李 敏,魏穎杰,劉宗亮,鄒方霞,王洪波,田京偉

(煙臺大學(xué)藥學(xué)院,新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學(xué)),山東 煙臺 264005)

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率均排名前五位,嚴(yán)重威脅人類的生命和健康[1]。NCCN 2018版《結(jié)直腸癌臨床實踐指南》指出,常用的化療方案一般同時使用兩種或三種化療藥物,其中喜樹堿類衍生物伊立替康(CPT-11)是最常用藥物之一[2]。

CPT-11屬于喜樹堿衍生物[3],于1994年在日本上市,并于1996年被美國FDA批準(zhǔn)用于晚期結(jié)直腸癌的治療[4]。CPT-11在體內(nèi)被水解成活性成分SN-38,SN-38的體外抗腫瘤活性是CPT-11的100到1000倍[5]。盡管CPT-11顯示出良好的抗腫瘤活性,但有腹瀉、中性粒細(xì)胞減少和乏力等諸多不良反應(yīng)[6]。CPT-11引起的腹瀉有兩種類型:早發(fā)性腹瀉和遲發(fā)性腹瀉,其中早發(fā)性腹瀉是由乙酰膽堿綜合征引起的,遲發(fā)性腹瀉是劑量限制的毒性作用,可能是由SN-38導(dǎo)致的腸粘膜損傷引起的[7-8]。因此,尋找具有高抗腫瘤活性且低不良反應(yīng)的新結(jié)構(gòu)喜樹堿衍生物將為臨床患者帶來更多的獲益。通過化學(xué)合成得到了一種新的喜樹堿類衍生物,將它命名為PCC0208021(圖1),并在體外實驗中顯示出良好的抗腫瘤作用。該研究有望為臨床提供抗腫瘤效果良好的新型喜樹堿先導(dǎo)化合物。

圖1 PCC0208021的結(jié)構(gòu)

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞株

結(jié)直腸癌細(xì)胞系LS180、HCT116、CT-26和HT-29購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥品與試劑

乙腈、丁二酸酐、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、N,N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺購自伊諾凱科技有限公司(中國北京);SN-38購自上海瀚香生物科技有限公司(中國上海,批號:20190306);CPT-11購自上海瀚香生物科技有限公司(中國上海,批號:20170617);拓?fù)洚悩?gòu)酶I藥物篩選試劑盒購自博奧派克科技有限公司(中國上海);MTT檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司(中國上海);結(jié)晶紫染色液購自碧云天生物技術(shù)公司(中國上海);超純溴化乙錠購自賽默飛(中國上海)。

1.3 主要儀器

光學(xué)顯微鏡(日本Olympus),CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司),離心機(jī)(美國Beckman公司),電泳儀(美國Bio-Rad公司),凝膠成像儀(上海Tanon公司)。

2 實驗方法

2.1 化學(xué)合成

2.1.1 化合物2的制備 向1 L燒瓶中加入化合物1 (5.42 g, 22 mmol)、 乙腈 (108.4 mL)、丁二酸酐 (2.0 g, 20 mmol)和4-二甲氨基吡啶 (3.7 g, 30 mmol),將反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜。先濃縮,再加入乙酸乙酯稀釋,用水洗滌,再用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相,濃縮至干,得到的殘留物用制備HPLC分離,得到化合物2(2.1 g,30.3%產(chǎn)率)。LC-MSm/z: 347[M+H]+;RT=4.901 min。

2.1.2 化合物PCC0208021的制備 向含有化合物2(2.5 g, 7.22 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺 (25 mL)溶液中添加化合物3(2.83 g, 7.22 mmol)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 (2.8 g,14.4 mmol)和4-二甲氨基吡啶 (88 mg, 0.722 mmol)。將反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜。先濃縮,再加入乙酸乙酯稀釋,用水洗滌,再用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相,濃縮至干,得到的殘留物用HPLC分離,得到目標(biāo)化合物PCC0208021 (2.1 g,40.3%產(chǎn)率),為白色固體。LC-MSm/z: 721 [M+H]+;RT=7.147 min。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.94 (d,J=4.8 Hz, 1H), 8.21 (d,J=9.2 Hz, 2H), 8.08 (d,J=6.8 Hz, 1H), 8.00 (d,J=2.0 Hz, 1H), 7.65 (m, 1H), 7.33(s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.76 (d,J=5.2 Hz, 2H), 5.44 (s, 2H), 5.34 (s, 2H), 4.91～4.88 (m, 1H), 4.47～4.45 (m, 1H), 4.08～4.04 (m, 1H), 3.20～3.14 (m, 2H), 3.01～2.98 (m, 2H), 2.86～2.83 (m, 2H), 1.92～1.82 (m, 2H), 1.35～1.23 (m, 7H), 0.90～0.86 (m, 3H)。HPLC: purity @254 nm: 98.35%; 214 nm: 98.70%。

圖2 PCC0208021的合成路線

2.2 細(xì)胞增殖實驗

2.2.1 MTT實驗檢測PCC0208021 對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響 LS180和CT-26在含10%胎牛血清的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),HCT116和HT-29含10%胎牛血清的McCoy's 5A(改良)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細(xì)胞在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。四種結(jié)直腸癌細(xì)胞(LS180、HCT116、HT-29和CT-26)以3000個/孔(100 μL)分別接種96孔板,在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁后,分別加入不同濃度的PCC0208021、SN-38、CPT-11以及相應(yīng)溶劑對照的培養(yǎng)基處理細(xì)胞,PCC0208021、SN-38和CPT-11濃度分別為20、6、2、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003、0.001 μmol/L,每孔加入100 μL,每組設(shè)三個平行孔,在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL),繼續(xù)在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h,棄上清,每孔加入150 μL DMSO溶解生成的結(jié)晶產(chǎn)物MTT甲瓚沉淀,搖床充分震蕩10 min,用酶標(biāo)儀檢測各組在570 nm波長下的吸光度。

2.2.2 平板克隆實驗檢測PCC0208021對結(jié)直腸癌細(xì)胞集落形成能力的影響 選用兩種貼壁性強(qiáng)且能形成集落的結(jié)直腸癌細(xì)胞LS180和HCT116,將結(jié)直腸癌細(xì)胞LS180和HCT116接種于六孔板,300個/孔(2 mL),在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。分別加入濃度為0.02、0.04 μmol/L的PCC0208021、0.04 μmol/L的SN-38、3 μmol/L的CPT-11以及相應(yīng)溶劑對照的培養(yǎng)基處理細(xì)胞,每組設(shè)三個平行孔。孵育14 d(每3 d換一次液),結(jié)晶紫染色,拍照并進(jìn)行集落數(shù)的統(tǒng)計。

2.3 PCC0208021抗腫瘤機(jī)制研究

2.3.1 拓?fù)洚悩?gòu)酶I的酶活性檢測實驗 在20 μL的體系中加入10×TGS Buffer 2 μL、超螺旋質(zhì)粒DNA(pHOT 1) 2 μL、PCC0208021/陽性對照2 μL、含有4U Topo I 2 μL,在37 ℃孵育30 min,加入2 μL 10% SDS終止反應(yīng),加入2 μL蛋白酶K在37 ℃孵育15 min,最后補(bǔ)充ddH2O至20 μL。加入2 μL 10倍的上樣緩沖液,樣品加到1%瓊脂糖凝膠上,70 V電泳至溴酚藍(lán)的染料層在凝膠的70%～80%,用0.5 μg/mL溴化乙錠浸泡15 min染色,流水沖洗15 min,凝膠成像儀拍照[9-10]。

2.3.2 分子對接實驗 小分子的準(zhǔn)備:首先應(yīng)用Chemdraw 14.0繪制PCC0208021的2D結(jié)構(gòu)(圖1),然后經(jīng)由Discovery Studio 2018 (DS 2018)轉(zhuǎn)為3D構(gòu)象,并通過“CHARMm Minimization”模塊,對PCC0208021進(jìn)行初步能量優(yōu)化。將處理的化合物使用DS 2018中的“Minimize Ligand”模塊進(jìn)行后續(xù)對接準(zhǔn)備，主要包括以下兩個方面:(1) Algorithm設(shè)置為Steepest Descent,Max Steps 5000, RMC Gradient 0.01;(2) Algorithm設(shè)置為Conjugate Gradient,Max Steps 5000, RMC Gradient 0.01。最后,小分子已經(jīng)處理完畢以備對接。

Topo I-DNA受體復(fù)合物處理:選取Topo I-DNA和Topotecan的晶體復(fù)合物 (PDB號:1K4T)為對接中的蛋白受體,活性位點則選擇Topotecan所在的區(qū)域。其中Topo I-DNA受體復(fù)合物的準(zhǔn)備采用“Prepare Protein”模塊,步驟如下:(1) 將水分子盡數(shù)除去,加入全部氫原子;(2)對非標(biāo)準(zhǔn)名稱、非完整的氨基酸及某一殘基同時存在的多種構(gòu)象等問題進(jìn)行校正;(3)賦予CHARMm力場對蛋白的能量收斂;(4)其他參數(shù)保持默認(rèn)值。

分子對接:采用的是Discovery Studio 2018 中的“Dock Ligands (CDOCKER)”模塊,主要是模擬PCC0208021和Topotecan在Topo I-DNA受體復(fù)合物的結(jié)合相似性。對接步驟如下:將處理Topo I-DNA設(shè)置為Receptor,定義晶體的配體分子Topotecan所在區(qū)域為活性位點,半徑設(shè)置為0.9 nm,其余默認(rèn)。點擊“Run”運行工作[11]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 實驗結(jié)果

3.1 目標(biāo)化合物的合成 通過化學(xué)合成得到PCC0208021 2.1 g,其產(chǎn)率為40.3%,性狀為白色固體,純度為98.35%。

3.2 細(xì)胞增殖實驗

3.2.1 MTT實驗 評估了PCC0208021對四種結(jié)直腸癌細(xì)胞(LS180、HCT116、HT-29和CT-26)增殖抑制作用,實驗結(jié)果如表1所示,PCC0208021對四種結(jié)直腸癌細(xì)胞具有良好的抗腫瘤活性,計算得PCC0208021對LS180、HCT116、HT-29和CT-26的IC50值分別為0.030、0.795、0.424和1.504 μmol/L,體外活性與SN-38相當(dāng),強(qiáng)于CPT-11。

表1 PCC0208021對LS180、HCT116、HT-29和CT-26細(xì)胞的抑制作用

3.2.2 平板克隆實驗 PCC0208021作用細(xì)胞14 d后,與對照組相比,PCC0208021能顯著抑制LS180和HCT116細(xì)胞集落形成(圖3)。在0.02 μmol/L和0.04 μmol/L PCC0208021處理下,LS180細(xì)胞集落形成抑制率分別為33.86%和66.82%,對HCT116細(xì)胞集落形成抑制率分別為44.28%和59.28%。

3.3 PCC0208021抗腫瘤機(jī)制研究

3.3.1 拓?fù)洚悩?gòu)酶I的酶活性檢測實驗 如圖4所示,DNA質(zhì)粒處于超螺旋的狀態(tài),加入Topo I后,超螺旋的DNA被Topo I松弛。PCC0208021可以抑制超螺旋DNA的松弛,且呈劑量依賴性。陽性化合物SN-38抑制了超螺旋DNA的松弛。PCC0208021以類似于SN-38的方式抑制超螺旋DNA的弛豫。

與對照組相比,*P<0.05。

圖4 PCC0208021對拓?fù)洚悩?gòu)酶I酶活性的影響

3.3.2 分子對接實驗 前期研究發(fā)現(xiàn),Topotecan與Topo I-DNA的結(jié)合模式較為獨特:Topotecan整個分子被ASN352、GLU356、ARG364、ASP533、ILE535、THR718和ASN722氨基酸包圍。其中,酚羥基可與GLU356的羧基形成氫鍵,六元內(nèi)脂環(huán)上的氧原子與THR718形成另一極性相互作用。這些作用力有助于Topotecan與Topo I-DNA穩(wěn)定結(jié)合,從而產(chǎn)生抑制效果。

與Topotecan和Topo I-DNA形成的結(jié)合構(gòu)象類似,PCC0208021與周圍氨基酸形成的作用力如下:內(nèi)酯環(huán)上的氧原子與THR718形成了氫鍵,11位氟原子跟MET428形成疏水作用,四氫呋喃環(huán)上的甲基與GLU356形成疏水作用。這些保證了PCC0208021的結(jié)合模式與Topotecan類似,且對Topo I-DNA產(chǎn)生抑制效果。

圖5 分子對接檢測PCC0208021與Topo I-DNA 的結(jié)合

Fig.5 Binding of PCC0208021 with Topo I-DNA estimated by molecular docking

4 討論與結(jié)論

結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均排名前五位,嚴(yán)重威脅人類的健康。喜樹堿類抗腫瘤藥CPT-11是結(jié)直腸癌的臨床一線用藥,其副作用大大限制了它的臨床使用,因此尋找新型喜樹堿衍生物成為研究的熱點之一。CPT-11在體內(nèi)被水解成其活性成分SN-38,從而發(fā)揮抗腫瘤效果[3],為此本研究基于SN-38結(jié)構(gòu)合成了一種代號為PCC0208021的新型喜樹堿衍生物。PCC0208021的化學(xué)合成是一種經(jīng)典的成酯反應(yīng),操作簡單。

MTT實驗和平板克隆實驗證明PCC0208021可以抑制結(jié)直腸癌的增殖和集落的形成,并且抑制作用隨劑量的增加而增強(qiáng)。Topo I是人體必需的酶,是喜樹堿類化合物的作用靶點。喜樹堿類藥物可通過形成喜樹堿-DNA-Topo I的三元復(fù)合物抑制Topo I的活性,進(jìn)而誘導(dǎo)DNA損傷最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡[12]。為了驗證PCC0208021的作用靶點,通過Topo I的酶活性實驗發(fā)現(xiàn)PCC0208021以類似于SN-38的形式抑制Topo I的活性。通過分子對接實驗,發(fā)現(xiàn)PCC0208021可直接與Topo I結(jié)合。以上實驗結(jié)果證明了PCC0208021的靶點也是Topo I。新型喜樹堿衍生物PCC0208021的體內(nèi)抗腫瘤活性及安全性尚需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

本研究首次合成了具有新結(jié)構(gòu)、強(qiáng)Topo I抑制活性的喜樹堿衍生物PCC0208021,該化合物體外具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制活性,是一種良好的新型喜樹堿的先導(dǎo)化合物。