調(diào)節(jié)性B細胞在接受脫敏治療過敏性哮喘患兒中的變化及意義

馬卓婭，鄭躍杰，王國兵，王承倩

過敏原特異性免疫治療(allergen-specific Immunotherapy，AIT)是目前世界變態(tài)反應組織(World Allergy Organization,WAO)推薦的唯一可以針對過敏病因的治療方法，主要有舌下免疫治療(sublingual immunotherapy，SLIT)和皮下注射免疫治療(subcutaneous immunotherapy，SCIT)給藥途徑。SCIT是給患者重復皮下注射劑量不斷增加的過敏原，逐漸增加至較高劑量，使患者對這一過敏原耐受，最終達到改善癥狀。盡管對該治療有豐富的使用經(jīng)驗，但其臨床改善的機制仍不是很清楚。目前多認為，多種細胞及相關(guān)因子在治療過程中參與了過敏原特異性免疫耐受的建立[1]。Breg是具有負向免疫調(diào)節(jié)作用B淋巴細胞，其免疫調(diào)節(jié)作用主要通過產(chǎn)生IL-10、TGF-β、IL-35等細胞因子、細胞間接觸機制等實現(xiàn)[2]。并且在哮喘等過敏性疾病中發(fā)揮作用?；诖?，本研究對接受螨蟲SCIT治療的過敏性哮喘患兒外周血Breg細胞及相關(guān)細胞因子進行了檢測，分析其在SCIT過程中可能發(fā)揮的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年5月至2019年8月深圳兒童醫(yī)院呼吸?？凭驮\的20例螨蟲過敏哮喘患兒，給予SCIT。SCIT治療藥物為螨變應原注射液(阿羅格，默克雪蘭諾公司，德國)和屋塵螨變應原制劑(安脫達，ALK-Abello公司，丹麥)。男15 例,女 5 例,年齡5～13歲[(8. 8±2. 3)歲]。過敏性哮喘診斷標準參照中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組制訂的診斷標準及2018年全球哮喘防治創(chuàng)議(Global Initiative for Asthma,GINA)[3-4]；外周血過敏原d1戶塵螨和/或 d2粉塵螨特異性IgE(special IgE, sIgE)陽性且≥2級(sIgE≥0.70 kIU/L);所有受試者監(jiān)護人和或受試者均表示對實驗方案知情并簽署知情同意書，深圳市兒童醫(yī)院學術(shù)倫理委員會已通過該實驗方案。

1.2 螨蟲過敏原特異性IgE檢測

所有患兒均采用UniCAP1000全自動過敏原定量檢測系統(tǒng)(法瑪西亞，瑞典)，采用酶聯(lián)免疫熒光法檢測外周血d1戶塵螨、d2粉塵螨sIgE；部分患兒檢測mx2霉菌組(青霉、牙枝霉、薰曲霉、假絲霉、鏈格孢霉、鹽球菌霉)、ex1動物皮毛組(貓狗上皮及皮屑、牛皮屑、馬皮屑)、i6蟑螂等IgE。

1.3 采集外周血及樣品初處理

所有入組患者在SCIT治療開始前和SCIT劑量遞增階段(4～6個月)完成后分別采集外周血 3 mL，肝素抗凝，迅速送檢。 取2 ml肝素抗凝的外周血，500g離心5 min分離血漿備用。

1.4 分離CD4+T、CD19+B淋巴細胞

取無菌抗凝靜脈血0.5 mL，聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(P=1.077)密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)。分別采用單克隆抗體CD4抗體、CD19抗體包被的磁珠(美國LifeTec公司, 113.31D和111.43D)分離CD4+T、CD19+B淋巴細胞。

1.5 流式細胞術(shù)分析Breg和Treg、Th1，Th2和Th17

使用全血直接計數(shù)方法，用CD19-eFluro450(eBioscience，美國)標記Breg，以CD24-FITC、CD27-APC、CD80-PE、CD86-PE、CD1d-PE-Cyanine7 (eBioscience，美國)染色30 min。檢測并分析CD19+CD24highCD27+Breg的比例以及CD80、CD86、CD1d的平均熒光強度。另取部分全血，用CD4-eFluor450封閉，固定并破膜1 h，并用CD25-APC、Foxp3-PE (eBioscience，美國)染色30 min，檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。取部分步驟1.4中分離的PBMC，接種于RPMI 1640細胞培養(yǎng)液(Corning，美國)，加入PMA、離子霉素、莫能菌素(SigmaAldrich，美國)，至終濃度分別為300 ng/mL，1μg/mL，2 μmol/ L。于37 ℃，CO2濃度為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。經(jīng)固定、破膜、封閉，并用CD4-eFluor450，IL-4 PE，IFN-γ APC和IL-17A PE-Cyanine7 (eBioscience，美國)染色30 min。流式細胞儀BD FACS CantoII(Becton，Dickinson and Company，美國)分析上述樣品中 CD4+Th1、Th2和Th17細胞的比例。所有數(shù)據(jù)均通過流式細胞儀BD FACS CantoII分析軟件DivaVer6.1.3獲得，并轉(zhuǎn)移至Flowjo V10軟件進行分析。分析時先用CD19-eFluro450設(shè)門，檢測并分析CD19+CD24highCD27+Breg的比例以及表面CD80、CD86、CD1d的平均熒光強度。另用CD4-eFluor450設(shè)門，檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。最后用CD4-eFluor450設(shè)門，分析CD4+Th1，Th2和Th17細胞的比例。

1.6 實時定量RT-PCR測定Breg及T淋巴細胞相關(guān)細胞因子

分離總RNA:取步驟1.4已分離外周血CD4+T、CD19+B淋巴細胞，按試劑盒說明書(美國Ambion公司，AM1912)步驟分離總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量及純度。

RT-PCR: 總RNA為模板通過RT-PCR，測定IL-10、TGF-β、IFNG、T-bet、IL-4、GATA3、IL-17A、RORγt、Foxp3 核酸含量。引物序列及詳細步驟參考本課題組前期實驗[5]。

相對定量分析：使用LightCycler 480II real-time PCR儀(羅氏，瑞士)檢測，并應用 LCS 1.5 軟件分析，進行相對定量分析。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-10和TGF-β

取步驟1.3分離的備用血漿, ELISA方法檢測外周血漿中IL-10和TGF-β濃度。具體操作參照試劑盒說明書(eBioscience，美國,IL-10,BMS215 INST，TGF-β,BMS249-4)。IL-10檢測敏感度為0.66 pg/mL, TGF-β檢測敏感度為8.60 pg/mL。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 入組患者過敏原檢測結(jié)果

20例患兒d1戶塵螨、d2粉塵螨sIgE均為陽性且≥2級(sIgE≥0.70 kIU/L)，部分患兒根據(jù)病史等情況，檢測其他過敏原(表1)。

表1 AIT治療哮喘患兒過敏原檢測結(jié)果Table 1 Results of allergen in patients with allergicasthma underging AIT

2:2 SCIT劑量遞增階段前后Breg 及 CD80、CD86、CD1d變化

在SCIT劑量遞增階段結(jié)束后，患兒外周血CD19+CD24highCD27+Breg占CD19+B細胞比例較治療前明顯增加(P<0.05)；CD80、CD86、CD1d與治療前比較無顯著改變(P>0.05)(表2，圖1A)。

表2 SCIT劑量遞增階段前后Breg及CD80、CD86、CD1d表達Table 2 Changes of proportion of Breg and the expression of CD80, CD86, and CD1d before and after build-up

2.3 SCIT劑量遞增階段前后Th1、Th2、Th17和Treg變化

SCIT劑量遞增階段結(jié)束后，患兒外周血中Th1、Th2、Th17和Treg細胞比例較SCIT治療前無明顯變化(P>0.05)(表3，圖1B、C)。

圖1 流式細胞術(shù)檢測1例患兒Breg、CD80、CD86、CD1d、Th1、Th2、Th17和Treg的變化

表3 SCIT劑量遞增階段前后Th1、Th2、Th17及Treg變化Table 3 Changes of proportion of Th1, Th2, and Th17 before and after build-up phase of %)

2.4 SCIT劑量遞增階段前后CD4+T、Breg細胞相關(guān)細胞分子mRNA水平變化

SCIT劑量遞增階段結(jié)束后，患兒外周血轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγt mRNA較SCIT治療前明顯下降，IL-10 mRNA則顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，IL-4、IL-17A和Foxp3 mRNA變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TGF-β mRNA雖有升高趨勢，但變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 SCIT劑量遞增階段前后CD4+T、Breg淋巴細胞相關(guān)細胞因子mRNA表達

2.5 SCIT劑量遞增階段前后外周血IL-10和TGF-β蛋白水平變化

SCIT劑量遞增階段結(jié)束后，患兒外周血漿IL-10和TGF-β蛋白水平均較SCIT治療前明顯增高(P<0.05)(圖3)。

圖3 SCIT劑量遞增階段前后外周血IL-10、TGF-β蛋白表達

3 討論

哮喘是嚴重危害人類健康的常見呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率逐年增高。目前全球約有3億多人受到哮喘的困擾。我國兒童哮喘流行病學調(diào)查顯示兒童哮喘患病率從1990年的1.09%上升到2010年的3.0% 以上[3]，其中過敏性哮喘占兒童哮喘的 80%以上[6]。

“四位一體”治療方案是WAO推薦的過敏性疾病的治療方案。包括環(huán)境控制、對癥治療、AIT以及患者教育。AIT是通過給予患者劑量逐漸增加的過敏原而使患者達到對過敏原耐受的治療方法。至今已經(jīng)有近100年的歷史，是目前GINA推薦的唯一可能改變過敏性疾病自然進程的對因治療。尤其是關(guān)于SCIT研究較多，但其發(fā)揮治療作用的機制尚不是十分清楚。

Breg 是一組有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞群，主要通過分泌具有免疫抑制作用的可溶性細胞因子及通過細胞表面細胞因子參與建立免疫耐受，在免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。根據(jù)Breg 表面分子及其分泌的細胞因子將Breg分為不同的細胞亞型，在人類主要的亞型有[8-9]:(1)記憶 Breg(memory Breg)，CD19+CD24highCD27+IL-10+Breg，以 CD27 為免疫細胞標志，通過產(chǎn)生 IL-10，強有力地抑制細胞毒性T淋巴細胞以及單核細胞功能;(2)漿細胞性 Breg(plasma Breg)，CD19+CD24highCD38highCD138+IgM+Breg，以 CD138、IgM 為標志，產(chǎn)生過敏原特異性IgG和免疫抑制細胞因子，抑制樹突狀細胞和效應T細胞;(3)過渡性B細胞，表達CD19+CD24highCD38high，可抑制 Th1、Th17，誘導Tregs;(4)Br3，產(chǎn)生TGF-β;(5)殺傷性Breg(killer Bregs)，CD19+CD5+CD24highCD38highCD178+，可通過 Fas(表達于細胞表面的一種細胞因子，受體與Fas結(jié)合后啟動死亡信號轉(zhuǎn)導)誘導T細胞的凋亡。根據(jù)Breg分泌細胞因子也可分為產(chǎn)IL-10 Breg、產(chǎn)TGF-β Breg、產(chǎn)IL-35 Breg 等。研究發(fā)現(xiàn) Bregs 在過敏性哮喘、過敏性鼻炎等過敏性疾病患者外周血中數(shù)量減少和功能受損[10-11]。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)兒童哮喘急性期 CD19+CD24highCD27+Breg比例降低、分泌IL-10功能減弱，同時細胞表面分子 CD80、CD86 表達下調(diào)，提示急性期哮喘患兒存在Breg數(shù)量減少及可能的功能異常[5]。

在AIT過程中，有研究報道患者外周血Breg數(shù)量及功能均有不同程度的恢復。Breg主要通過IL-10抑制效應T細胞的功能、抑制樹突狀細胞成熟、誘導Treg分化和特異性IgG4產(chǎn)生進而參與AIT耐受的誘導。除此之外，Breg還能分泌多種可溶性分子，如抗炎細胞因子IL-1β、IL-35、IL-21和TGF-β，這些分子與相鄰免疫細胞的細胞表面受體結(jié)合，觸發(fā)細胞內(nèi)部信號級聯(lián)反應，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯，間接調(diào)節(jié)免疫細胞的活性[12,8]。Boonpiyathad等[13]發(fā)現(xiàn)在接受AIT治療的25例過敏性哮喘成人患者中，治療2年后應答者外周血產(chǎn)生IL-10 Breg細胞的數(shù)量高于未應答者。Boonpiyathad等[14]還比較了14例接受蜂毒免疫療法(venom Immunotherapy，VIT)的蜂毒過敏患者的外周血Breg，發(fā)現(xiàn)VIT治療3～4個月后產(chǎn)IL-10 特異性Breg(CD73-CD25+CD71+Br1)數(shù)量升高2～5倍。

本研究方案采用的SCIT總療程為3～5年，分為劑量遞增階段和劑量維持階段，劑量遞增階段時間為4～6個月左右。對接受SCIT治療的患兒進行治療前與劑量遞增階段完成后Breg數(shù)量及CD4+T淋巴細胞不同細胞亞群(Th1、Th2、Th17、Treg)數(shù)量、相關(guān)細胞因子表達變化進行研究。發(fā)現(xiàn)與SCIT治療前相比，劑量遞增階段結(jié)束時CD19+CD24highCD27+Breg比例、CD19+B細胞中IL-10 mRNA表達水平、外周血IL-10蛋白表達水平均有明顯的升高；TGF-β mRNA表達雖有升高，但未見統(tǒng)計學意義。提示IL-10可能在SCIT劑量遞增階段免疫耐受的建立中發(fā)揮重要作用，TGF-β并不是最主要調(diào)控因子。

IL-10、TGF-β是Bregs主要的分泌因子，在過敏性炎癥的免疫耐受過程中，Breg產(chǎn)生TGF-β、IL-10，后者進一步作用于Tregs，增強Treg應答，抑制效應T細胞Th1、Th2、Th17的活化，抑制慢性炎癥，這一過程以IL-10依賴的方式進行[2]。細胞因子IL-10是調(diào)節(jié)免疫反應和防止過度炎癥的關(guān)鍵因素，Breg產(chǎn)生的IL-10對不同類型的細胞均具有廣泛的抑制作用。Breg依靠IL-10抑制Th1、Th2細胞的分化和產(chǎn)生，下調(diào)Th1細胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ細胞因子，下調(diào)Th2細胞分泌功能，抑制樹突狀細胞和巨噬細胞的活性，促進T細胞的凋亡。Breg也通過IL-10，聯(lián)合TGF-β、IL-35促進Th0細胞向Foxp3+Treg轉(zhuǎn)化，并促進其表面CTLA-4的表達，引起免疫耐受。

本研究real-time PCR發(fā)現(xiàn)Th1相關(guān)的細胞因子T-bet mRNA， Th2相關(guān)細胞因子GATA3 mRNA、Th17 相關(guān)細胞因子RORγt mRNA在SCIT劑量遞增階段結(jié)束后表達下調(diào)，提示在SCIT劑量遞增階段Breg可能參與下調(diào)Th1、Th2及Th17的分泌功能。但Treg相關(guān)的Foxp3+mRNA的表達變化沒有統(tǒng)計學意義，同時FACS檢測的Treg比例也沒有明顯變化。這些結(jié)果也提示，在SCIT劑量遞增階段Treg可能在螨蟲特異性免疫耐受建立階段并沒有發(fā)揮主要作用。

雖然有研究發(fā)現(xiàn)在AIT免疫耐受建立過程中Treg發(fā)揮主要作用，但最近的研究提示AIT早期CD25+Foxp3+Treg的變化并不明顯，提示在AIT早期Treg并沒有發(fā)揮主要的免疫調(diào)節(jié)作用[15-17]。Zissler等[18]發(fā)現(xiàn)劑量遞增階段效應Th1、Th17細胞和CCR6+IL-17+Foxp3+Treg細胞減少，Th2細胞增加；治療3年后劑量維持階段Treg增加，而Th2和Th17應答減少。Xian等[15]研究67例塵螨過敏鼻炎伴或不伴哮喘的患者，接受螨蟲特異性免疫治療半年時，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg升高不明顯，而在治療1年后明顯升高。另外一些研究則得出了相反的結(jié)果。Moed等[16]研究了53例過敏性鼻炎兒童臨床及免疫性指標，發(fā)現(xiàn)AIT治療2年后過敏癥狀有所減輕，但未觀察到IL-4、IL-5和IL-13以及調(diào)節(jié)性細胞CD4+CD25+Foxp3+Treg變化。因此關(guān)于效應T細胞及Treg在AIT治療中發(fā)揮的作用仍存在爭議。

Bregs除了通過分泌細胞因子(IL-10、TGF-β、IL-35等)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)，還通過細胞之間接觸機制(CD80、CD86、CD1d)等實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)[2]。本研究顯示，在SCIT劑量遞增階段，Breg相關(guān)表面因子(CD80、CD86、CD1d)并未出現(xiàn)明顯的改變，提示在SCIT早期，細胞間的接觸機制可能并不是Breg細胞發(fā)揮作用的主要方式。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)螨蟲過敏哮喘患兒接受SCIT時，在劑量遞增階段是以Breg數(shù)量升高及IL-10介導的免疫調(diào)節(jié)為主，Treg、TGF-β及細胞間接觸抑制在此階段可能并未發(fā)揮關(guān)鍵作用。但本研究存在一定局限，如納入的研究樣本量較少；僅對AIT劑量遞增階段的Breg等進行了相關(guān)研究，未將AIT臨床療效進行相關(guān)分析、未能設(shè)計非免疫治療組患者進行對照研究等。

致謝：感謝深圳市兒童醫(yī)院肺功能室劉萍副主任護師對本項目的支持。