PD-1/PD-L1 的糖基化修飾對(duì)腫瘤免疫治療影響的研究進(jìn)展

李 胤（綜述） 陳一葦 陳芳華 張 舒 盧春來△（審校）

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所 上海 200032）

程序性細(xì)胞死亡分子1（programmed cell death-1，PD-1）/程序性細(xì)胞死亡分子配體 1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）信號(hào)通路所介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要機(jī)制之一。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞可表達(dá)PD-L1，通過與PD-1相互作用進(jìn)而影響效應(yīng)T 細(xì)胞的抗腫瘤活性。抑制或阻斷PD-1/PD-L1 通路可顯著增強(qiáng)T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫殺傷活性，進(jìn)而提高抗腫瘤效應(yīng)。目前包括Nivolumab、 Pembrolizumab、 Atezolizumab 和Avelumab 在內(nèi)的針對(duì)PD-1/PD-L1 的抑制性抗體已展現(xiàn)出顯著的臨床效益［1-2］，但總體緩解率仍然較低［3-4］。PD-1/PD-L1 介導(dǎo)的免疫抑制與其本身蛋白質(zhì)表達(dá)水平及蛋白質(zhì)翻譯后修飾密切相關(guān)。許多重要的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外因子，如干擾素γ（intrferon γ，IFN-γ）、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子 β（tranforming growth factor β，TGF-β）、miR-33a 和 miR-200，可通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響PD-1/PD-L1 的表達(dá)［5-7］。此外，PD-1/PD-L1 存在多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其糖基化修飾顯著影響免疫治療的療效［8-9］。

糖基化修飾是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，通過糖基轉(zhuǎn)移酶的作用將糖類轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)，并和蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。糖基化修飾的主要類型包括N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化是指聚糖與蛋白質(zhì)肽鏈中天冬酰胺的自由氨基連接，從而將糖鏈組裝在蛋白質(zhì)上的過程。O-糖基化則是指聚糖與蛋白肽鏈的絲氨酸或蘇氨酸進(jìn)行連接來修飾蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)糖基化修飾可幫助免疫細(xì)胞進(jìn)行正確的定位與遷移［10］。異常的糖基化修飾與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸等密切相關(guān)［11-12］。因此，闡明糖基化修飾對(duì)PD-1/PD-L1 分子表達(dá)及功能的影響，可以為提高腫瘤免疫治療的療效提供新策略。目前國內(nèi)針對(duì)PD-1/PD-L1 糖基化修飾的相關(guān)綜述有限，本文將在此基礎(chǔ)上對(duì)PD-1/PD-L1 糖基化修飾在腫瘤免疫治療中的作用進(jìn)行綜述。

PD-1 糖基化修飾PD-1 為免疫球蛋白超家族中的一員，其主要表達(dá)在活化的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞表面，是一個(gè)具有268 個(gè)氨基酸殘基的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-1 與其配體PD-L1 結(jié)合，通過去磷酸化影響下游信號(hào)通路上的關(guān)鍵分子，從而起到負(fù)性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的作用［13］。在正常生理狀態(tài)下，PD-1 信號(hào)的激活可抑制過激炎癥反應(yīng)，預(yù)防自身免疫性疾病的發(fā)生［14］。在腫瘤中，PD-1 信號(hào)通路的激活可抑制 T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸［15］。目前為止，PD-1 報(bào)道共有4 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別為N49、N58、N74 和 N116［16］（圖 1）。阻斷任意一個(gè)糖基化位點(diǎn)，均會(huì)導(dǎo)致PD-1 穩(wěn)定性下降以及表達(dá)水平的下調(diào)，提示PD-1 糖基化對(duì)維持其穩(wěn)定性以及表達(dá)水平密切相關(guān)［9］。此外，PD-1 糖基化可以增強(qiáng)PD-1/PD-L1 的結(jié)合能力，阻斷上述任一位點(diǎn)糖基化均會(huì)導(dǎo)致 PD-1/PD-L1 結(jié)合能力下降［9］。Wang 等［17］利用重組人源PD-1 免疫小鼠后，通過抗體人源化獲得了針對(duì)PD-1 的特異性單克隆抗體MW11-h317。該單克隆抗體對(duì)PD-1 表現(xiàn)出高度親和力，并能夠有效阻斷PD-1 與PD-L1/L2 的相互作用，誘導(dǎo)T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，抑制腫瘤生長。對(duì)MW11-h317 與PD-1 的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，其主要針對(duì)PD-1 的N58 糖基化位點(diǎn)。mAb059c 是一種針對(duì)PD-1的單克隆抗體，Liu 等［18］發(fā)現(xiàn)其重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity-determining region，CDR）1/2 區(qū)域主要識(shí)別PD-1 的N58 糖基化位點(diǎn)，突變N58 糖基化位點(diǎn)可以明顯降低mAb059c 和PD-1 的結(jié)合能力。此外，Sun 等［9］構(gòu)建了針對(duì) PD-1 的 N58 糖基化位點(diǎn)的特異性單克隆抗體STM418，該抗體相比于Nivolumab 和Pembrolizumab 具有更高的親和力，同時(shí)能夠顯著抑制PD-1/PD-L1 結(jié)合，促進(jìn)T 細(xì)胞激活，提升抗腫瘤效應(yīng)。

圖1 PD-1/PD-L1 糖基化修飾調(diào)控關(guān)系模式圖Fig 1 Regulation of the glycosylation of PD-1/PD-L1 in cancer

Okada 等［16］利用規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)結(jié)構(gòu)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR 相關(guān)蛋白 9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）全基因組敲除技術(shù)篩選出一系列同PD-1 表達(dá)密切相關(guān)的分子，發(fā)現(xiàn)其中核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 8（fucosyltransferase 8，F(xiàn)UT8）能夠催化PD-1 巖藻糖基化并調(diào)節(jié)PD-1 在T 細(xì)胞上的表達(dá)?；蚯贸蛞种艶UT8 表達(dá)均可明顯降低PD-1 糖基化修飾水平，同時(shí)下調(diào)PD-1 表達(dá)，從而增強(qiáng) T 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng)。Agrawal 等［19］同時(shí)發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中，F(xiàn)UT8 可以介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移，抑制FUT8 可以顯著降低黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，在經(jīng)過PD-1 抑制劑Pembrolizumab 治療的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的患者中，高表達(dá)FUT8 的患者預(yù)后相對(duì)較差［9］。以上研究表明，F(xiàn)UT8 不僅對(duì)PD-1 的糖基化修飾和表達(dá)起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)也影響腫瘤轉(zhuǎn)移和抗PD-1 免疫治療的作用，具有重要的研究前景。

嵌合抗原受體T 細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）免疫療法是近年來一種新興的治療腫瘤的精準(zhǔn)靶向療法，但在實(shí)體腫瘤中，CAR-T 細(xì)胞免疫療法療效卻不盡人意［20］。一項(xiàng)針對(duì)CAR-T細(xì)胞PD-1 糖基化修飾的研究表明，抑制CAR-T 細(xì)胞PD-1 的N74 位點(diǎn)的糖基化修飾可以顯著提升CAR-T 細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，從而提升其在實(shí)體腫瘤中的抗癌作用［21］。綜上，靶向PD-1 糖基化修飾在腫瘤治療中具有巨大的潛力。

PD-L1 糖基化修飾PD-L1 可在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，其能與活化T 細(xì)胞表面PD-1 結(jié)合，從而抑制T 細(xì)胞的增殖、活化、遷移和細(xì)胞毒性作用。經(jīng)糖基化修飾的PD-L1 相對(duì)分子質(zhì)量為45 000~55 000，而未糖基化修的PD-L1 相對(duì)分子質(zhì)量為33 000。抑制PD-L1 的N-糖基化修飾，可以明顯改變PD-L1 的分子量大?。?2］。而抑制O-糖基化修飾則并不出現(xiàn)上述改變，提示PD-L1 同PD-1 一樣，主要表現(xiàn)為高度 N-糖基化修飾［23］。通過質(zhì)譜法鑒定，PD-L1 共有4 個(gè) N-糖基化位點(diǎn)，包括 N35、N192、N200 和 N219。其中N192、N200 和N219 的糖基化修飾對(duì)于維持PD-L1 蛋白穩(wěn)定性至關(guān)重要（圖 1）［22］。非糖基化修飾的PD-L1 較不穩(wěn)定，其可與糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）結(jié)合并被磷酸化后通過泛素/蛋白酶體系統(tǒng)降解，而N192、N200和N219 位點(diǎn)的的糖基化修飾則可產(chǎn)生空間阻遏效應(yīng)，阻礙GSK3β和PD-L1 的相互作用，進(jìn)而起到穩(wěn)定PD-L1 的作用［22］。異常的 PD-L1 糖基化水平同樣會(huì)導(dǎo)致PD-L1 表達(dá)水平的改變。二甲雙胍可誘導(dǎo)AMP 激 活 蛋 白 激 酶（5’AMP-activated protein，AMPK）同PD-L1 結(jié)合并使其磷酸化修飾，導(dǎo)致PDL1 的異常糖基化，進(jìn)而導(dǎo)致其降解［24］。在前列腺癌和三陰性乳腺癌細(xì)胞中，Maher 等［25］發(fā)現(xiàn) Sigma1 分子可以通過促進(jìn)PD-L1 的糖基化而上調(diào)PD-L1 的表達(dá)水平。抑制 Sigma1 可抑制 IFN-γ 介導(dǎo)的 PD-L1 的表達(dá)。在膠質(zhì)瘤中，PD-L1 共同分子伴侶FKBP51s同樣可以通過促進(jìn)PD-L1 的糖基化而上調(diào)PD-L1 的表達(dá)水平。抑制FKBP51s可以顯著降低PD-L1的表達(dá)［26］。而促進(jìn)PD-L1的糖基化水平，可以明顯提高其表達(dá)水平，提示PD-L1 糖基化同時(shí)對(duì)其表達(dá)起正性調(diào)控作用［27］。研究還發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）可通過 β-catenin 信號(hào)軸誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞高表達(dá)N-糖基轉(zhuǎn)移酶STT3，進(jìn)而增加PD-L1 糖基化，導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞PD-L1 上調(diào)和腫瘤免疫逃逸［28］。KYA1797K 抑制劑則可以抑制βcatenin/STT3 信號(hào)軸而影響PD-L1 糖基化，從而進(jìn)一步抑制免疫逃逸并誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡［29］。在此基礎(chǔ)上，Chan 等［30］發(fā)現(xiàn) IL-6 可以誘導(dǎo) JAK1 磷酸化PD-L1 的Y112 位點(diǎn)，而該位點(diǎn)的磷酸化有助于STT3A 催化 PD-L1 糖基化，而阻斷 IL-6/JAK1 信號(hào)軸可以抑制STT3A 同PD-L1 結(jié)合，導(dǎo)致PD-L1降解。

PD-L1 的糖基化修飾和其與PD-1 的結(jié)合以及免疫抑制密切相關(guān)，阻斷PD-L1 糖基化可以顯著提升抗腫瘤效應(yīng)。利用N-糖苷酶（PNGase F）水解PD-L1 的糖 鏈 后，PD-1/PD-L1 結(jié) 合 能 力 喪 失［23］。將T 細(xì)胞同表達(dá)糖基化和表達(dá)非糖基化PD-L1 的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)表達(dá)非糖基化PDL1 的乳腺癌細(xì)胞凋亡更為顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在BALB/c 小鼠體內(nèi)，野生型PD-L1 細(xì)胞相比于PD-L1 糖基化位點(diǎn)突變細(xì)胞生長更為迅速，而將上述細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠后生長速度相似，表明糖基化對(duì)PD-L1 的免疫抑制功能十分重要［23］。阻斷PD-L1 的糖基化同時(shí)還可以影響PD-L1 正確轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上。Verdura 等［31］發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以靶向破壞PD-L1 糖鏈并影響其二聚化，從而導(dǎo)致其無法被正確轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上。在三陰乳腺癌中，糖基轉(zhuǎn)移酶B3GNT3 表達(dá)顯著升高且與預(yù)后密切相關(guān)。B3GNT3 受到上游EGF/EGFR 信號(hào)的激活而促進(jìn)PD-L1 的 N192 和 N200 位點(diǎn)糖基化，從而確保 PD-1/PD-L1 結(jié)合［32］。通過構(gòu)建單克隆抗體藥物偶聯(lián)復(fù)合 物 STM108-ADC 針 對(duì) PD-L1 的 N192 和 N200 糖基化位點(diǎn)，可以顯著抑制腫瘤活性［32］。此外，Liu等［33］發(fā)現(xiàn)在B 細(xì)胞淋巴瘤中，糖基轉(zhuǎn)移酶GLT1D1同樣可以促進(jìn)PD-L1 的N-糖基化水平，并損害細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷功能。Shao 等［34］發(fā)現(xiàn)2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose）可以作為葡萄糖類似物降低PD-L1 的糖基化水平，從而拮抗PARP抑制劑誘導(dǎo)的糖化PD-L1 表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，Kim等［35］發(fā)現(xiàn) 2-脫氧右旋葡萄糖（2-deoxy-D-glucose）可以同樣可誘導(dǎo)PD-L1 去糖基化，并增強(qiáng)4‐1BB 介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)。

常規(guī)情況下，PD-L1 表達(dá)小于1%的患者一般不推薦使用 PD-L1 治療［36］。由于 PD-L1 糖基化的存在，通常會(huì)造成臨床檢查假陰性出現(xiàn)。移除PDL1 糖基化修飾可以提高檢測率，更好地指導(dǎo)臨床用藥，同時(shí)在一定程度上對(duì)患者的療效進(jìn)行預(yù)測［37-38］。以上研究表明，針對(duì)PD-L1 糖基化修飾的抗腫瘤治療具有一定的臨床應(yīng)用前景。

結(jié)語近年來，基于阻斷PD-1/PD-L1 的免疫治療手段飛速發(fā)展，已經(jīng)逐步在臨床推廣和應(yīng)用，但其治療緩解率仍然相對(duì)較低。隨著針對(duì)PD-1/PD-L1 糖基化修飾研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)糖基化修飾對(duì)PD-1/PD-L1 的穩(wěn)定性和相互作用起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)也是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要機(jī)制之一。不僅如此，一些能夠催化PD-1/PD-L1 糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶也被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，并且與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。因此，開發(fā)針對(duì)PD-1/PD-L1 糖基化為靶點(diǎn)的治療手段具有明顯優(yōu)勢，有望成為腫瘤治療的新途徑和新方法。

作者貢獻(xiàn)聲明李胤 論文構(gòu)思、撰寫和修訂，文獻(xiàn)回顧，圖表繪制。陳一葦，陳芳華 文獻(xiàn)回顧，論文撰寫和修訂。張舒 論文構(gòu)思和修訂。盧春來 論文構(gòu)思、撰寫和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。