施肥模式對(duì)青稞田土壤潛在固氮速率和自生固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的影響*

馬瑞萍,戴相林,劉國(guó)一,謝永春,高小麗,高 雪

氮是構(gòu)成生命體(如蛋白質(zhì)和核酸)必不可少的元素,也是陸地生態(tài)系統(tǒng)中限制植物生長(zhǎng)和初級(jí)生產(chǎn)的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)元素[1]。自Berthelot發(fā)現(xiàn)微生物能夠固定大氣中的氮素以彌補(bǔ)土壤氮損失以來(lái),人們對(duì)生物固氮的研究已經(jīng)超過(guò)了130年[2]。生物固氮是陸地生態(tài)系統(tǒng)中“新”氮的重要來(lái)源,主要通過(guò)共生固氮和自生固氮兩種途徑發(fā)生[3]。相對(duì)于共生固氮,自生固氮雖然速率低,但時(shí)空分布廣泛,在缺乏固氮植物或氮匱乏的土壤生態(tài)系統(tǒng)中,自生固氮量約為每年0～60 kg(N)·hm-2,被認(rèn)為是氮素輸入的重要來(lái)源[3-6]。因此,自生固氮作為一種環(huán)境友好型和可持續(xù)性的氮素供應(yīng)方式,可替代部分無(wú)機(jī)氮肥,為解決集約化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中過(guò)量施氮導(dǎo)致的能源消耗和生態(tài)環(huán)境污染問(wèn)題提供了替代方案。

固氮微生物是執(zhí)行生物固氮的主要成員。系統(tǒng)發(fā)育和代謝途徑(自養(yǎng)型、異養(yǎng)型、無(wú)機(jī)化能營(yíng)養(yǎng)型、光合異養(yǎng)型和產(chǎn)甲烷型)的高度多樣性[3,7],使固氮微生物在陸地及水生生態(tài)系統(tǒng)均有廣泛分布[8],且易受作物類型、土壤理化性質(zhì)、時(shí)空分布和氣候因子等多重因素的影響[9]。施肥是實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)和維持土壤肥力的重要農(nóng)藝措施。但前人研究表明,固氮微生物豐度、多樣性、活性和群落組成對(duì)不同施肥模式的響應(yīng)并不完全一致。如施用化肥,尤其是氮肥會(huì)降低固氮微生物豐度、多樣性和活性[10-11],而施用有機(jī)肥則通常呈相反趨勢(shì)[12]。這可能是由于外源有機(jī)物的添加為固氮微生物的生長(zhǎng)提供了碳源和能源,進(jìn)而刺激了微生物的固氮作用[13]。但也有研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期增施有機(jī)肥(豬糞、秸稈或綠肥)會(huì)降低固氮微生物豐度、群落多樣性[14-17]或活性[18],且不同有機(jī)物料對(duì)固氮微生物的影響效果也存在差異。如Liao等[19]研究發(fā)現(xiàn),相比于氮磷鉀配施秸稈而言,氮磷鉀配施雞糞能夠顯著提高固氮速率。固氮微生物對(duì)施肥的不同響應(yīng),可能是由于有機(jī)物料碳源質(zhì)量[20]或施肥引起的土壤理化性質(zhì)變化所致,如pH[21]、土壤有機(jī)碳[22]和氮、磷養(yǎng)分有效性[11,23]等。另外,固氮微生物群落結(jié)構(gòu)通常與土壤固氮速率密切相關(guān)[24-25]。綜上所述,不同施肥模式下驅(qū)動(dòng)固氮過(guò)程的關(guān)鍵理化因子及微生物還有待進(jìn)一步探索[26]。

青稞(Hordeum vulgareL.)是西藏高原主要的糧食作物,其播種面積和產(chǎn)量分別占西藏糧食作物總播種面積和總產(chǎn)量的75.3%和76.3%。因此,維持青稞高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)是實(shí)現(xiàn)西藏糧食安全的重要保障。施肥是提高作物產(chǎn)量的重要途徑,長(zhǎng)期定位試驗(yàn)表明化肥對(duì)我國(guó)糧食產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率高達(dá)40%左右[27]。但近20年來(lái),隨著我國(guó)化肥用量的高速增長(zhǎng),化肥利用率卻始終不高[28]。另一方面,我國(guó)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó),有機(jī)肥料資源豐富,基礎(chǔ)資源實(shí)物量每年約57億t,但有機(jī)肥料資源利用率也較低[29]。養(yǎng)分資源的不合理和不充分利用會(huì)引發(fā)一系列生態(tài)環(huán)境問(wèn)題,如土壤酸化退化、地下水硝酸鹽污染和溫室氣體增排等[30]。西藏作為青藏高原的主體,具有海拔高、紫外線強(qiáng)和低溫干旱的氣候特點(diǎn),是典型的生態(tài)脆弱區(qū)[31]和氣候變化敏感區(qū)[32]。然而不同施肥模式對(duì)西藏高原青稞田土壤固氮速率和固氮微生物影響的報(bào)道還較少見。因此,本研究的目的是明確合理的施肥模式,探明固氮微生物豐度、群落結(jié)構(gòu)和固氮活性對(duì)不同施肥模式的響應(yīng)。這對(duì)減施氮肥,保護(hù)青藏高原生態(tài)環(huán)境,促進(jìn)西藏高原農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展具有至關(guān)重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本研究在西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院4號(hào)試驗(yàn)地長(zhǎng)期肥料定位試驗(yàn)田進(jìn)行。試驗(yàn)地位于西藏自治區(qū)拉薩市(29°38＇N,91°02＇E),海拔3662 m,屬高原溫帶半干旱季風(fēng)氣候,年降水量200～510 mm,集中在6-9月,年均氣溫7.4 ℃,年無(wú)霜期100～120 d,全年日照3000 h以上。試驗(yàn)地在2017年進(jìn)行改造,小區(qū)間用1 m高水泥隔離層隔開,防止小區(qū)間土壤養(yǎng)分和水分滲透。耕層土壤來(lái)源于拉薩周邊自然農(nóng)田,土層厚度60 cm。試驗(yàn)開始于2018年,前茬作物為青稞,土壤類型為沙壤土。供試青稞品種為‘藏青2000’,播種密度為225 kg·hm-2。試驗(yàn)開始前土壤(0～20 cm)基礎(chǔ)理化性質(zhì)如下:有機(jī)碳11.6 g·kg-1、全氮1.20 g·kg-1、全磷0.90 g·kg-1、全鉀22.7 g·kg-1、堿解氮82.2 mg·kg-1、有效磷48.1 mg·kg-1、速效鉀96.3 mg·kg-1、pH 8.07(水土比=2.5∶1)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理

田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),共設(shè)6個(gè)處理,分別為:1)撂荒(CK0); 2)不施肥(CK); 3)施氮磷鉀化肥(F); 4)單施羊糞(M); 5)氮磷鉀化肥+羊糞(FM);6)氮磷鉀化肥+秸稈(FS)。小區(qū)面積為20 m2,每個(gè)處理4次重復(fù)。各施肥處理養(yǎng)分投入量如下:F處理化肥N、P2O5和K2O養(yǎng)分投入量分別為90 kg·hm-2、76 kg·hm-2和45 kg·hm-2; M處理羊糞投入量為5 t·hm-2;FM處理化肥N、P2O5和K2O養(yǎng)分投入量分別為60 kg·hm-2、50.1 kg·hm-2和30 kg·hm-2,羊糞投入量為1.67 t·hm-2; FS處理化肥N、P2O5和K2O養(yǎng)分投入量分別為90 kg·hm-2、76 kg·hm-2和45 kg·hm-2,秸稈投入量為150 kg·hm-2。氮肥為尿素(N 46%),磷肥為磷酸二銨(N 18%,P2O546%),鉀肥為氯化鉀(K2O 60%)。有機(jī)肥為腐熟羊糞,秸稈為上一年生產(chǎn)的青稞秸稈。秸稈(粉碎長(zhǎng)約3～5 cm)和羊糞作基肥于播種前一年冬灌前撒施、翻耕。其中,秸稈含全碳315.6 g·kg-1,全氮4.56 g·kg-1,全磷2.01 g·kg-1,全鉀12.2 g·kg-1,C/N=69.2; 羊糞含全碳292.1 g·kg-1,全氮16.8 g·kg-1,全磷3.66 g·kg-1,全鉀5.08 g·kg-1,C/N=17.4。磷酸二銨和氯化鉀作基肥一次性施入。尿素作基肥、分蘗肥和拔節(jié)肥分3次施入。青稞于每年4月中下旬播種,8月中下旬收獲。本次研究選擇除撂荒處理的其余5個(gè)處理(隨機(jī)選擇3個(gè)重復(fù))進(jìn)行分析。

1.3 土壤樣品采集

于2019年8月,青稞收獲后以“S”型多點(diǎn)混合法,采集各小區(qū)耕層(0～20 cm)土壤樣品。隨后將土壤樣品放入冷藏箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室,過(guò)2 mm篩去除碎石和植物碎屑進(jìn)行后續(xù)分析。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

參照鮑士旦[33]的《土壤農(nóng)化分析》方法,采用硫酸-重鉻酸鉀氧化法測(cè)定土壤有機(jī)碳含量; 采用pH計(jì)測(cè)定土壤pH(水土比=2.5∶1); 采用凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮含量; 采用0.5 mol·L-1碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤有效磷含量; 采用1 mol·L-1中性醋酸銨浸提-火焰光度計(jì)法測(cè)定土壤速效鉀含量; 采用105 ℃烘干-稱重法測(cè)定土壤含水量; 采用0.01 mol·L-1氯化鈣浸提(1∶10,w/v),AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)定土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。

1.4.2 土壤潛在固氮速率的測(cè)定

根據(jù)Hsu等[24]的操作步驟,采用15N標(biāo)記法測(cè)定土壤潛在固氮速率,并稍作改動(dòng)。具體方法如下:將2 g新鮮土樣放入12 mL密封頂空瓶(Exetainer;Labco Ltd.,Lampeter,Ceredigion,UK)中,調(diào)節(jié)土壤含水量為田間持水量的70%。將瓶?jī)?nèi)空氣抽真空,并用20% O2(v/v)和80% N2(v/v)填充(15N豐度99%,上海穩(wěn)定性同位素工程技術(shù)研究中心),混合均勻,每個(gè)樣品重復(fù)3次。未作標(biāo)記的N2做平行對(duì)照。樣品在黑暗條件下室溫培養(yǎng)22 d[18]。培養(yǎng)結(jié)束后,將土壤樣品凍干并研磨過(guò)0.15 mm篩,通過(guò)元素分析儀-同位素比值質(zhì)譜儀(EA-IRMS)(Vario Isotope Cube-Isoprime; Elementar,Langenselbold,Hesse,Germany)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定土壤全氮含量和15N豐度。根據(jù)標(biāo)記樣品和未標(biāo)記樣品全氮15N含量之差,除以培養(yǎng)時(shí)間,計(jì)算土壤潛在固氮速率[potential nitrogen fixation rate,PNFR,μg(N)·kg-1·d-1]。

1.4.3 DNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

稱取0.25 g土壤樣品,利用MoBio PowerSoilTMDNA Isolation Kits(MO BIO Laboratories Inc.,Carlsbad,CA,USA)試劑盒,按照操作說(shuō)明提取土壤總DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量,用Nanodrop分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)測(cè)定DNA的濃度。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定nifH基因拷貝數(shù)。定量PCR在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,California,USA)上進(jìn)行。選用引物nifH-F和nifH-R擴(kuò)增固氮微生物nifH基因[34],PCR反應(yīng)體系如下:2×Taq Plus Master Mix 10 μL,10 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,再用超純水(ddH2O)補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件如下:95 ℃,30 s; 40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃,5 s;60 ℃,40 s)。根據(jù)Poly等[35]方法,獲得含有nifH基因的重組質(zhì)粒。以質(zhì)粒10倍梯度稀釋濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),定量PCR反映的循環(huán)數(shù)(Ct值)為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。溶解曲線總是出現(xiàn)單峰,擴(kuò)增效率為90.6%,R2=0.999。

1.4.4 高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析

固氮微生物nifH基因采用nifH-F和nifH-R引物擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系:5×ExTaq緩沖液5.0 μL,2.5 μmol·L-1dNTPs 2 μL,上、下游引物各1.0 μL(10 μmol·L-1),DNA模板2 μL,ExTaq(5 U·μL-1)0.25 μL,超純水(ddH2O)補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 預(yù)變性5 min,94 ℃ 變性30 s,58 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸60 s,循環(huán)32次,循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 保持7 min,4 ℃ 條件下結(jié)束。為了區(qū)分樣品,擴(kuò)增時(shí)在每個(gè)樣品的上游引物5＇端,添加長(zhǎng)度為8個(gè)堿基的特異性堿基序列(barcode)。將擴(kuò)增的nifH基因PCR產(chǎn)物經(jīng)AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)純化后,使用Quanti-Fluor?-ST(Promega,USA)藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)測(cè)定濃度,用Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序分析。測(cè)序由北京奧維森科技有限公司完成。測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所BIG數(shù)據(jù)中心的基因組序列檔案庫(kù)(Genome Sequence Archive,GSA)(https://bigd.big.ac.cn/gsa/),編號(hào)CRA004010。

原始數(shù)據(jù)下機(jī)后,采用Pear(v0.9.6)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾和優(yōu)質(zhì)序列拼接,得到有效數(shù)據(jù)。具體參數(shù)如下:1)去除打分值低于20,含有模糊堿基,引物錯(cuò)配序列; 2)根據(jù)PE的overlap關(guān)系對(duì)兩端序列進(jìn)行拼接(merge)處理,最小overlap設(shè)置10 bp,錯(cuò)配率為0.1,得到Fasta序列; 3)使用自比對(duì)(denovo)方法去除Fasta序列的嵌合體,同時(shí)去除不合要求的短序列。用Vsearch(v2.7.1)軟件按照97%相似性將全部序列聚類,去除singleton的OTU,得到代表性序列和OTU表。采用blast算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,比對(duì)nt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),并在各個(gè)水平注釋群落物種信息。應(yīng)用Mothur(v.1.34.4)軟件,按照樣本最小序列抽平并進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。利用SPSS軟件(Version 24.0,IBM,USA)通過(guò)單因素方差分析(one-way ANOVA)和鄧肯(Duncan)多重比較法檢驗(yàn)不同處理間土壤理化性質(zhì)、固氮微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)相對(duì)豐度的差異顯著性(LSD,α= 0.05)。利用R軟件(Version 4.0.3)進(jìn)行如下分析:采用“corrplot”包計(jì)算固氮微生物豐度、群落組成和土壤理化性質(zhì)之間的Spearman相關(guān)關(guān)系; 基于Bray-Curtis距離,通過(guò)主坐標(biāo)分析(Principal Coordinate Analysis,PCoA)并結(jié)合置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA),檢驗(yàn)不同處理間微生物群落結(jié)構(gòu)是否存在顯著差異(“Vegan”包); 通過(guò)典范對(duì)應(yīng)分析(Canonical Correlation Analysis,CCA)與蒙特卡洛置換檢驗(yàn)(Monte Carlo Permutation test)相結(jié)合,揭示固氮微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子(膨脹因子,VIF ＜ 10)的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥模式下土壤理化性質(zhì)的變化

不同施肥模式顯著改變了青稞田土壤理化性質(zhì)(表1)。不同施肥模式下土壤有機(jī)碳和全氮含量由高到低,表現(xiàn)為:M＞FM＞FS＞F＞CK。與CK處理相比,施用有機(jī)肥的處理(M、FM和FS)顯著提高了土壤有機(jī)碳和全氮含量(P＜0.05),且不同有機(jī)肥處理之間也存在顯著性差異(P＜0.05)。不同施肥模式土壤C/N為9.50～10.22,其中M處理下土壤C/N最高,CK處理下土壤C/N最低。土壤含水量在M處理下最高(14.30%),CK處理下最低(12.17%); 與CK處理相比,施肥處理顯著提高了土壤含水量。銨態(tài)氮含量由高到低,表現(xiàn)為:FM＞FS＞M＞CK＞F; 與CK處理相比,有機(jī)無(wú)機(jī)肥料配施處理(FM和FS)顯著提高了土壤銨態(tài)氮含量(P＜0.05)。 硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量由高到低,均表現(xiàn)為:M＞FM＞F＞FS＞CK,與CK處理相比,施肥處理顯著提高了上述養(yǎng)分指標(biāo)的含量。pH變化范圍在8.10～8.44,與CK處理相比,施肥處理顯著降低了土壤pH。

2.2 不同施肥模式下土壤固氮微生物豐度和潛在固氮速率的變化

不同施肥模式顯著改變了固氮微生物豐度和土壤潛在固氮速率(圖1)。結(jié)果表明,不同施肥處理下固氮微生物豐度變化范圍為4.33×106～8.65×106copies·g-1(soil),各處理固氮微生物豐度由高到低表現(xiàn)為:M＞FM＞CK＞F＞FS,且不同施肥處理間固氮微生物豐度存在顯著性(P＜0.05)差異; 而土壤潛在固氮速率在CK處理下最高(4.07 μg·kg-1·d-1),FS處理下最低(2.63 μg·kg-1·d-1)。與CK處理相比,施肥尤其是施用有機(jī)肥處理(M、FM和FS)顯著降低了土壤潛在固氮速率(P＜0.05)。

2.3 土壤理化性質(zhì)與固氮微生物豐度和潛在固氮速率之間的關(guān)系

固氮微生物豐度和潛在固氮速率對(duì)土壤理化性質(zhì)響應(yīng)不同(圖2A)。Spearman相關(guān)性分析表明,固氮微生物豐度與土壤有機(jī)碳(r=0.589)、全氮(r=0.688)、硝態(tài)氮(r=0.614)和速效鉀(r=0.661)顯著正相關(guān)(P＜0.05); 潛在固氮速率與pH(r=0.682)顯著正相關(guān)(P＜0.05),而與銨態(tài)氮(r=-0.743)、硝態(tài)氮(r=-0.475)和有效磷(r=-0.325)顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。逐步回歸分析進(jìn)一步表明,全氮和銨態(tài)氮分別是顯著影響和最佳解釋固氮微生物豐度和潛在固氮速率的環(huán)境因子(圖2B-2C)。

2.4 不同施肥模式下土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

不同施肥模式改變了固氮微生物綱和屬水平的組成(圖3A和3B)。在綱(class)水平,不同施肥處理下,α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,3.2%～8.8%)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria,24.5%～61.0%)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria,1.9%～13.4%)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria,1.2%～19.9%)和豐佑菌綱(Opitutae,0.5%～5.2%)為青稞田土壤固氮菌優(yōu)勢(shì)綱(相對(duì)豐度＞1%)。與CK處理相比,F處理顯著(P＜0.05)降低了豐佑菌綱的相對(duì)豐度,增加了未分類綱(Unidentified)的相對(duì)豐度; M處理顯著降低了豐佑菌綱和β-變形菌綱的相對(duì)豐度,增加了α-變形菌綱、γ-變形菌綱和未分類綱的相對(duì)豐度; FM處理顯著降低豐佑菌綱的豐度; 而FS處理與CK處理間,固氮微生物群落組成無(wú)顯著性差異(圖3A)。

在屬(genus)水平,不同施肥處理下,假食酸菌屬(Pseudacidovorax,9.4%～25.4%)、固氮弧菌屬(Azoarcus,0.8%～15.6%)、地桿菌屬(Geobacter,1.5%～12.9%)、紅長(zhǎng)命菌屬(Rubrivivax,3.1%～8.3%)、貪噬菌屬(Variovorax,0.6%～4.0%)、Azohydromonas(3.5%～9.4%)、動(dòng)膠菌屬(Zoogloea,0.9%～9.9%)、脫氮單孢菌屬(Dechloromonas,0.4%～2.6%)、念珠藻屬(Nostoc,1.2%～8.2%)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium,1.3%～5.2%)、魚腥藻屬(Anabaena,0.9%～6.1%)、固氮螺菌屬(Azospirillum,0.8%～1.8%)、Skermanella(0.6%～1.7%)和甲基細(xì)菌屬(Methylobacter,0.3%～18.1%)為青稞田土壤固氮菌優(yōu)勢(shì)屬(相對(duì)豐度＞1%)。與CK處理相比,F處理顯著(P＜0.05)降低了固氮弧菌屬的相對(duì)豐度,增加了固氮螺菌屬和未分類屬的相對(duì)豐度; M處理顯著降低了固氮弧菌屬和脫氮單胞菌屬的相對(duì)豐度,增加了慢生根瘤菌屬和甲基細(xì)菌屬的相對(duì)豐度;而FM和FS處理顯著降低了固氮弧菌屬相對(duì)豐度(圖3B)。

主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示,第1軸和第2軸分別解釋了固氮微生物群落方差總變異的35.23%和22.54%。不同施肥模式可大致聚為3類,分別是CK、M和施用化肥的處理(F、FM和FS)。置換多元方差分析(PERMANOVA)表明不同施肥模式顯著改變了固氮微生物群落結(jié)構(gòu)(R2=0.461,P=0.001)(圖4)。

2.5 土壤理化性質(zhì)與固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系

固氮微生物綱水平群落組成和土壤理化性質(zhì)間的相關(guān)性分析表明,α-變形菌綱與硝態(tài)氮、速效鉀和土壤含水量顯著正相關(guān)(P＜0.05); β-變形菌綱與土壤C/N(P＜0.01)和含水量(P＜0.01)及速效鉀(P＜0.05)顯著負(fù)相關(guān); γ-變形菌綱與土壤有機(jī)碳、全氮、C/N、硝態(tài)氮、有效磷、速效鉀和含水量顯著正相關(guān)(P＜0.01); δ-變形菌綱與速效鉀(P＜0.05)和含水量(P＜0.01)顯著負(fù)相關(guān); 而豐佑菌綱與土壤C/N(P＜0.05)、硝態(tài)氮(P＜0.05)、有效磷(P＜0.05)、速效鉀(P＜0.01)和含水量(P＜0.01)顯著負(fù)相關(guān)(表2)。

表2 土壤理化性質(zhì)與固氮菌優(yōu)勢(shì)綱相對(duì)豐度之間的相關(guān)性分析Table 2 Spearman correlation between relative abundance of dominated class of diazotroph and soil physicochemical properties

屬水平上,多數(shù)固氮微生物相對(duì)豐度與土壤含水量和碳氮比顯著相關(guān)(P＜0.05或P＜0.01)(表3)。如地桿菌屬、固氮弧菌屬、假食酸菌屬和脫氮單胞菌屬與土壤含水量顯著負(fù)相關(guān),而念珠藻屬、慢生根瘤菌屬、魚腥藻屬、固氮螺菌屬、甲基細(xì)菌屬和Skermanella屬則相反; 固氮弧菌屬、假食酸菌屬和動(dòng)膠菌屬與土壤C/N顯著負(fù)相關(guān),而念珠藻屬、魚腥藻屬、固氮螺菌屬和甲基細(xì)菌屬則與土壤C/N顯著正相關(guān)。此外,有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀均與不同的固氮菌優(yōu)勢(shì)屬存在顯著相關(guān)關(guān)系。

表3 土壤理化性質(zhì)與固氮菌優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度之間的相關(guān)性分析Table 3 Spearman correlation between relative abundance of dominated genera of diazotroph and soil physicochemical properties

通過(guò)典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)與蒙特卡洛置換檢驗(yàn)相結(jié)合,進(jìn)一步揭示影響固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵理化因子(圖5)。結(jié)果表明,有效磷(R2=0.895,P=0.001)是顯著影響青稞田土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的首要因子,其次是pH(R2=0.658,P=0.008)和土壤C/N(R2=0.515,P=0.012)。

3 討論

3.1 不同施肥模式對(duì)固氮微生物豐度的影響

施肥可通過(guò)改變土壤養(yǎng)分含量和有效性而影響固氮微生物豐度[36-37]。通過(guò)2年的田間試驗(yàn),本研究發(fā)現(xiàn)單施化肥或化肥配施秸稈會(huì)顯著降低青稞田土壤nifH基因豐度,而單施羊糞或化肥配施羊糞則相反。這與前人的研究結(jié)果類似,即長(zhǎng)期化肥NPK配施[36]或稻草還田[37]會(huì)抑制土壤固氮微生物豐度,而增施禽畜糞便則有利于氮循環(huán)基因豐度的增加[38]。但也有研究表明,稻草還田和化肥NPK配施可顯著增加nifH基因豐度[22,39],而施用糞肥(豬糞)會(huì)抑制固氮微生物的生長(zhǎng)[15]。上述研究結(jié)果的不一致性,可能是由于固氮微生物易受氣候因子、作物類型和土壤性質(zhì)等多重環(huán)境因素的影響[9]。通過(guò)對(duì)土壤理化性質(zhì)的進(jìn)一步分析,我們發(fā)現(xiàn)全氮與固氮微生物豐度顯著(P＜0.05)正相關(guān),且是影響固氮微生物豐度的主要因子(圖2A,2B)。而相比于單施化肥或化肥配施秸稈處理,施用羊糞顯著(P＜0.05)提高了土壤全氮含量(表1)。上述發(fā)現(xiàn)解釋了本研究中羊糞對(duì)土壤nifH基因豐度的影響不同于秸稈或化肥的原因。Han等[9]通過(guò)對(duì)3種不同土壤類型農(nóng)田固氮微生物豐度和多樣性的研究也發(fā)現(xiàn),土壤理化性質(zhì)中全氮含量與nifH基因豐度相關(guān)性最強(qiáng)。這可能是由于全氮含量高的土壤能夠維持植物更好地生長(zhǎng),使植物根際分泌更多的碳底物促進(jìn)固氮微生物生長(zhǎng),因?yàn)楣痰⑸锔叨纫蕾囉谔嫉目衫眯訹3]。

3.2 不同施肥模式對(duì)固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

眾多研究表明,固氮微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)不同施肥模式反應(yīng)敏感[10,19]。這與本研究結(jié)果一致,即不同施肥模式下固氮微生物群落結(jié)構(gòu)相似性大致可以分為3類,分別為CK,M以及F、FM和FS(圖4),這可能是由于不同施肥模式下土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變引起的。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),有效磷是顯著影響青稞田土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子(圖5)。Xiao等[23]和Hu等[14]分別通過(guò)對(duì)喀斯特地貌草原區(qū)及東北黑土的施肥試驗(yàn)均表明,磷對(duì)固氮微生物群落多樣性和組成影響最大。這可能是因?yàn)?1)生物固氮是一個(gè)非常耗能的過(guò)程,每固定1分子N2需要消耗約16分子的ATP,而磷是ATP的重要組成成分[40]。因此,磷在調(diào)控固氮微生物生長(zhǎng)、群落組成和功能發(fā)揮中起著重要作用[22,41]。2)磷的有效性可以強(qiáng)烈影響固氮微生物群落之間的相互作用關(guān)系[23]。除有效磷外,我們發(fā)現(xiàn)pH和土壤C/N也能夠顯著影響固氮微生物群落結(jié)構(gòu),這與王磊等[17]和Yang等[37]的研究結(jié)果類似。這可能是由于pH和土壤C/N在調(diào)控固氮微生物群落組裝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[42-43]。

本研究發(fā)現(xiàn)歸屬于變形菌門的α-變形菌綱、β-變形菌綱、δ-變形菌綱和γ-變形菌綱及歸屬于疣微菌門的豐佑菌綱是分布于青稞田土壤的主要固氮微生物類群(圖3)。這與前人對(duì)旱地非豆科作物內(nèi)生固氮菌或土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的研究相一致[44-46]。另外,我們還發(fā)現(xiàn)土壤速效養(yǎng)分(硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀)含量與豐佑菌綱相對(duì)豐度顯著負(fù)相關(guān)(表2)。歸類于疣微菌門的微生物通常屬于寡營(yíng)養(yǎng)菌[47],而施肥,尤其是化肥或羊糞,會(huì)顯著提高土壤速效養(yǎng)分含量(表1),這也很好地解釋了為什么施肥會(huì)降低豐佑菌綱相對(duì)豐度(圖3A); 在屬水平,假食酸菌屬在固氮菌優(yōu)勢(shì)屬中的相對(duì)豐度最高(圖3B),這可能意味著假食酸菌屬在青稞田土壤中發(fā)揮著重要的固氮作用。這個(gè)推測(cè)被前人研究所證實(shí),即假食酸菌屬是活躍的固氮微生物類群,在土壤、植物和水環(huán)境中廣泛存在[48-49]。另外,不同施肥模式也顯著改變了屬水平固氮微生物相對(duì)豐度(圖3B)。如單施化肥或化肥配施羊糞或秸稈,會(huì)顯著(P＜0.05)降低固氮弧菌屬的相對(duì)豐度。前人研究表明,固氮弧菌屬主要分為根系附生菌或內(nèi)生菌和土傳菌株兩大生態(tài)類群[50],且該屬與土壤有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量顯著負(fù)相關(guān)[17],這與本研究的結(jié)果一致(表3),說(shuō)明固氮弧菌屬可能更適合在貧營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中生存。除此之外,單施化肥能夠顯著(P＜0.05)增加固氮螺菌屬相對(duì)豐度,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這可能與單施化肥增加土壤C/N有關(guān),因?yàn)楣痰菥鷮傧鄬?duì)豐度與土壤C/N顯著正相關(guān)。固氮螺菌屬碳、氮代謝途徑廣泛,使其在根際養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)中具有巨大優(yōu)勢(shì)[51]。上述結(jié)果意味著固氮螺菌屬傾向于生長(zhǎng)在高碳、低氮的環(huán)境中; 而單施羊糞則會(huì)顯著降低脫氮單胞菌屬相對(duì)豐度,增加慢生根瘤菌屬和甲基桿菌屬的相對(duì)豐度。低氮條件下生長(zhǎng)的植物根內(nèi)會(huì)富集脫氮單胞菌屬物種[52],這也證實(shí)了我們的研究結(jié)果,即脫氮單胞菌屬相對(duì)豐度與全氮和硝態(tài)氮顯著負(fù)相關(guān)。單施羊糞處理土壤有機(jī)碳、全氮、硝態(tài)氮和速效鉀含量顯著增加,可能是導(dǎo)致慢生根瘤菌屬相對(duì)豐度增加的原因(表1,表3)。但也有研究表明,慢生根瘤菌屬與土壤有效磷和C/N顯著相關(guān)[37]。盡管共生和非共生的慢生根瘤菌在土壤中普遍存在[19,53-54],但對(duì)調(diào)控慢生根瘤菌屬豐度的關(guān)鍵環(huán)境因子還需進(jìn)一步探究。甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物在不同環(huán)境中分布廣泛,具有固氮、生產(chǎn)植物激素及溶磷、鉀和鋅等多種功能[55]。本研究也發(fā)現(xiàn)甲基細(xì)菌屬與全碳、全氮、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀顯著正相關(guān),而單施羊糞顯著提高了上述土壤養(yǎng)分含量,這很好解釋了單施羊糞顯著增加甲基細(xì)菌屬相對(duì)豐度的原因。

3.3 不同施肥模式對(duì)潛在固氮速率的影響

弄清不同施肥模式下土壤固氮速率對(duì)于預(yù)測(cè)人為活動(dòng)和氣候變化下的土壤氮循環(huán)十分重要。本研究中,不同施肥模式下青稞田土壤固氮速率為2.63～4.07 μg·kg-1·d-1,低于Liao等[19]測(cè)定的不同施肥模式下稻田土壤固氮速率14.6～118 μg·kg-1·d-1。這是由于盡管自生固氮微生物(專性厭氧菌、兼性厭氧菌或?qū)Ｐ院醚蹙?可在多種O2梯度的環(huán)境中進(jìn)行固氮,但固氮酶對(duì)O2非常敏感,通常催化反應(yīng)需要在厭氧條件下進(jìn)行。因此,稻田的厭氧環(huán)境更有利于生物固氮[26]。施肥,尤其是增施有機(jī)肥(秸稈或羊糞)會(huì)顯著降低青稞田土壤潛在固氮速率(圖1),這與Fan等[18]對(duì)40年小麥(Triticum aestivumL.)-大豆(Glycine maxL.)輪作體系下不同施肥試驗(yàn)得出的結(jié)論一致。除此之外,我們還發(fā)現(xiàn)秸稈對(duì)土壤潛在固氮速率的抑制效應(yīng)高于羊糞。通常認(rèn)為,施肥通過(guò)增加外源氮的輸入會(huì)抑制固氮微生物對(duì)大氣氮的固定[56-57],因?yàn)楣痰且粋€(gè)十分消耗能量的過(guò)程,固氮微生物會(huì)優(yōu)先利用外源氮進(jìn)行自身的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)而非固定氮[3,58]。我們的研究結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn),即銨態(tài)氮含量與潛在固氮速率顯著(P＜0.05)負(fù)相關(guān),且是調(diào)控潛在固氮速率最主要的環(huán)境因子(圖2A和2C)。前人研究也表明,銨是生物固氮的直接產(chǎn)物,可通過(guò)調(diào)節(jié)nifA基因轉(zhuǎn)錄,在遺傳水平上抑制固氮酶的合成[59],這意味著高濃度的銨可直接抑制固氮酶活性。但也有研究表明,化肥配施雞糞可顯著提高土壤固氮速率[19]。并且本研究中,雖然化肥配施秸稈模式下土壤銨態(tài)氮含量并未顯著高于施用羊糞模式,但土壤潛在固氮速率卻明顯降低。這可能與不同有機(jī)物料質(zhì)量不同有關(guān),碳底物的質(zhì)量和數(shù)量對(duì)于自生氮固定而言可能同樣重要[60]。最近的Meta分析也表明,有機(jī)碳質(zhì)量是驅(qū)動(dòng)土壤生物固氮的關(guān)鍵因素,相比于較難分解的有機(jī)碳(纖維二糖和纖維素),易分解有機(jī)碳(葡萄糖)更有利于刺激微生物固氮,而難分解有機(jī)碳(單寧和草酸)對(duì)生物固氮作用沒有顯著促進(jìn)作用[20]。研究表明,羊糞腐解速率高于秸稈[61],故其在腐解過(guò)程中能夠快速釋放易分解有機(jī)物質(zhì),進(jìn)而快速刺激微生物固氮。因此,未來(lái)除關(guān)注不同施肥模式引起的土壤養(yǎng)分變化對(duì)自生氮固定帶來(lái)的影響外,還需考慮自生氮固定對(duì)不同有機(jī)物料質(zhì)量的響應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究揭示了短期(2年)不同施肥模式會(huì)顯著影響青稞田土壤固氮微生物豐度、群落結(jié)構(gòu)和潛在固氮速率。單施羊糞或化肥配施羊糞可顯著提高固氮微生物豐度,而單施化肥或化肥配施秸稈則相反。施肥會(huì)降低土壤潛在固氮速率,增施有機(jī)肥(羊糞或秸稈)則明顯加強(qiáng)了抑制效應(yīng)。土壤理化性質(zhì)中,全氮和銨態(tài)氮分別是顯著影響和最佳解釋固氮微生物豐度和潛在固氮速率的關(guān)鍵因子。施肥引起的土壤有效磷、pH和C/N變化,是調(diào)控固氮微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要因子。不同施肥模式中,單施羊糞是提高青稞田土壤肥力,增加固氮微生物豐度,降低固氮速率下降的最佳施肥模式。另外,本研究中我們還發(fā)現(xiàn),不同有機(jī)物料質(zhì)量可能也會(huì)對(duì)自生固氮產(chǎn)生較大影響,因此下一步研究將著重考慮上述影響因素。