抗菌肽的研究進(jìn)展

姜雯雯

近些年來(lái)，抗生素的廣泛使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)以及藥物殘留的問(wèn)題日益凸顯，而抗菌肽具有廣譜抗菌、無(wú)免疫原性、殺菌速度快等特點(diǎn)，可以作為一種新型抗菌藥物而具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。抗菌肽，又稱宿主防御肽，被認(rèn)為是先天免疫的重要組成部分，廣泛存在于真菌、細(xì)菌、動(dòng)物和植物中，不僅可以直接影響微生物，還可以提高淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞水平進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。自20世紀(jì)80年代Hultmark在惜古比天蠶中分離并命名為天蠶素以來(lái)，至今為止在細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、植物中已發(fā)現(xiàn)了2000多種具備抗菌活性的抗菌肽。

1 抗菌肽的分類

1.1 植物抗菌肽

最早在植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽是硫素（thionin），之后又從植物的花、葉、果中發(fā)現(xiàn)了其它類別的抗菌肽如：植物防御素（plant defensins）、橡膠蛋白、打結(jié)素類（knottin-like peptides）、酯轉(zhuǎn)移蛋白酶（lipid trans?fer proteins）、蛻皮素（snakins）和環(huán)肽類（Cyclotides）等[2]。其中，硫素、酯轉(zhuǎn)移蛋白酶、植物防御素在植物抗病工程中得以應(yīng)用，部分植物抗菌肽和特性見表1。在應(yīng)用方面，國(guó)內(nèi)開發(fā)了一些可以表達(dá)不同含量植物抗菌肽的轉(zhuǎn)基因植物，對(duì)植物疾病有著不同抗性，可以用作保護(hù)植物的一種方式，但植物抗菌肽生產(chǎn)成本高等技術(shù)問(wèn)題尚未能解決，所以無(wú)法用于商業(yè)化量產(chǎn)。植物抗菌肽在畜牧領(lǐng)域可以作為飼料改善牲畜胃腸道功能，在食品領(lǐng)域可以作為天然防腐劑。

表1 植物抗菌肽的特點(diǎn)及分布

1.2 昆蟲抗菌肽

昆蟲類抗菌肽提取自昆蟲，現(xiàn)今已有200多種抗菌肽在昆蟲體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)常見的如蜜蜂、甲蟲、天蠶、果蠅等。它的產(chǎn)生是由于昆蟲受到感染或刺激時(shí)由昆蟲血淋巴產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì)，具有抗菌廣、不破壞正常細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，此類抗菌肽在完全變態(tài)和不完全變態(tài)昆蟲體內(nèi)的產(chǎn)生方式不同，在前者體內(nèi)是由上皮細(xì)胞和脂肪體迅速合成然后釋放到血淋巴中，在后者體內(nèi)是先在健康昆蟲體內(nèi)血細(xì)胞中合成，受到感染或刺激后才釋放到血淋巴中。根據(jù)這些多肽的抗菌功能和氨基酸排列順序主要分為五類：富含甘氨酸的抗菌肽、富含脯氨酸的抗菌肽、昆蟲防御素、天蠶素類抗菌肽（見表2）。

表2 部分昆蟲抗菌肽來(lái)源和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

昆蟲抗菌肽在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品貯藏等方面都有研究，目前昆蟲抗菌肽中的尼生素是唯一一個(gè)被批準(zhǔn)運(yùn)用于食品防腐的抗菌肽[3]。昆蟲的免疫機(jī)制在某些方面與人類免疫機(jī)制相似，進(jìn)一步了解昆蟲的免疫機(jī)制為炎癥性、感染性疾病的預(yù)防和治療提供參考[4]。

1.3 哺乳動(dòng)物抗菌肽

哺乳動(dòng)物抗菌肽主要存在于哺乳動(dòng)物的白細(xì)胞、皮膚和黏膜的上皮細(xì)胞中。此類抗菌肽研究最多的是防御素類抗菌肽，哺乳動(dòng)物防御素(defensins)有α- defensins 和β- defensins 兩種類型。Defensins能夠迅速的作用于病毒和細(xì)菌的細(xì)胞膜，通過(guò)穿膜機(jī)制起到抗菌、抗病毒的作用，而且還能參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，例如富集炎性細(xì)胞和促進(jìn)炎性因子產(chǎn)生等作用。自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已從豬、兔、牛、馬均提取出了高活性的抗菌肽，如1980年Leherer從兔肺的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種富含半胱氨酸Cys 殘基的防御素；1989年Lee 從豬小腸中分離提取出抗菌肽cecropin P1；1991年Diamond G從牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了TAP。目前，在人體內(nèi)只發(fā)現(xiàn)了一種名為L(zhǎng)L-37的cathelicidin內(nèi)源性抗菌多肽，分子量為18ku，含37個(gè)氨基酸，不僅能夠參與免疫反應(yīng)，還能幫助血管生成和促進(jìn)傷口愈合[5]。

表3 魚類和兩棲動(dòng)物類抗菌肽功能比較

1.4 魚類和兩棲動(dòng)物類抗菌肽

目前已報(bào)道的魚類抗菌肽大多存在于表皮黏液中，還有部分存在于其他組織器官中，如鐵調(diào)素（hep?cidins）、內(nèi)源性抗菌肽（cathelicidins）、肝表達(dá)抗菌肽2 抗體（LAEP-2）等，研究表明魚類抗菌肽具有一些獨(dú)特屬性，如在較高鹽濃度下仍具有生物活性。魚類抗菌肽目前已從各種魚類動(dòng)物（虹鱒、河鱒、大鱗大馬哈魚等）中提取出來(lái)。兩棲動(dòng)物種類繁多，在中國(guó)大陸的兩棲動(dòng)物約2/3的兩棲動(dòng)物是中國(guó)特有種，且同一物種皮膚分泌物的種類也有所不同，如抗菌肽、抗癌肽、速激肽、緩激肽促胰島素釋放肽等等一系列生物活性肽。最具有代表性的兩棲動(dòng)物要屬蛙類，蛙類的皮膚為它們的生長(zhǎng)發(fā)育提供了先天條件。由于蛙類皮膚濕潤(rùn)而且暴露于空氣中，正好適宜病原體生長(zhǎng)繁殖，為抵抗這些病原體的侵害，表皮腺體會(huì)分泌一系列抗菌肽。蛙類抗菌肽在抗腫瘤、抗病毒活性方面均有研究，例如從中國(guó)大蹼鈴蟾皮膚提取的Maximin 3 抗菌肽能夠抑制HIV 感染T 細(xì)胞，從歐洲林蛙皮膚分泌物提取出的Temporin L 能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。

1.5 細(xì)菌抗菌肽

細(xì)菌抗菌肽根據(jù)其合成途徑可分為兩種：一種是核糖體合成抗菌肽；另一種是非核糖體合成抗菌肽，即通過(guò)非核糖體多肽合成酶基因控制來(lái)合成，統(tǒng)稱為抗菌脂肽[6]。目前在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽有：乳酸球菌素（Nisin）、多粘菌素E（PolymyxinE）、桿菌肽（Bacitracin）、短桿菌肽S（GramicidinS）等，其中，乳酸球菌素（Nisin）研究最多，由乳酸菌產(chǎn)生，僅限于對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌起作用，而對(duì)革蘭氏陰性菌無(wú)效。還有乳酸菌產(chǎn)生的乳鏈球菌素lacticin 3147，被用于食品保藏。細(xì)菌抗菌肽與來(lái)自動(dòng)物的抗菌肽有所不同，細(xì)菌抗菌肽具有一定的毒性，而且效力比較高，在納摩爾濃度可抑制細(xì)菌甚至殺死細(xì)菌，這也是它們能占據(jù)生態(tài)位的一個(gè)重要原因。

2 抗菌肽的應(yīng)用

如今，抗菌藥物的種類越來(lái)越多，細(xì)菌的耐藥性也隨之加強(qiáng)，抗菌肽的發(fā)現(xiàn)使得這個(gè)局面變得好轉(zhuǎn)?？咕牟粌H能抗菌，而且還能抗病毒、抗腫瘤。目前已知的抗菌肽多達(dá)2500 余種，部分抗菌肽在臨床研究表現(xiàn)出功效良好且具有低副作用的特點(diǎn)，如抗菌肽MU1140和菌絲霉素等，還有部分抗菌肽已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)[7]。此外，抗菌肽還可以運(yùn)用在食品保鮮方面和畜牧養(yǎng)殖方面。

2.1 食品保鮮中的應(yīng)用

食品加工中難免會(huì)加入化學(xué)防腐劑以確保食品新鮮，但化學(xué)防腐劑不易被人體吸收且加熱后容易變性，對(duì)人體有一定危害?？咕倪M(jìn)入人體后可以被蛋白酶水解，而且食品加熱也不容易使抗菌肽變性[8]。有實(shí)踐證明在動(dòng)物日糧中添加抗菌肽后，不僅可以改善其腸道功能，而且還能提高動(dòng)物抵抗力，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能也有利，國(guó)內(nèi)外許多企業(yè)已經(jīng)研發(fā)成功[9]。有研究表明，鮮牛乳中加入乳酸菌素后不僅可以延長(zhǎng)貨架期還可以保留原有風(fēng)味，再結(jié)合巴氏滅菌，保留時(shí)間將更長(zhǎng)。將某些抗菌肽如：細(xì)菌素、尼生素、植物防御素等添加到食品包裝上可以達(dá)到保鮮、防腐效果。

2.2 畜牧養(yǎng)殖中的應(yīng)用

在畜牧養(yǎng)殖中，傳統(tǒng)方法是在飼料中添加抗生素，容易破壞腸道微生物并且容易殘留，嚴(yán)重影響人的身體健康和產(chǎn)品質(zhì)量[10]。隨著對(duì)抗菌肽了解更加深入，眾多研究表明抗菌肽添加到飼料中可以增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，降低患病率，提高生產(chǎn)質(zhì)量。李生濤[11]在喂養(yǎng)母豬的飼料中加入抗菌肽，降低了弱仔率而且還減少了母豬流產(chǎn)；覃志彪[12]等人在蝦苗的基礎(chǔ)餌料中加入抗菌肽，通過(guò)五組不同濃度的實(shí)驗(yàn)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)蝦的體長(zhǎng)增長(zhǎng)率、成活率、增重率有提高。

3 抗菌肽制備方法

國(guó)內(nèi)外制備食源性肽的方法主要有酶解法、化學(xué)合成法、基因工程法及微生物發(fā)酵法等。多種方法的組合或者單獨(dú)使用都廣泛地應(yīng)用于生物活性肽的分離制備中，不同方法適合不同目的，各有其優(yōu)缺點(diǎn)?；蚬こ屉m然成本低還能大量獲取抗菌肽，但得到的抗菌肽抑菌活性會(huì)比天然抗菌肽低[13]；除化學(xué)合成和基因工程，其它方法均需要大量原材料，需要從生物中提取，利用微生物蛋白酶反應(yīng)發(fā)酵是用來(lái)產(chǎn)生生物活性肽和食源性蛋白質(zhì)的一種有效方法。某些特定的菌類群，能夠化合生物體的蛋白質(zhì)以及氮元素，提取出的酶化物以及維生素等物質(zhì)可以直接抑制病原菌，降解難分解的物質(zhì)，極易被植物體吸收，增強(qiáng)其防病害的功能。目前國(guó)內(nèi)外研究較多的為乳蛋白與大豆蛋白，可從中分離出多種活性多肽[14]，張志焱[15]等對(duì)一株產(chǎn)抗菌肽枯草芽孢桿菌BL0006的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高發(fā)酵液中抗菌肽的效價(jià)。

酶水解法是產(chǎn)生活性肽的主要方式，具有較低成本、反應(yīng)極易控制、不易出現(xiàn)意外以及能夠定位生產(chǎn)等諸多相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)，可以很好地滿足產(chǎn)品需求。酶水解法最重要的則是蛋白酶的選用，需要定點(diǎn)酶切，還要符合食品安全。一些常見的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶等既能單獨(dú)使用，又可以組合產(chǎn)生更多穩(wěn)定、高效的生物活性肽。如Pellegrini等[16]使用胰蛋白酶水解牛乳β-乳球蛋白，獲得四種具有抑菌活性的肽段。顧晨濤[17]等用胃蛋白酶解等工藝得到具有較強(qiáng)抑菌活性的鯽魚魚鱗抗菌多肽，Zeineb等[18]利用駝乳蛋白酶水解產(chǎn)物進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明駱駝初乳的抗菌活性高于牛乳，且經(jīng)過(guò)與未處理原乳的對(duì)比實(shí)驗(yàn)得出蛋白酶解后釋放出更多具有抗菌活性的肽。劉云姣[19]等人通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化南極磷蝦蛋白酶解工藝研究表明：胰蛋白酶為最適蛋白酶，最佳條件是在44.48℃溫度下，PH為7.88，酶解時(shí)間8.52h，這項(xiàng)研究的結(jié)果帶來(lái)了很好的啟示——可以從南極磷蝦中提取抗菌肽且資源豐富。

4 展望

無(wú)論是原核生物還是真核生物，體內(nèi)多多少少存在具有防御作用的抗菌肽，它們抗病毒、細(xì)菌、真菌且不易引起微生物耐受的特點(diǎn)引起了廣大科學(xué)家的注意，也因此有了很廣闊的應(yīng)用前景?？咕碾m然可以借助基因重組技術(shù)或化學(xué)合成的方法來(lái)降低成本，但對(duì)其生產(chǎn)出的抗菌肽作用穩(wěn)定性、藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)以及毒副作用還未能清楚[20]。且應(yīng)用于牲畜的食品添加劑以及美容業(yè)的抗菌肽生產(chǎn)成本高、對(duì)真核細(xì)胞的毒性作用、體內(nèi)代謝過(guò)程、體內(nèi)代謝對(duì)機(jī)體的影響等問(wèn)題都亟待需相應(yīng)方法來(lái)解決，就生產(chǎn)成本而言，目前大多是應(yīng)用基因工程來(lái)提高生產(chǎn)率從而降低生產(chǎn)成本，還可在分離純化環(huán)節(jié)入手來(lái)提高生產(chǎn)效率?？傊?，在科學(xué)的前進(jìn)道路上，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題進(jìn)而解決問(wèn)題，將現(xiàn)存問(wèn)題解決之后，方能造福人類。