李羽葳，王勃然，賈 鑫?

（中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100080）

我國國土面積廣袤，海岸線漫長，海水產(chǎn)品資源豐富。瓣鰓綱如牡蠣、扇貝等食用貝類，因產(chǎn)量高、高蛋白、低脂肪、肉質(zhì)鮮美等原因深受消費者喜愛，牡蠣蛋白更能與鋅螯合制成補鋅食品[1]，促進生長發(fā)育。傳統(tǒng)貝類水產(chǎn)品加工通過加熱方式，破壞共價鍵使得蛋白質(zhì)變性從而殺菌，但是加熱的貝類肉質(zhì)收縮，汁液流失嚴重，有明顯的黃色熟化外觀[2]，有損食品感官品質(zhì)[3]。超高壓處理作為一種水產(chǎn)品非熱加工方式，能夠使得生物體高分子立體結(jié)構(gòu)中的疏水相互作用、氫鍵、離子鍵等非共價鍵結(jié)合發(fā)生變化，從而達到殺菌、鈍酶的作用[4-6]。此外，超高壓處理技術(shù)能夠在有效殺菌的同時不破壞水產(chǎn)品原有的風味，較好地分離貝類肉殼。且隨著壓力的增加，貝類肉質(zhì)完整飽滿外觀變化不顯著，具有多汁性，無肉眼可見的顏色差異[7]。

弧菌屬細菌是一種革蘭氏陰性兼性厭氧型細菌，其中大多種類均有較強的致病性。瓣鰓綱動物的鰓不僅是呼吸器官，還是重要的濾食器官，故食用貝類易被細菌污染。特別是深圳等沿海城市是副溶血弧菌引起食物中毒和感染性腹瀉的高發(fā)區(qū)域[8]，往年因食入致病性弧菌屬細菌導致死亡的案例時有發(fā)生。

壓力分子蛋白在細菌中普遍存在，是細菌中響應環(huán)境脅迫（溫度、鹽度、壓力等）的重要信息調(diào)控中心，RsbT 蛋白作為壓力分子蛋白中重要的蛋白激酶，調(diào)節(jié)下游基因表達。在革蘭陽性枯草芽孢桿菌壓力分子蛋白感應環(huán)境變化，通過蛋白介導的可逆磷酸化最終激活介導環(huán)境脅迫應答的σB因子，增強其調(diào)節(jié)子（regulon）下游基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控超過150 種與壓力應答、生物膜形成等相關(guān)的基因表達，使細菌適應新環(huán)境并得以生存。擬借鑒革蘭氏陽性菌響應環(huán)境脅迫機制探究革蘭氏陰性菌的信息傳遞通路。前期研究表明革蘭陰性巴西弧菌蛋白響應無氧脅迫，誘使vbRsbR蛋白感應結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，并激活壓力分子蛋白亞基激酶vbRsbT，促進壓力分子蛋白核心磷酸化水平升高。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RsbT 蛋白激酶質(zhì)粒、大腸桿菌（重組Anti-Thiophosphate 抗體）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）、Western Blot 轉(zhuǎn)印膜、Western ECL Substrate：伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（北京）有限公司；鎳瓊脂糖填料：北京韋氏博慧色譜科技有限公司；氯化鈉：國藥集團化學試劑北京有限公司；胰蛋白胨、酵母抽提物：OXIDO（北京）；Rosetta 感受態(tài)：康為世紀（北京）；IPTG（VWR 0487）、卡那霉素（VWR 75856.686）、10 孔蛋白電泳預制膠（8%）、電極緩沖液、分子量標準蛋白質(zhì)、彩虹245 plus廣譜蛋白Marker：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

圓二色光譜儀：英國應用光物理公司；SCI-VS漩渦振蕩器（SCILOGEX）、5424 快速蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、電泳儀、水平脫色搖床：伯樂（Bio-Rad）公司；B-100G5/5L/600 MPa 型UHP 設(shè)備：上海勵途超高壓設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋：深圳海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Fresco 低溫冷凍離心機：賽默飛世爾科技有限公司；臺式恒溫振蕩器：北京中科華美生化有限公司；超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；SH13V-AZ55型真空封口機：九陽股份有限公司；電磁爐（C21-WK2102 型）：美的集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 目的蛋白表達純化

采用大腸桿菌為載體，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒并進行過夜培養(yǎng)、質(zhì)粒擴大培養(yǎng)及蛋白純化等過程提取RsbT蛋白激酶。擴大培養(yǎng)后先進行菌體破碎，獲得上清液與沉淀，通過SDS-PAGE 凝膠電泳獲得蛋白富集區(qū)域（上清液）與分子量（RsbT 蛋白激酶分子量約為62 kD），并使用緩沖液（0.5 mol/L TEA，0.5 mol/L NaCl，50 mL 甘油，0.1 mol/L MgCl2·6H2O，100 mL 體系）通過鎳柱純化得到目的蛋白，再次通過SDS-PAGE 凝膠電泳分析蛋白的純度和濃度。

1.3.2 超高壓處理

以200 MPa 為梯度進行不同壓力（100、300、500 MPa）的超高壓處理，保壓時間5 min，處理溫度室溫，保存溫度–80 ℃。

1.3.3 壓力分子蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

RsbT 蛋白激酶是一種蛋白質(zhì)，采用圓二色譜法探究梯度壓力處理對RsbT 蛋白激酶二級結(jié)構(gòu)的影響。

1.3.4 RsbT 體外激酶試驗

使用免疫蛋白印跡法與化學顯色可得到RsbT蛋白激酶的自磷酸化能力，驗證梯度壓力處理對RsbT 蛋白激酶生理活性的影響。將RsbT 蛋白激酶與ATP-γ-S 反應30 min，并用Western-Blot 來驗證梯度壓力對RsbT 蛋白激酶自磷酸化能力的抑制；再細化RsbT 蛋白激酶與ATP-γ-S 的反應時間節(jié)點（1、2、5、10、15、30、60 min），并用Western-Blot 來驗證梯度壓力對RsbT 蛋白激酶自磷酸化能力的抑制。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理與作圖采用Excel 2016 和Origin，成像圖片處理采用Adobe Photoshop，灰度分析采用ImageJ. JS 完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE 檢驗RsbT 蛋白激酶純化結(jié)果

不同超高壓條件下純化得到的RsbT 蛋白激酶見圖1，由圖1 可知68 kD 處為純化后RsbT 蛋白激酶，蛋白激酶純度高。經(jīng)檢測，純化后的RsbT蛋白激酶濃度為12 mg/mL。

圖1 RsbT 蛋白激酶純化結(jié)果Fig.1 Purification results of RsbT protein kinase

2.2 超高壓處理對RsbT 蛋白激酶空間結(jié)構(gòu)的影響

常見的超高壓處理壓力在100～600 MPa 之間，而由于設(shè)備維護、設(shè)備保養(yǎng)等條件限制最高處理壓力限制在550 MPa。根據(jù)前期報道，300 MPa壓力為殺死絕大多數(shù)革蘭氏陰性弧菌屬細菌的最佳條件[11-12]。故本實驗選擇選取100、300、500 MPa三個壓力點對RsbT 蛋白激酶進行超高壓處理。

在蛋白質(zhì)分子中，肽鏈可形成α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等特定的二級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的肽鍵在紫外185～240 nm 波段處有光吸收，因此蛋白質(zhì)在這一波長范圍內(nèi)有圓二色性，不同蛋白質(zhì)所表現(xiàn)的橢圓值波長的變化曲線（圓二色譜）不同。蛋白質(zhì)的圓二色譜是其含有所有二級結(jié)構(gòu)的圓二色譜的代數(shù)加和曲線，因此用紫外185～240 nm 波段的圓二色譜可研究蛋白質(zhì)中所有二級結(jié)構(gòu)的含量。圓二色譜可有效反應蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)變化，不同濃度的蛋白質(zhì)圓二色譜峰值也不同。

為較好觀察圓二色譜，需將橢圓值峰值控制在–20～0（10–3cm2/分克分子）范圍內(nèi)。圖1 為三種稀釋倍數(shù)的RsbT 蛋白激酶圓二色譜。三條曲線的波峰基本處在同一波長值，且在該稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)，波峰值與濃度成正相關(guān)。在195 nm 波長吸收段左右，RsbT 蛋白激酶的圓二色譜明顯超過儀器測量限制，為繪制三個壓力處理后的RsbT蛋白激酶圓二色譜提供一定的參考。

由圖2 得，壓力處理對RsbT 蛋白激酶空間結(jié)構(gòu)影響較大。從峰形變化來看，每個峰的形狀能夠反映相應波長下二級結(jié)構(gòu)種類。100 MPa 處理后的峰形與原始蛋白幾乎一樣，說明100 MPa 尚不能夠有效改變二級結(jié)構(gòu)，而300、500 Mpa 處理后的峰形與原始蛋白差別顯著，說明300 MPa 以上能夠有效使得RsbT 蛋白激酶二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。從峰值變化方面，峰值大小代表二級結(jié)構(gòu)的累加。相同濃度下，峰值大?。涸嫉鞍祝?00 MPa＞300 MPa＞500 MPa。表明壓力越大，RsbT蛋白激酶二級結(jié)構(gòu)破壞程度越大。經(jīng)500 MPa 處理的RsbT 蛋白激酶幾乎無圓二色譜吸收峰，表明500 MPa 處理幾乎破壞RsbT 蛋白激酶所有二級結(jié)構(gòu)。

圖2 RsbT 蛋白激酶三種稀釋倍數(shù)下的圓二色譜Fig.2 Circular dichroism of RsbT protein kinase in three dilutions

圖3 梯度壓力處理RsbT 蛋白激酶下的圓二色譜Fig.3 Circular dichroism of RsbT protein kinase under gradient pressure treatment

2.3 超高壓處理對RsbT 蛋白激酶自磷酸化的影響

蛋白激酶的磷酸化能力是判斷這種蛋白激酶的活性的直接參考依據(jù)。通過RsbT 蛋白激酶與ATP-γ-S 進行磷酸化反應，使用EDTA 控制反應時間，采用Western-Blot 進行蛋白印跡，并且用化學試劑進行化學發(fā)光檢測，研究RsbT 蛋白激酶自磷酸化程度影響。

圖4-A，RsbT 蛋白激酶利用ATP-γ-S 磷酸化反應0 min 與30 min 后，灰度峰面積排序均為Original＞100 MPa＞300 MPa＞500 MPa。對照組（以等量的雙蒸水代替ATP-γ-S）亮度與500 MPa 處理后亮度幾乎一致。進行灰度分析，獲得RsbT蛋白激酶利用ATP-γ-S 磷酸化反應0 min 與30 min后的灰度峰面積。

圖4-B，超高壓處理對RsbT 蛋白激酶自磷酸化能力存在影響，且壓力越大，RsbT 蛋白激酶磷酸化能力越弱。此外，在反應30 min 后的灰度峰面積中，100 MPa 與300 MPa 之間存在顯著下降，猜測100～300 MPa 范圍內(nèi)存在一個更小梯度壓力范圍能夠明顯抑制RsbT 蛋白激酶的活性，從而抑制弧菌屬細菌胞內(nèi)信息調(diào)控中心下游信號轉(zhuǎn)導。

圖4 梯度壓力處理RsbT 蛋白激酶免疫印跡30 min 灰度分析Fig.4 The grayscale analysis of 30mins western blotting images of RsbT protein kinase under gradient pressure treatment

為更加深入了解到100、300、500 MPa 三個壓力對RsbT 蛋白激酶磷酸化的影響程度，進行RsbT 蛋白激酶利用ATP-γ-S 磷酸化反應的時間（1、2、5、10、15、30、60 min）的磷酸化動力學研究。圖5 中，對比未經(jīng)處理（Original）與100 MPa 壓力處理后的免疫印跡電泳圖像，結(jié)合灰度分析發(fā)現(xiàn)100 MPa 處理后的蛋白表現(xiàn)出明顯的自磷酸化程度時間依賴性。其免疫印跡灰度峰面積略低于未經(jīng)處理的原始蛋白，說明100 MPa 能夠部分抑制RsbT 蛋白激酶磷酸化能力，但RsbT 蛋白激酶仍具有較好的自磷酸化活性。

圖5 梯度壓力處理RsbT 蛋白激酶免疫印跡灰度分析Fig.5 The grayscale analysis of western blotting images of RsbT protein kinase under gradient pressure treatment

對比未處理（Original）與300 MPa 壓力處理的圖像，300 MPa 處理后的蛋白也呈現(xiàn)一定磷酸化程度時間依賴性，但是其自磷酸化活性已經(jīng)基本消失。經(jīng)500 MPa 壓力處理后，RsbT 蛋白激酶利用ATP-γ-S 磷酸化反應后的化學發(fā)光程度低于軟件可識別閾值。綜上分析，300 MPa 以上壓力能夠使得RsbT 蛋白激酶完全失去自磷酸化活性，100 MPa 與300 MPa 之間應存在更小的壓力區(qū)間，使得RsbT 蛋白激酶失活。

3 結(jié)論

細菌的致病力與耐受環(huán)境條件的脅迫息息相關(guān)。致病性弧菌屬細菌受到外界脅迫后，壓力分子蛋白感應并通過可逆磷酸化的方式傳遞脅迫信號。以100、300、500 MPa 靜水壓分別對RsbT蛋白保壓5 min，可見超高壓對RsbT 蛋白激酶的空間結(jié)構(gòu)和自磷酸化能力均有顯著影響，且二級結(jié)構(gòu)破壞程度與自磷酸化能力降低程度相吻合。在空間結(jié)構(gòu)方面，壓力越大，RsbT 蛋白激酶二級結(jié)構(gòu)破壞程度越大。使用300 MPa 及以上壓力處理時，二級結(jié)構(gòu)完全被破壞。在自磷酸化方面，100 MPa 壓力能夠部分抑制RsbT 蛋白激酶磷酸化能力。300、500 MPa 壓力能夠使得RsbT 蛋白激酶完全喪失磷酸化能力。本研究可得出，300 MPa及以上靜水壓保壓時間5 min 處理RsbT 蛋白激酶，能夠完全破壞RsbT 蛋白激酶空間結(jié)構(gòu)，使之完全喪失自磷酸化活性，從而抑制弧菌屬細菌胞內(nèi)信息調(diào)控中心下游信號轉(zhuǎn)導。

隨著我國基礎(chǔ)建設(shè)的不斷發(fā)展，海鮮產(chǎn)品的銷售范圍擴大，其中食用貝類更是受到了沿海地區(qū)消費者的青睞。超高壓技術(shù)在我國水產(chǎn)品工業(yè)中高速發(fā)展，目前已應用于脫殼、殺菌等領(lǐng)域。但是目前我國超高壓殺菌技術(shù)，尤其是革蘭氏陰性菌方面的理論基礎(chǔ)相對薄弱，阻礙了這項技術(shù)在國內(nèi)的進一步發(fā)展。本實驗創(chuàng)新式地從結(jié)構(gòu)變化和自磷酸化效用兩個角度探究了超高壓對弧菌屬細菌信號傳遞中心RsbT 蛋白激酶的影響，并闡明了構(gòu)效關(guān)系。為進一步研究弧菌屬細菌相應超高壓脅迫的信息通路以及殺菌的有效壓力范圍提供理論依據(jù)。