干旱、鹽脅迫對濟麥22生長及CKX4基因表達(dá)的影響

郭丁預(yù),尚娟花,張立培,陳 磊,趙 婧,宋建成,趙吉強

(1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264005;2.煙臺吉恩生物科技有限公司,山東 煙臺 264006)

細(xì)胞分裂素(Cytokinin, CTK)作為一類腺嘌呤衍生物和重要的植物激素,能夠促進(jìn)植物細(xì)胞分裂、分化并延緩衰老,對植物生長發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。研究表明,細(xì)胞分裂素的累積顯著抑制植株幼苗初生根的伸長,在胚根伸長和根毛發(fā)育過程中有刺激作用,內(nèi)源細(xì)胞分裂素則抑制側(cè)根發(fā)育[2-3]。細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶(Cytokinin Oxidase/Dehydrogenase, CKX)是目前所知唯一可以不可逆降解細(xì)胞分裂素、使其含量降低的酶[4-6],是調(diào)節(jié)植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量的關(guān)鍵因素之一[7]。研究發(fā)現(xiàn),水稻CKX4基因在水稻根分化發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用,根特異性表達(dá)OsCKX4可以提高鋅含量和產(chǎn)量性狀[8]。植物中CKX4基因的下調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂素的累積,從而抑制側(cè)根和冠狀根的生長以及作物對鋅的吸收,進(jìn)而影響整株作物的生長發(fā)育及產(chǎn)量等特性[2-6]。所以,對小麥TaCKX4基因進(jìn)行遺傳操作可能是改善小麥品質(zhì)和產(chǎn)量的重要途徑,對培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的小麥品種有重要意義。

本研究基于小麥TaCKX4基因的調(diào)控功能,以濟麥22為試驗材料,以不同濃度PEG和NaCl為脅迫條件,通過測定各項生理指標(biāo)和TaCKX4基因表達(dá)水平,探究逆境脅迫對小麥生長發(fā)育以及TaCKX4基因表達(dá)情況的影響,驗證了逆境下CKX4基因的調(diào)控功能,為培育優(yōu)質(zhì)小麥品種提供試驗數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗于2020年6月至2020年9月在煙臺大學(xué)進(jìn)行。供試小麥品種為濟麥22。

1.1.1 種子預(yù)處理 選擇均勻一致、籽粒飽滿的小麥種子,2.5%次氯酸鈉表面消毒15～20 min,無菌水反復(fù)沖洗后放置于鋪有無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中保持水分,種子吸脹8～10 h后于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽培養(yǎng),2～3 d后選取長勢均一的幼苗移植到裝有滅菌基質(zhì)土壤的育苗盆中和種子袋中。

1.1.2 幼苗處理 20%、30%、40%的PEG-6000以及150 mmol/L、250 mmol/L的NaCl溶液處理種子袋中小麥,無菌水處理作為對照,放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天更換一次處理液,兩周后測定各項生理指標(biāo);各溶液處理兩葉一心期育苗盆中幼苗,無菌水處理作對照,5 d后隨機取樣進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定;選取40% PEG-6000和250 mmol/L NaCl溶液處理兩葉一心期幼苗,無菌水處理作對照,分別在0.5、1、2、12、24 h隨機取樣速凍于液氮中,-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以上各處理均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 生理指標(biāo)測定 各溶液處理后的小麥幼苗進(jìn)行植株高度、根長測定;小麥幼苗根細(xì)胞活力的測定參照李小寧等[9-10]的方法;葉綠素含量的測定參照王文杰等[11-13]的方法。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 Max-Imaging-PAM調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(德國 WALZ)測定葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)。選取長勢一致且受光方向相同的葉片,暗適應(yīng)30 min后進(jìn)行慢速動力學(xué)曲線測定,調(diào)節(jié)測量光、飽和脈沖光和光化光參數(shù),待ΔF/FV穩(wěn)定在1/3～2/3之間時,進(jìn)行快速光響應(yīng)曲線的測定。測定參數(shù)包括PSⅡ最大光合效率FV/Fm、PSⅡ?qū)嶋H光合效率Y(Ⅱ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)qp。

1.2.3TaCKX4基因表達(dá)量分析 不同時間點取得速凍小麥葉片總RNA提取參照艾可筠等[14]的方法,檢測后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,設(shè)計四對引物并驗證特異性后進(jìn)行實時熒光定量PCR,得到Cp值進(jìn)行表達(dá)量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PEG和NaCl溶液對濟麥22幼苗長勢的影響

如圖1(a),隨處理溶液濃度增加,各處理間植株高度呈下降趨勢,40% PEG處理的植株高度最低,相比對照組降幅90%以上。圖1(b)中不同脅迫處理下濟麥22幼苗一周的根長勢情況表明,對照組根長勢最優(yōu),40% PEG脅迫處理下的根長勢最差。因此,隨著干旱和鹽脅迫程度增加,濟麥22植株長勢愈差,表明逆境脅迫對濟麥22植株高度、根長影響顯著。

中柱上方不同字母表示各處理在0.05水平上的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 不同濃度PEG和NaCl溶液對濟麥22幼苗根細(xì)胞活力的影響

隨著處理溶液濃度的增加,濟麥22處理兩周后在600 nm處的吸光值呈現(xiàn)下降趨勢,40% PEG處理的吸光值最低,對照組處理下濟麥22根中伊文思藍(lán)的吸收量是40% PEG處理的7～8倍,此結(jié)果可能與小麥品種本身較好、處理時間不夠等因素有關(guān),隨著處理溶液濃度增加小麥植株自身的抗逆機制加強從而外排染料,使得根細(xì)胞活力更強。

柱上方不同字母表示各處理在0.05水平上的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 不同濃度PEG和NaCl溶液對濟麥22幼苗葉綠素含量的影響

隨著處理溶液濃度的增加,葉綠素含量呈現(xiàn)下降趨勢。相較對照組,只有40% PEG處理下的葉綠素含量下降,降幅34.08%;而20% PEG處理下的葉綠素含量與對照相較增幅最大,為115.27%。表明逆境脅迫對濟麥22苗期葉綠素含量有顯著影響,從側(cè)面也反映了植株整體的生長情況隨脅迫程度增加而愈差。

柱上方不同字母表示各處理在0.05水平上的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 干旱和鹽脅迫對濟麥22幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

如圖4(a),各脅迫下Fv/Fm均有所下降,20%和40%的PEG脅迫影響較為顯著,相比對照組分別下降了4.04%、4.42%,且40% PEG脅迫下的值最低,為0.743。各脅迫對Y(Ⅱ)的影響如圖4(b)所示:隨處理溶液濃度的增加,實際光合效率呈下降趨勢,40% PEG脅迫下Y(Ⅱ)相比對照組其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,下降了11.98%。如圖4(c),20% PEG和150 mmol/L NaCl處理下qp相比對照組均有所增大但不顯著,分別增幅0.78%、8.38%,而40% PEG脅迫下qp降幅16.22%,與對照相比的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示,PEG脅迫相比NaCl脅迫對濟麥22葉片的熒光參數(shù)影響更為顯著。隨干旱脅迫程度增加,葉綠素?zé)晒鈪?shù)下降,植株長勢愈差;鹽脅迫則表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)、高濃度抑制。葉綠素?zé)晒鈪?shù)及熒光圖均反映了干旱和鹽脅迫對濟麥22生長情況的影響,表明植株在逆境脅迫下葉綠素?zé)晒鈪?shù)與對照組比較其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,植株的生長發(fā)育受到影響。

(a)、(b)、(c)分別為各脅迫對濟麥22葉片F(xiàn)v/Fm、Y(Ⅱ)、qp的影響,柱上方不同字母表示各處理的差異在0.05水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。(d)、(e)、(f)分別表示各脅迫下濟麥22 Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qp的熒光圖像,從左向右依次為:對照、20% PEG、30% PEG、40% PEG、150 mmol/L NaCl、250 mmol/L NaCl處理組。色素條從左向右的顏色變化代表從0到1的變化。

2.5 高鹽和PEG脅迫下濟麥22 TaCKX4基因在各階段的表達(dá)情況

2.5.1 RNA檢測 將濟麥22不同時間點葉片的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,28S和18S RNA條帶清晰,RNA樣品完整。使用Nano VueTM超微量紫外分光光度計檢測純度,結(jié)果顯示各樣品A260/A280均為1.9～2.0,表明RNA純度高,能滿足反轉(zhuǎn)錄實驗要求。圖5為1 h時40% PEG干旱脅迫下濟麥22幼苗葉片的RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,其余處理及不同時間點的RNA檢測結(jié)果類似。

圖5 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA

2.5.2 目的基因引物特異性PCR檢測 普通PCR驗證目的基因引物特異性(圖6),結(jié)果顯示第三組引物特異性良好,條帶單一,沒有非特異性擴增和引物二聚體出現(xiàn),并確定了目的基因引物Tm為56 ℃。

2.5.3 40% PEG干旱脅迫和250 mmol/L NaCl鹽脅迫下TaCKX4基因表達(dá)分析 采用實時熒光定量PCR,分析了濟麥22幼苗葉片中TaCKX4基因在不同脅迫條件下24 h的基因表達(dá)變化(圖7):NaCl(250 mmol/L)鹽脅迫使TaCKX4基因的轉(zhuǎn)錄在1 h達(dá)到最高水平后驟然下降,12 h時達(dá)到最低。PEG(40%)干旱脅迫則在0.5 h達(dá)到轉(zhuǎn)錄最高水平,2 h達(dá)到最低,表達(dá)趨勢同NaCl鹽脅迫類似。TaCKX4基因轉(zhuǎn)錄達(dá)到最高水平時相比對照組其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,均上調(diào)5倍左右;轉(zhuǎn)錄水平最低時相比對照組其差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖7 PEG和鹽脅迫下TaCKX4基因表達(dá)分析

綜上,TaCKX4基因表達(dá)量在24 h的脅迫過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,開始受脅迫的1 h內(nèi)CKX4基因表達(dá)量急劇上升對脅迫做出響應(yīng),隨脅迫時間的增加、溶液濃度的揮發(fā)以及CKX4基因響應(yīng)水平達(dá)到最大,CKX4基因表達(dá)量大致回歸正常水平。CKX4基因的表達(dá)量與脅迫呈正相關(guān),表明其在脅迫過程中通過上調(diào)表達(dá)量抑制細(xì)胞分裂素產(chǎn)生和累積,進(jìn)而促進(jìn)根的發(fā)育并保證植株正常生理活動進(jìn)行。

3 討 論

本研究以濟麥22號小麥為材料,探究了干旱和鹽脅迫對小麥生長發(fā)育的影響和TaCKX4基因的表達(dá)情況。生理指標(biāo)測定結(jié)果表明,不同濃度PEG和NaCl溶液對濟麥22各生理指標(biāo)影響顯著。隨著處理溶液濃度的增加,脅迫程度增加,濟麥22根長、根細(xì)胞活力和葉綠素含量等指標(biāo)均呈現(xiàn)下降趨勢且與對照相比的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。根細(xì)胞活力指標(biāo)可以直接體現(xiàn)脅迫處理對小麥根生長狀況的影響,ZANARDO D I L等[10]于2009年將該方法應(yīng)用于檢測大豆生理指標(biāo)。李小寧[9]對冬小麥的鋅脅迫處理觀測到高濃度鋅使小麥幼苗根細(xì)胞活力減弱。本研究可能由于濟麥22品種本身抗逆性較好或CKX4等基因的表達(dá)抑制細(xì)胞分裂素累積促進(jìn)根的生長發(fā)育等因素而使得高濃度脅迫下植株抗逆機制較強,從而根細(xì)胞活力較強。葉綠素?zé)晒鈪?shù)作為考察植物光合作用的重要指標(biāo),通過植物光合作用狀態(tài),反應(yīng)植株生長狀況的良好與否[15]。Fv/Fm是PSⅡ最大量子產(chǎn)量,反映了植物的潛在最大光合活性,當(dāng)植物受到脅迫時,該參數(shù)顯著下降。Y(Ⅱ)=ΦPSⅡ,表示任一光照狀態(tài)下PSⅡ的實際量子產(chǎn)量,即實際光合效率,該參數(shù)與線性電子傳遞相關(guān)[16]。qp為光化學(xué)淬滅系數(shù),即由光合作用引起的熒光淬滅,反映了光合活性的高低[16]。本研究中葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qp均呈現(xiàn)隨著脅迫程度的增加而下降的趨勢,40% PEG模擬干旱脅迫下的各參數(shù)降幅最大,說明脅迫響應(yīng)最劇烈。原佳樂等[15]、吳金芝等[16]的研究均反映了干旱條件對葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響顯著。40% PEG和250 mmol/L NaCl溶液脅迫處理濟麥22后24 h內(nèi)TaCKX4基因表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,與脅迫時間呈正相關(guān),0.5 h或1 h時基因表達(dá)量驟然上調(diào)5倍,隨脅迫時間的推移,植株受脅迫愈發(fā)嚴(yán)重,TaCKX4基因表達(dá)水平降幅明顯,最后幾小時TaCKX4基因表達(dá)水平有所回升。艾可筠等[14]在對小麥NAC基因的干旱脅迫分析中得到了相同的表達(dá)趨勢。綜上分析,PEG干旱脅迫和NaCl鹽脅迫對各生理指標(biāo)的影響呈現(xiàn)一致趨勢,即隨脅迫程度增加生理指標(biāo)降低,然而植株并沒有壞死并保持其正常生理活動的進(jìn)行,說明受到脅迫后,植株對脅迫做出響應(yīng),通過上調(diào)TaCKX4基因的表達(dá)水平抑制細(xì)胞分裂素的產(chǎn)生和累積,緩解了小麥植株受脅迫的影響程度,保證了植株正常生理活動的進(jìn)行。

本研究中濟麥22在不同濃度干旱和鹽漬脅迫下的生長情況隨脅迫程度增加而長勢愈弱,然而植株在受脅迫后會作出一定響應(yīng)對抗逆境脅迫以保證正常生理活動進(jìn)行。研究CKX4基因功能可為解決逆境下小麥等作物的產(chǎn)量和抗逆性問題,為深入解析優(yōu)良品種的抗逆機制提供了線索和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。