但缺乏詳細的病害癥狀、病原菌形態(tài)及分子生物學證據(jù)。

為加速現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展，我國正大力恢復和發(fā)展綠肥生產(chǎn)，紫云英的種植面積和產(chǎn)量也在逐步增大，因此控制紫云英病害的發(fā)生和危害極為重要。本研究在紫云英的主產(chǎn)區(qū)河南和廣西進行田間調(diào)查時，發(fā)現(xiàn)了一種紫云英葉斑病。為明確其病原菌種類，我們進行了病原菌的分離、鑒定及致病性測定。

1 材料與方法

1.1 田間癥狀的觀察與樣品的采集

2019年4月上旬和2020年3月中旬分別在河南省信陽市和廣西壯族自治區(qū)南寧市紫云英種植田發(fā)現(xiàn)一種癥狀相似的紫云英葉斑病。對其發(fā)病癥狀、發(fā)病部位進行拍照記錄，并采集病樣帶回實驗室。

1.2 病原菌的分離、純化及保存

采用常規(guī)組織分離法對病樣進行病原菌的分離，待菌株產(chǎn)孢后，挑取單孢純化。純化得到的菌株分別用斜面（PDA）法和濾紙片法各保存一份，斜面于4℃冰箱保存，帶菌濾紙片放入滅菌的羊皮紙袋中，置于超凈工作臺吹干后-20℃冰箱保存。

1.3 形態(tài)學鑒定

將菌株在PDA平板上活化5 d后，用滅菌的打孔器在菌落邊緣打取菌餅（d=5 mm）備用。

菌落形態(tài)特征觀察：將菌餅接種于PCA平板（d=60 mm）中央，置于25℃恒溫溫箱持續(xù)光照培養(yǎng)，觀察生長狀況并測量菌落直徑計算生長速率。

產(chǎn)孢表型觀察：參考《中國真菌志》第30卷[19]的方法誘導產(chǎn)孢，7～10 d后，取載玻片置顯微鏡下觀察，并拍照記錄分生孢子在分生孢子梗上的著生情況（產(chǎn)孢表型）和產(chǎn)孢梗（細胞）延伸的方式。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水1 000 mL;馬鈴薯胡蘿卜瓊脂（PCA）培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、胡蘿卜200 g、瓊脂 20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.4 分子生物學鑒定

將菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，收集菌絲，使用QS法[20]快速提取DNA。用引物（表1）分別擴增ITS、GAPDH和CAL基因。擴增體系（50 μL）： 2×PCR-MIX溶液（聚合美生產(chǎn)，速率為1 kb/10～15 s）25 μL，無菌去離子水20 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板DNA 1 μL。將PCR擴增產(chǎn)物送至鉑尚生物公司測序，測序結(jié)果使用Chromas軟件進行檢查校對，最終將所得的所有序列上傳NCBI序列數(shù)據(jù)庫獲得登錄號（表2）。依據(jù)Woudenberg 等[21]的報道下載相關(guān)參考序列，參考序列登錄號及相關(guān)菌株信息見表2。使用MAFFT v.7.221、Bioedit和ALTER（http：∥www.sing-group.org/ALTER/）分別進行序列比對、修剪拼接和格式轉(zhuǎn)換，使用Cipres網(wǎng)頁上（https：∥www.phylo.org/）的XSEDE工具進行ML法（最大似然法）的系統(tǒng)發(fā)育學分析;使用PAUP軟件（4.0b10版本）進行MP法（最大簡約法）的系統(tǒng)發(fā)育學分析。選擇Alternaria alternata作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外群。

1.5 致病性測定

依據(jù)柯赫氏法則，選取紫云英健康植株，分別采用離體葉片接種法和活體植株接種法進行致病性測定。將保藏的分離物移到PDA平板上置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，用滅菌的打孔器在菌落的邊緣打取多個菌餅（d=5 mm）備用。溫室內(nèi)種植紫云英，離體接種選取健康的帶葉莖段，并使用棉簽蘸取75%乙醇對葉片進行表面消毒處理。采用無傷接種法，將菌餅接于葉片上，重復3次，以無菌PDA塊作對照，接種后用濕棉花包裹莖段，放在鋪有濕潤濾紙的保鮮盒中保濕，在培養(yǎng)箱中25℃恒溫避光培養(yǎng)，定期觀察并記錄葉片發(fā)病情況?；铙w接種選取健康的紫云英植株，用棉簽蘸取75%乙醇對紫云英活體植株葉片進行表面消毒處理。采用無傷接種法，每株紫云英隨機接15個菌餅，重復3次，以無菌PDA塊作對照，將接種的盆栽紫云英放在大的塑料收納箱中，用加濕器加濕，塑料收納箱用保鮮膜密封后放在恒溫溫室（25±1℃）培養(yǎng)，定期觀察并記錄植株發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫云英葉斑病田間癥狀

在河南信陽市紫云英田間和廣西南寧市田間所發(fā)現(xiàn)的葉斑病，病斑淡褐色至褐色，形狀不規(guī)則，邊緣帶有黃色暈圈，有的具輪紋，濕度高時病斑中央產(chǎn)生灰褐色霉層。單個小葉片上可出現(xiàn)多個病斑，發(fā)病后期多個病斑可連成片，造成整個葉片干枯死亡（圖1）。該病害在紫云英生長中后期普遍發(fā)生，田間植株發(fā)病率高達60%～100%。

2.2 形態(tài)學觀察

從河南省紫云英葉斑病病樣上共分離得到6株菌，編號為XZYB1～XZYB6;從廣西壯族自治區(qū)紫云英葉斑病病樣上分離得到1株菌，編號為GX1。純化時發(fā)現(xiàn)這7株菌形態(tài)學特征基本一致。代表性菌株XZYB4在PCA平板上（25℃下全光照）菌落初期為白色，隨著生長，菌落正面逐漸變?yōu)榛野咨浔趁嬷饾u變?yōu)榛液谏?，培養(yǎng)5 d后菌落直徑可達50 mm。

分生孢子梗直立，單生，不分支，淡褐色，分為短梗和長梗兩種。短梗無隔，長度（6.2～）6.3～12.1（～14.9）μm;長梗2～5個橫隔，長度（21.2～）26.8～41.3（～44.1）μm，分生孢子梗寬度（4.4～）4.9～6.7（～7.3）μm。分生孢子梗末端形成膨大且顏色加深的產(chǎn)孢細胞，分生孢子著生于產(chǎn)孢細胞上，褐色，卵形或橢圓形，表面具疣狀突起，具橫隔、縱隔或斜縱隔（橫隔1～4個，縱隔或斜縱隔1～5個），分隔處明顯縊縮，大小為（10.5～）14.4～23.4（～29.5）μm ×（9.3～）11.9～17.4（～18.5）μm，隨著孢子成熟顏色加深（圖2）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育學分析

首先將所獲得的ITS序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對分析，初步確定它們?yōu)橘楸箤賁temphylium真菌。進一步，聯(lián)合ITS-GAPDH-CAL三個基因片段（其中ITS：1-540;GAPDH：545-1 113;CAL：1 118-1 832，不同基因片段之間插入了4個N）使用最大似然法和最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)發(fā)育學分析，MP、ML兩種建樹方法獲得相似的拓撲結(jié)構(gòu)，ML的拓撲結(jié)構(gòu)表示的系統(tǒng)學關(guān)系見圖3，結(jié)果顯示菌株XZYB1～XZYB6、GX1與黃芪匍柄霉S.astragali的衍生注釋模式菌株（CBS 116383）聚在一個進化支，其自舉值均為100，此外這8個菌株的DNA堿基序列完全相同或幾乎完全相同。

2.4 致病性測定

菌株XZYB1和XZYB4離體葉片接種60 h后可見菌餅萌發(fā)的菌絲侵染葉片。取下菌餅，繼續(xù)觀察發(fā)病情況，在接種5 d后接種點出現(xiàn)褐色病斑，病斑周圍失綠呈現(xiàn)黃色暈圈，該癥狀與田間癥狀相似，而空白對照組葉片不發(fā)病。從發(fā)病葉片病健交界處再分離得到的菌株與接種菌株相同。

菌株GX1活體植株接種5 d后，植株均出現(xiàn)發(fā)病癥狀，15個接種點的發(fā)病數(shù)分別為12、8個和12個。發(fā)病葉片出現(xiàn)褐色不規(guī)則病斑，有的呈輪紋狀，病斑邊緣失綠為黃色暈圈。從發(fā)病葉片病健交界處再分離得到的菌株與接種菌株相同。

3 結(jié)論與討論

對我們分離獲得的菌株進行形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定（ITS、GAPDH和CAL多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析），確定XZYB1～XZYB6、GX1等7株菌為黃芪匍柄霉S.astragali。依據(jù)柯赫氏法則，將田間病樣上分離得到的菌株進行回接做致病性測定，獲得與寄主在自然狀態(tài)下非常相似的發(fā)病癥狀，同時將接種發(fā)病部位進行再分離，得到和最初分離菌株一樣的菌株，驗證了黃芪匍柄霉就是該紫云英葉斑病的致病菌。為與其他葉斑類病害相區(qū)別，將該菌引起的病害命名為紫云英匍柄霉葉斑病。

黃芪匍柄霉最早由日本科學家Yoshii于1929年從日本的紫云英上分離得到，最初命名為Thyrospora astragali，在1956年，確定該種衍生注釋模式菌株為CBS 116583。1960年由日本科學家Yamamoto對其重新進行分類并正式歸為匍柄霉屬，更名為Stemphyliun astragali[17，21，25]。1991年，《浙江植物病蟲志：病害篇（第一集）》中首次記錄了我國浙江省發(fā)現(xiàn)由黃芪匍柄霉侵染引起的紫云英葉斑病[16]，但僅有對其病原菌形態(tài)學的文字描述，無形態(tài)附圖和分子證據(jù)。2001年出版的《Korean species of Alternaria and Stemphylium》和2004年出版的《List of plant diseases in Korea》中記錄，在韓國，黃芪匍柄霉可以侵染紫云英葉片引起葉斑病[8，18]。從該病原菌被首次鑒定至2019年，已報道的寄主均為紫云英。 Vaghefi等2020年首次報道在澳大利亞黃芪匍柄霉可以侵染小扁豆Lens culinaris葉片引起葉斑病[26]。至此，黃芪匍柄霉引起病害的寄主僅有紫云英和小扁豆，均屬豆科綠肥作物，分布于中國、日本、澳大利亞和韓國。

本研究首次在我國河南省和廣西壯族自治區(qū)發(fā)現(xiàn)由黃芪匍柄霉引起的紫云英葉斑病，并基于多基因系統(tǒng)發(fā)育學分析和形態(tài)學鑒定相結(jié)合的方法對病原菌進行了鑒定。紫云英匍柄霉葉斑病在中日韓三國均有報道，尤其是國內(nèi)近幾年恢復了綠肥生產(chǎn)，多個省已經(jīng)大面積種植紫云英，該病害很可能在今后流行至河南、廣西、浙江以外的其他省份，這將對我國綠肥產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生不利影響。此外，黃芪匍柄霉在澳大利亞已經(jīng)有對小扁豆的侵染致病記錄，因此該病原菌對我國小扁豆的生產(chǎn)也具有潛在威脅，進一步研究紫云英葉斑病的發(fā)病規(guī)律、防治策略等十分重要。

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（責任編輯：田 喆）