李思思 宋佳鴻 何亞迎 黃 英

民航上海醫(yī)院消化內(nèi)科(200336)

背景：大量研究表明，環(huán)狀RNA(circRNA)異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等密切相關(guān)，是理想的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。但circRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚需進(jìn)一步探究。目的：探討circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá)及其對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。方法：以原位雜交法檢測circ-RANBP1在胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)。常規(guī)培養(yǎng)MIA PaCa-2細(xì)胞和SW 1990細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染circ-RANBP1敲低寡聚物和過表達(dá)質(zhì)粒，并設(shè)立相應(yīng)對照組。qRT-PCR法檢測circ-RANBP1在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。EdU實驗檢測circ-RANBP1對細(xì)胞增殖能力的影響。Transwell實驗檢測circ-RANBP1對細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光染色檢測circ-RANBP1對細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程的影響。血管形成實驗評估circ-RANBP1表達(dá)對血管形成能力的影響。結(jié)果：Circ-RANBP1在胰腺癌組織中表達(dá)增高，且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。Circ-RANBP1下調(diào)能抑制MIA PaCa-2細(xì)胞增殖，而circ-RANBP1過表達(dá)可促進(jìn)SW 1990細(xì)胞增殖。與對照組相比，敲低circ-RANBP1能抑制MIA PaCa-2細(xì)胞遷移和侵襲，而過表達(dá)circ-RANBP1可促進(jìn)SW 1990細(xì)胞遷移和侵襲。敲低circ-RANBP1可抑制EMT，過表達(dá)circ-RANBP1可促進(jìn)EMT。抑制circ-RANBP1表達(dá)可明顯降低血管形成能力，過表達(dá)則可明顯促進(jìn)血管形成。結(jié)論：Circ-RANBP1在胰腺癌組織中高表達(dá)，并可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、EMT和血管形成。

胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，預(yù)后極差，五年生存率僅為9%[1]。然而，胰腺癌發(fā)病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)胰腺癌患者發(fā)現(xiàn)即處于疾病晚期，失去手術(shù)治療的機(jī)會[2]。因此，尋找胰腺癌早期診斷和有效治療靶點(diǎn)仍是胰腺癌研究的重點(diǎn)。

環(huán)狀RNA(circRNA)是由RNA反向剪接形成的一種共價閉合環(huán)狀非編碼RNA，主要由外顯子和(或)內(nèi)含子構(gòu)成，廣泛存在于真核細(xì)胞中[3]。與傳統(tǒng)線性RNA不同，circRNA缺乏5’端帽結(jié)構(gòu)和3’端Ploy(A)尾結(jié)構(gòu)，因此能夠抵抗RNA核酸外切酶的降解，較線性RNA更穩(wěn)定[4]。同時，circRNA具有高度保守性和組織特異性，具備分子標(biāo)志物的潛能[5-7]。大量研究表明，circRNA異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等密切相關(guān)[8-11]，是理想的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。但circRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚需進(jìn)一步探究。本研究通過分析胰腺癌的circRNA GSE數(shù)據(jù)集(GSE69362、GSE79634)，篩選出在胰腺癌中高表達(dá)的hsa_circ_0092314(circ-RANBP1)，旨在探討其在胰腺癌組織中的表達(dá)及其對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等細(xì)胞生物學(xué)過程的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞株、組織芯片和主要試劑

人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3、CFPAC-1、HPDE6-C7、MIA PaCa-2、SW 1990、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胰腺癌組織芯片(TMA，含有30例胰腺癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織)購于上海芯超生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素均購自美國Gibco公司；circ-RANBP1過表達(dá)質(zhì)粒(circ)、circ-RANBP1敲低寡聚物(si-circ)均由廣州吉賽生物科技有限公司合成；EdU試劑盒購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；Trizol裂解液、逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；蛋白酶K、RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司?；|(zhì)膠購自美國BD公司。E-cadherin、N-cadherin一抗均購自Cell Signaling Technology, Inc.。

二、方法

1.原位雜交(ISH)染色：Circ-RANBP1探針由廣州吉賽生物科技有限公司合成。根據(jù)實驗步驟對組織芯片進(jìn)行染色，ISH染色鏡檢結(jié)果由兩位經(jīng)驗豐富的病理科專家進(jìn)行判定，并依據(jù)染色強(qiáng)度和染色范圍進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度：0分，無染色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色；染色范圍：0分，0%～10%；1分，11%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，76%～100%。總評分為染色強(qiáng)度與染色范圍之積，≤4分為circ-RANBP1低表達(dá)，>4分表示circ-RANBP1高表達(dá)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：MIA PaCa-2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，SW 1990細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件均為37 ℃、5% CO2。細(xì)胞生長至融合度為80%～90%時進(jìn)行消化傳代。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將MIA PaCa-2和SW 1990細(xì)胞分別接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為60%～70%時，應(yīng)用Lipofectamine 3000對MIA PaCa-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染circ-RANBP1敲低寡聚物及其對照物，對SW 1990細(xì)胞轉(zhuǎn)染circ-RANBP1過表達(dá)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒，組別依次命名為si-circ組、si-NC組、circ組、vector組。轉(zhuǎn)染6 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h后，用qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。實驗重復(fù)3次。

4.qRT-PCR法：加入Trizol試劑提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行實時熒光定量PCR。circ-RANBP1引物上游：5’-GCT GAT CTC TTC CCT GCT CA-3’，下游：5’-AGG CTC CGC AAC AAC TAA TG-3’；內(nèi)參GAPDH引物上游：5’-GGG AAG GTG AAG GTC GGA GT-3’， 下游：5’-GGG GTC ATT GAT GGC AAC A-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

5.EdU實驗：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集并將細(xì)胞接種于96孔板中，按照說明書步驟對細(xì)胞進(jìn)行EdU標(biāo)記、Apollo染色、DNA染色、圖像采集和分析。實驗重復(fù)3次。

6.Transwell實驗：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞并用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于Transwell上室中，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)16 h。輕輕擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，多聚甲醛固定，用0.1%結(jié)晶紫染色，隨后顯微鏡下拍照并采集圖像，隨機(jī)取5個視野統(tǒng)計遷移細(xì)胞數(shù)，取均值。實驗重復(fù)3次。

細(xì)胞侵襲實驗是在小室濾膜上包被基質(zhì)膠，其余步驟同上述細(xì)胞遷移實驗，顯微鏡下隨機(jī)取5個視野統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)，取均值。實驗重復(fù)3次。

7.蛋白質(zhì)印跡法：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后接種于6孔板中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后加入RIPA裂解液，提取各組細(xì)胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，E-cadherin、N-cadherin一抗工作濃度均為1∶1 000。以GAPDH作為內(nèi)參，ECL法顯影并保存圖像。實驗重復(fù)3次。

8.免疫熒光染色：采用4%的多聚甲醛溶液將已爬好細(xì)胞的玻片進(jìn)行固定，5%的BSA封閉1 h后加入一抗(E-cadherin、N-cadherin一抗工作濃度均為1∶100)，4 ℃孵育過夜。PBS漂洗后加入熒光二抗，室溫孵育1 h，PBS漂洗后加入DAPI染色液，顯微鏡下拍照并采集圖像。實驗重復(fù)3次。

9.血管形成實驗：將轉(zhuǎn)染48 h的HUVEC接種6孔板中，待貼壁后，PBS洗滌，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集上清液；提前將基質(zhì)膠鋪到預(yù)冷的96孔板中，每孔60 μL，37 ℃凝固30 min。將HUVEC消化離心后用預(yù)先收集的上清液重懸為 3×104/100 μL，每孔100 μL加入備用的96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)6 h。顯微鏡下隨機(jī)取5個視野計數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞成管數(shù)量。實驗重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、Circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

與癌旁正常組織相比，circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著升高(6.97±0.58對3.70±0.49)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.321，P<0.05；圖1A-1B)。根據(jù)circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá)，將胰腺癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，結(jié)果顯示circ-RANBP1表達(dá)與胰腺癌患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、N分期、神經(jīng)侵犯、血管侵犯等無關(guān)(P>0.05)，而與患者的T分期、M分期、AJCC分期密切相關(guān)(P<0.05；表1)。Kaplan-Meier生存分析顯示，高表達(dá)circ-RANBP1的胰腺癌患者生存期顯著低于低表達(dá)者(圖1C)。

表1 Circ-RANBP1表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系(n)

A-B：胰腺癌和相應(yīng)癌旁正常組織中circ-RANBP1表達(dá)(ISH染色)；C：Circ-RANBP1表達(dá)與胰腺癌患者生存期的關(guān)系(Kaplan-Meier生存分析)

二、Circ-RANBP1在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

與正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞相比，circ-RANBP1在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高(圖2A)。篩選出circ-RANBP1表達(dá)相對較高的MIA PaCa-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-circ-RANBP1，circ-RANBP1表達(dá)相對較低的SW 1990細(xì)胞轉(zhuǎn)染circ-RANBP1過表達(dá)質(zhì)粒。結(jié)果顯示，與對照組相比，si-circ-RANBP1可顯著降低circ-RANBP1表達(dá)(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)?？擅黠@提高circ-RANBP1表達(dá)(P<0.05;圖2B)。

A：circ-RANBP1在不同胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)；B：驗證circ-RANBP1的敲低和過表達(dá)效率

圖3 EdU實驗檢測circ-RANBP1對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

三、Circ-RANBP1對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

EdU實驗結(jié)果顯示，circ-RANBP1敲低后，MIA

四、Circ-RANBP1對胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，circ-RANBP1敲低組MIA PaCa-2細(xì)胞遷移數(shù)目顯著減少，而circ-RANBP1過表達(dá)組SW 1990細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多(P<0.05)；Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，circ-RANBP1敲低組MIA PaCa-2細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯少于對照組(P<0.05)，circ-RANBP1過表達(dá)組SW 1990細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著多于對照組(P<0.05；圖4)。表明circ-RANBP1可促進(jìn)細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

圖4 Transwell實驗驗證circ-RANBP1對胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

五、Circ-RANBP1對細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，circ-RANBP1敲低能促進(jìn)上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)，抑制間皮標(biāo)志物N-cadherin表達(dá)，而circ-RANBP1過表達(dá)能抑制E-cadherin表達(dá)，促進(jìn)N-cadherin表達(dá)(圖5A)；免疫熒光實驗進(jìn)一步證實了上述實驗結(jié)果(圖5B)。由此可見，circ-RANBP1能影響細(xì)胞的EMT。

A：蛋白質(zhì)印跡法；B：免疫熒光法

六、Circ-RANBP1對血管形成能力的影響

圖6 Circ-RANBP1表達(dá)對血管形成能力的影響

討 論

CircRNA是非編碼RNA家族重要成員，以往被認(rèn)為是RNA異常剪切產(chǎn)生的基因副產(chǎn)物，無細(xì)胞生物學(xué)功能[12-13]。近年，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展以及研究的深入，發(fā)現(xiàn)了越來越多的circRNA，且在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。研究顯示，多種circRNA在胰腺癌中異常表達(dá)，參與調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等細(xì)胞生物學(xué)行為[16-17]，并可作為胰腺癌的診斷和預(yù)后指標(biāo)[18]。因此，深入研究胰腺癌相關(guān)circRNA不僅能夠豐富和完善胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，而且可為尋找胰腺癌早期診斷和治療靶標(biāo)提供參考。

本研究選取了與胰腺癌相關(guān)的circ-RANBP1作為研究對象，旨在探討其對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其作為潛在診斷標(biāo)志物的潛能。結(jié)果顯示circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。進(jìn)一步分析顯示circ-RANBP1高表達(dá)與胰腺癌患者的TNM分期密切相關(guān)。Kaplan-Meier生存曲線分析表明，circ-RANBP1高表達(dá)與胰腺癌患者的生存期呈負(fù)相關(guān)。說明circ-RANBP1表達(dá)對評估胰腺癌患者的分期以及預(yù)后有重要參考價值。

本研究通過qRT-PCR法發(fā)現(xiàn)，circ-RANBP1在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高。為進(jìn)一步驗證circ-RANBP1對胰腺癌細(xì)胞功能的影響，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)或下調(diào)circ-RANBP1表達(dá)。結(jié)果顯示circ-RANBP1表達(dá)降低后，胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力降低；而circ-RANBP1過表達(dá)后，細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力明顯升高。進(jìn)一步提示circ-RANBP1可能是胰腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

EMT為腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟，即上皮細(xì)胞通過改變其形態(tài)、修飾黏附分子，獲得遷移和侵襲行為[19-21]。大量研究表明，circRNA可通過調(diào)節(jié)EMT來影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[22-24]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)circ-RANBP1表達(dá)可抑制EMT，而上調(diào)circ-RANBP1表達(dá)可促進(jìn)EMT。此外，實體腫瘤的增殖需要大量的新生血管為其快速增長提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)和氧供[25]。本研究中，circ-RANBP1能促進(jìn)血管形成，為其在胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

綜上所述，本研究證實了circ-RANBP1在胰腺癌組織中高表達(dá)，并能調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)EMT和血管形成，進(jìn)而發(fā)揮促癌作用。本研究結(jié)果有望為胰腺癌的診治提供更廣闊的前景。