核桃殼固定化微生物降解苯酚研究

劉 羽，王申能，羅瑭秋琦，管 鑫，宗 飛

(延安大學(xué) 石油工程與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 延安 716000)

苯酚及其衍生物存在于各種化工行業(yè)產(chǎn)生的工業(yè)廢水中，作為一類原生質(zhì)毒物，排放到環(huán)境中嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境及人類的健康，因此，如何有效地處理含酚廢水，已成為環(huán)境污染領(lǐng)域重點(diǎn)關(guān)注的問題之一[1-2]。

酚類物質(zhì)的去除可以采用物理、化學(xué)和生物方法。生物處理方法以其處理徹底、無二次污染等優(yōu)勢被廣泛研究和應(yīng)用[3]。微生物固定化技術(shù)是指通過物理或化學(xué)的手段將游離的微生物吸附或包埋限定在一定的空間區(qū)域，保持其生物活性并能反復(fù)利用的方法[4-5]。被固定的細(xì)菌活性高、耐毒害能力強(qiáng)、降解污染物的效率高于游離狀態(tài)下的細(xì)菌，且固定化后可實(shí)現(xiàn)微生物快速高效分離，近年來被廣泛應(yīng)用于含有機(jī)物廢水處理，并取得一定的效果，具有良好的應(yīng)用前景[6-7]。微生物固定化方法有包埋法、交聯(lián)法、吸附法、共價(jià)結(jié)合法等[8]。以吸附法來固定化微生物，相比于包埋法和交聯(lián)法操作更簡單，效果也比較明顯。曹曉李等[9]人利用改性木屑固定化微球菌，研究了pH、溫度和振蕩速率對其降酚性能的影響。結(jié)果表明，木屑固定化細(xì)胞優(yōu)于游離細(xì)胞對環(huán)境的耐受能力和降酚速率。

我國核桃產(chǎn)量巨大，廢棄的核桃殼如能進(jìn)行處理和回收利用，既能實(shí)現(xiàn)廢棄物的資源化，又能利用現(xiàn)有的綠色資源，降低廢水處理成本，增加了廢棄物循環(huán)利用帶來的產(chǎn)業(yè)效益[10]。實(shí)驗(yàn)采用生物質(zhì)核桃殼吸附固定微生物降解苯酚，考察按不同梯度投加固定化微生物對苯酚降解的影響及重復(fù)利用情況，通過研究生物質(zhì)為載體固定苯酚降解菌，以期為解決治理環(huán)境中酚類物質(zhì)的污染問題提供借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)使用的高效苯酚降解菌為實(shí)驗(yàn)室保存的無色桿菌LQ-1(Achromobactersp.)，具有較好的苯酚降解性能。市售核桃殼，通過粉碎后人工篩選得到不同粒徑的固定化材料，如圖1所示。

圖1 不同粒徑核桃殼

蛋白胨、酵母浸粉和瓊脂粉(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)。氯化鈉、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、氯化銨(NH4Cl)、氯化鈣(CaCl2)、苯酚、氨水、鐵氰化鉀、4-氨基安替比林、氫氧化鈉、無水乙醇和鹽酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；LS-30立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊公司)；HR/T20M高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西公司)；BCM-1300A生物潔凈工作臺(tái)(蘇凈公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 核桃殼的預(yù)處理

市售核桃殼用蒸餾水洗凈，在100℃干燥8 h，取出后利用粉碎機(jī)將核桃殼粉碎至10 mm左右的塊狀，核桃殼碎屑棄用，將剩余的核桃殼塊按要求粒徑過篩并存于自封袋內(nèi)備用。

1.3.2 培養(yǎng)基的制備

LB富集培養(yǎng)基：分別稱取5 g蛋白胨、2.5 g酵母浸粉、5 g氯化鈉溶于500 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.0 ± 0.2，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min，冷卻后用于細(xì)菌富集。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：分別稱取Na2HPO44.26 g、KH2PO42.65 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl20.02 g、NH4Cl 0.1 g，1 mL的微量元素[11]投加至1000 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0 ± 0.2，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min，冷卻后用于細(xì)菌培養(yǎng)。

1.3.3 核桃殼載體吸附苯酚實(shí)驗(yàn)

配制所需濃度的苯酚溶液，稱取0.1～0.9 g核桃殼分別投加到苯酚溶液中，搖床溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，5 h內(nèi)取樣測定苯酚濃度。

1.3.4 固定化微生物的制備

1.重新構(gòu)建了會(huì)計(jì)核算模式。政府新會(huì)計(jì)制度構(gòu)建了“財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)和預(yù)算會(huì)計(jì)適度分離并相互銜接”的會(huì)計(jì)核算模式。分離了財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)和預(yù)算會(huì)計(jì)功能、財(cái)務(wù)報(bào)告和決算報(bào)告功能，讓政府會(huì)計(jì)主體的財(cái)務(wù)信息和預(yù)算執(zhí)行信息得到更加全面的反饋。主要體現(xiàn)在“雙功能、雙基礎(chǔ)、雙報(bào)告”上。“雙功能”是指按照政府新會(huì)計(jì)制度改革以后，事業(yè)單位會(huì)計(jì)核算同時(shí)具有權(quán)責(zé)發(fā)生制和收付實(shí)現(xiàn)制的兩大功能；“雙基礎(chǔ)”是指財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)按資產(chǎn)、負(fù)債、凈資產(chǎn)、收入與費(fèi)用五大會(huì)計(jì)要素進(jìn)行核算，而預(yù)算會(huì)計(jì)按預(yù)算收入、預(yù)算支出與預(yù)算結(jié)余三大會(huì)計(jì)要素進(jìn)行核算；“雙報(bào)告”是指財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)編制的財(cái)務(wù)報(bào)告和預(yù)算會(huì)計(jì)編制的決算報(bào)告。

分別稱取一定質(zhì)量預(yù)處理好的核桃殼投加至LB培養(yǎng)基中，滅菌冷卻后，將無色桿菌LQ-1接種到LB培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)30 h左右(搖床溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min)[12]，LB培養(yǎng)基明顯變得渾濁，核桃殼載體上形成吸附固定化生物膜，用鑷子取出，用蒸餾水輕輕沖洗2～3次，去除核桃殼表面的游離細(xì)胞，得到核桃殼固定化微生物。

固定化微生物的細(xì)菌負(fù)載量測定如下：利用超聲波清洗器將負(fù)載到材料上的無色桿菌震蕩至無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，測定OD600進(jìn)行換算，得到菌體的負(fù)載量。

1.3.5 固定化微生物降解苯酚實(shí)驗(yàn)

250 mL的錐形瓶中加入滅菌的無機(jī)鹽溶液100 mL，配制好濃度約為300 mg/L的苯酚溶液。初始的游離菌濃度OD600為0.2～0.3，固定化微生物按固定質(zhì)量投加，苯酚濃度變化實(shí)驗(yàn)，固定化微生物投加量為0.5 g，苯酚濃度范圍為100～800 mg/L，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每間隔2 h取樣測定苯酚濃度。

1.3.6 固定化微生物降解苯酚重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

當(dāng)苯酚溶液吸光度快接近于零時(shí)，取出其中的核桃殼固定化微生物，輕輕沖洗表面的游離細(xì)菌，再放至重新配制好的300 mg/L的苯酚的溶液中，重復(fù)下次實(shí)驗(yàn)，每隔一定時(shí)間取樣測定溶液的OD600和苯酚濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1 苯酚濃度的測定

1.4.2 細(xì)菌質(zhì)量濃度的測定

在600 nm下，采用紫外分光光度計(jì)測量出菌密度數(shù)值的大小OD600，并用稱重法測定對應(yīng)OD600與質(zhì)量濃度的換算關(guān)系，計(jì)算出細(xì)菌的質(zhì)量[14]。細(xì)菌吸光度值OD600與細(xì)菌質(zhì)量濃度的關(guān)系式：

y=0.3108x+0.0033

式中：y為細(xì)菌的質(zhì)量濃度(mg/mL或g/L)；x為細(xì)菌吸光度值即OD600

2 結(jié)果與討論

2.1 游離菌降解苯酚性能

無色桿菌LQ-1降解苯酚的能力如圖2所示，反應(yīng)體系初始OD600為0.246，細(xì)胞濃度為0.080 mg/mL。在0～15 h細(xì)菌降解苯酚速率較緩慢，苯酚濃度從309.92 mg/L降至205.86 mg/L，去除率為33.57%。15 h后細(xì)菌降解苯酚速率增加，20 h 后苯酚濃度降至33.04 mg/L，去除率為89.34%，在28 h時(shí)達(dá)到98%以上。同時(shí)，隨著時(shí)間的增加，開始時(shí)苯酚有抑制作用，菌量降低，9 h后，微生物適應(yīng)了苯酚環(huán)境，利用苯酚作為底物，自身不斷生長增殖，細(xì)菌濃度逐漸增加，在25 h達(dá)到飽和狀態(tài)，細(xì)胞濃度達(dá)到0.192 mg/mL。

圖2 無色桿菌LQ-1降解苯酚曲線

2.2 固定化載體對細(xì)菌的負(fù)載能力研究

取不同粒徑的核桃殼各0.5 g，考察不同粒徑核桃殼對細(xì)菌負(fù)載量的影響，如圖3所示，核桃殼粒徑越小，細(xì)菌負(fù)載的效果越好，0.5 g核桃殼(1～2 mm)的細(xì)菌負(fù)載量為2.173 mg，同樣質(zhì)量下3～5 mm核桃殼的細(xì)菌負(fù)載量為1.632 mg。雖然1～2 mm的核桃殼比表面積最大，效果最好，但由于其粒徑較小，易流失，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇粒徑為3～5 mm的核桃殼作為細(xì)菌吸附載體。

圖3 不同粒徑核桃殼載體對菌的負(fù)載效果

粒徑為3～5 mm的核桃殼投加量對細(xì)菌負(fù)載量的影響如圖4所示，核桃殼投加量為0.1 g時(shí)，細(xì)菌負(fù)載量為0.453 mg，當(dāng)核桃殼投加量增長至0.9 g時(shí)，細(xì)菌負(fù)載量為2.671 mg，增長了近6倍。細(xì)菌負(fù)載量隨核桃殼載體投加量的增加而增加，相關(guān)系數(shù)接近于1，線性關(guān)系良好，負(fù)載能力穩(wěn)定。

圖4 不同投加量核桃殼載體對菌的負(fù)載效果

固定化微生物技術(shù)可降低功能微生物受外界不利因素的影響程度，微生物活性強(qiáng)、密度高。

吸附法主要利用材料孔隙、表面官能團(tuán)、靜電作用力等實(shí)現(xiàn)微生物固定[15]，不同性質(zhì)載體表面差異會(huì)造成胞外聚合物(EPS)等微生物分泌物性質(zhì)上的差異，從而導(dǎo)致附著和負(fù)載情況不同[16]。核桃殼作為植物載體，有天然環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，成本低，直接用來作為微生物固定化載體，不會(huì)帶來二次污染，負(fù)載細(xì)菌能力穩(wěn)定，同時(shí)達(dá)到了以廢治廢的目的[17]。

2.3 核桃殼載體吸附苯酚能力研究

不同投加量核桃殼對苯酚的吸附曲線如圖5A所示，由圖可知，在苯酚濃度為300 mg/L的情況下，隨著核桃殼投加量的增多，苯酚吸附量發(fā)生變化，5 h基本達(dá)到吸附飽和，平衡吸附量隨著核桃殼質(zhì)量的增多而減小，投加0.1、0.5和0.9 g核桃殼時(shí)苯酚的平衡吸附量分別為19.936、8.134、4.563 mg/g，說明投加更高濃度的核桃殼并不能實(shí)際增大其吸附苯酚的能力，按照去除率統(tǒng)計(jì)投加0.7 g核桃殼時(shí)苯酚去除率最大為13.84%。不同苯酚濃度的吸附曲線如圖5B所示，小于100 mg/L的苯酚5 h后的去除率可以達(dá)到85%以上，隨著本底濃度的增高，平衡吸附量相對穩(wěn)定在16 mg/g以下，去除率有所降低，300 mg/L的苯酚溶液，投加0.5 g的核桃殼，平衡吸附量為8.916 mg/g，去除率為13.99%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核桃殼具有一定的吸附能力，但效果一般，天然核桃殼本身空隙結(jié)構(gòu)不規(guī)則，其表面電荷性質(zhì)與苯酚產(chǎn)生吸附的匹配度較低[18]。

圖5 核桃殼投加量(A)及苯酚起始濃度(B)對吸附效果的影響

2.4 固定化微生物苯酚降解性能研究

游離菌及固定化細(xì)菌降解苯酚過程如圖6所示，游離細(xì)菌的投加量控制OD600為0.2～0.3，實(shí)際菌濃度約為0.080 mg/mL，8 h后開始有效降解苯酚，25 h左右降解完全。對于固定化微生物，其降解苯酚能力顯著提高，整體而言，在12 h之前，核桃殼固定化微生物降解苯酚較緩慢，與游離微生物修復(fù)效果差異不大，這是因?yàn)槲⑸镌诔跗谥饕窃诤铣勺陨砦镔|(zhì)，處于生長階段，苯酚濃度的降低主要由吸附所致，12 h后速度明顯提高，0.5 g的固定化細(xì)菌，20 h的去除率即可達(dá)到98.40%，對于0.9 g的固定化細(xì)菌，16 h去除率即可達(dá)到95.47%。在此過程中，核桃殼吸附及微生物降解具有協(xié)同作用，此外，天然核桃殼本身分解產(chǎn)物可能為苯酚降解微生物提供了共代謝底物，促進(jìn)了菌量的增加，強(qiáng)化了苯酚處理效果。

圖6 游離菌與固定化微生物降解苯酚曲線

考察固定化微生物對不同濃度苯酚降解效果，如圖7所示，投加0.5 g的固定化菌，隨著苯酚底物濃度的增大，苯酚降解時(shí)間延長，最終可以耐受700 mg/L的苯酚濃度，36、40 h去除率分別達(dá)到94.63%和97.83%，但當(dāng)苯酚濃度提升到800 mg/L時(shí)，濃度過高可能對固化微生物產(chǎn)生毒害作用，使得生物降解停滯。

圖7 固定化微生物降解苯酚不同濃度苯酚曲線

實(shí)驗(yàn)中對游離細(xì)胞進(jìn)行了降解苯酚濃度適應(yīng)性研究，游離細(xì)胞能耐受的苯酚濃度為500 mg/L，固定化細(xì)菌明顯提高，這是因?yàn)楣潭ɑ?xì)菌與載體的多位點(diǎn)結(jié)合使其內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，降低了苯酚毒性對細(xì)菌分子結(jié)構(gòu)及酶系的影響和破壞[19-20]。王蕾等[21]利用PUF固定化菌株降解苯酚，經(jīng)過120 h 對1 000 mg /L 苯酚的降解率達(dá)到72.96%，雖然其可以耐受更高濃度的苯酚，但反應(yīng)周期過長，降解率也偏低。

2.5 核桃殼固定化微生物的重復(fù)利用性研究

核桃殼固定化微生物的重復(fù)利用性研究如圖8所示，在第1次使用時(shí)，23 h的苯酚降解率達(dá)99.33%。重復(fù)使用6次，苯酚去除率保持99%以上，降解時(shí)間大大降低，去除300 mg/L的苯酚由原來的23 h縮短至14 h，此過程細(xì)菌會(huì)在核桃殼表面形成一層生物膜，對外部的適應(yīng)性逐漸增強(qiáng)，初始的負(fù)載菌量也隨之增加，降解苯酚效率提高。重復(fù)使用7次后苯酚的去除率開始逐漸降低，菌量也隨之降低，其主要原因是多次的重復(fù)使用導(dǎo)致核桃殼表面的附著菌體能力降低，傳質(zhì)阻力提高，生物膜脫落，菌體流失及老化[22]。

圖8 核桃殼固定化微生物的重復(fù)利用

3 結(jié)論

(1)無色桿菌LQ-1降解苯酚，反應(yīng)體系初始細(xì)胞濃度為0.080 mg/mL ，28 h去除率達(dá)到98%以上，細(xì)胞濃度增長至0.192 mg/mL。

(2)粒徑為3～5 mm的核桃殼作為細(xì)菌吸附載體性能穩(wěn)定，0.5 g核桃殼的細(xì)菌負(fù)載量為1.632 mg；核桃殼具有一定的苯酚吸附能力，但效果一般，300 mg/L的苯酚溶液，投加0.5 g的核桃殼，平衡吸附量為8.916 mg/g，去除率為13.99%。

(3)固定化微生物降解苯酚能力顯著提高，投加0.5 g的固定化細(xì)胞，20 h的去除率即可達(dá)到98.40%，核桃殼吸附及微生物降解協(xié)同作用強(qiáng)化了苯酚處理效果。

(4)固定化細(xì)菌可耐受700 mg/L的苯酚濃度，優(yōu)于游離細(xì)菌，40 h去除率達(dá)到97.83%。核桃殼固定化微生物重復(fù)使用6次，苯酚去除率保持99%以上，去除300 mg/L的苯酚由原來的23 h縮短至14 h。